Teil 2: Echinacosid schützt vor MPP+-induzierter neuronaler Apoptose über ROS / ATF3 / CHOP-Signalwegregulation

EchinacosidSchützt vor MPP+-induzierter neuronaler Apoptose über ROS/ATF3/CHOP-Signalwegregulation

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

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Cistanche Echinacosidhat antioxidative Eigenschaften

Immunfluoreszenz-Färbung

1 mmol/L MPP?, 40 LG/mL ECH oder eine Kombination aus MPP? und ECH. Die Zellen wurden dann in einem Sperrpuffer (3% BSA in PBS) bei Raumtemperatur (RT) für 30 min inkubiert. Dann wurden Anti-ATF3-, Anti-CHOP- oder Anti-Cleaved-Caspase-3-Antikörper im Blockpuffer auf 1:100 verdünnt (1% BSA in PBS mit 0,3% Triton X-100) und über Nacht bei 4C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit Alexa 488-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Life Technologies, Carlsbad, CA) bei RT für

1 Std. Kerne wurden mit Hoechst 33342 gebeizt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen (Leica SP8, Wetzlar, Deutschland).

Terminal Desoxynukleotidyl Transferase-vermittelter dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) Assay

Wir haben jeden 10. koronalen Abschnitt (insgesamt 14-15) durch die SNc von Bregma -2,92 nm auf -3,64 mm gefärbt.

Vier typische Abschnitte durch die SNc auf dem gleichen Niveau in jeder Gruppe wurden für TH- und TUNEL-Zählungen verwendet [10]. TUNEL-Assays wurden zur Analyse der Apoptose in Gewebeschnitten mit einem In-situ-Zelltod-Detektionskit (Roche, Rotkreuz, Schweiz) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Nach der DNA-Markierung wurden Abschnitte für die Immunfluoreszenzfärbung mit Anti-TH-Antikörpern verwendet und Bilder mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen (Leica SP8, Wetzlar, Deutschland). Nach Abgrenzung des SNc bei geringer Vergrößerung (10 9 Objektive) nach dem Hirnatlas der Maus [20] wurden die TH-positiven Zellen und TH/TUNEL-Doppelpositivzellen bei einer höheren Vergrößerung (20 9 Ziele) von zwei Beobachtern, die für die Behandlung blind waren, gezählt. Das Verhältnis von TH/TUNEL doppelt positiven Zellen zu TH-positiven Zellen wurde berechnet.

CistancheEchinacosid hatentzündungshemmendEigenschaften

Statistische Analyse

Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Einweg-ANOVA, gefolgt von einer Post-hoc-Analyse mit Tukeys HSD und dem Student-Newman-Keuls-Mehrfachvergleichstest, wurden für statistische Zwecke durchgeführt. Ein Wert von P \ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Befund

ECH senkt ROS-Produkte und dämpft

MPP1-induzierte Apoptose

Es wurde gezeigt, dass ECH Neuronen in Tiermodellen vor Apoptose schützt und den Gehalt an proinflammatorischen Zytokinen in Neuroblastomzellen reduziert [12]. Es bleibt jedoch unklar, ob ECH die durch MPP induzierte neuronale Apoptose direkt moduliert?. Unsere Daten zeigten, dass ECH die Proliferation oder den Tod von SH-SY5Y-Zellen nicht beeinflusste (Abb. 1B) und ihre Morphologie unverändert blieb (Abb. 1C). Interessanterweise erhöhte sich nach der Exposition von SH-SY5Y-Zellen bei MPP? das Überleben nach einer EKH-Behandlung dosisabhängig (10–40 lg/ml) (Abb. 1B, C).

Frühere Studien haben gezeigt, dass MPP? hemmt spezifisch die Elektronentransportkette in Mitochondrien und ist auch mit der ROS-Erzeugung assoziiert [6, 21]. Unter Verwendung von DCFH-DA als fluoreszierende Sonde zur Beurteilung von Änderungen der ROS-Werte fanden wir heraus, dass ECH die MPP?-induzierte ROS-Generierung deutlich unterdrückte (Abb. 2A). Die konfokale Mikroskopie ergab, dass die erniedrigten ROS-Produkte mit ECH-Spiegeln assoziiert waren (Abb. 2C). Es wurde auch gezeigt, dass ECH die Zellmembran vor ROS schützt und den MDA-Spiegel, das Endprodukt der Lipidperoxidation, senkt (Abb. 2B). Zusammengenommen

ECH fördert das Zellüberleben durch Verringerung der MPP?-induzierten ROS-Produkte in Neuronen.

ECH unterdrückt ROS-Stress-bezogene/MPP1-induzierte Genexpression und erhöht GDNF

Expression in MPP1-behandelten Zellen

Es wurde gezeigt, dass ROS-Produkte die entfaltete Proteinreaktion stimulieren und die Expression von stressbedingten Genen induzieren, einschließlich ATF3, ATF4 und CHOP [22]. ATF3 und CHOP spielen eine besonders wichtige Rolle bei der stressinduzierten neuronalen Apoptose [9, 23]. Eine abnormale a-Synuclein-Expression ist auch einer der kritischen Marker in der PD-Pathologie [2]. Mit Hilfe der qRT-PCR analysierten wir die Expression von ATF3, CHOP, SNCA und dem von der Gliazelllinie abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) im MPP? Zellmodell und fand dieses MPP? die Expression von ATF3, CHOP und SNCA im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe signifikant verbessert. ECH hatte keinen Einfluss auf die Expression dieser Gene in SH-SY5Y-Zellen, die nicht mit MPP behandelt wurden?. ECH hob jedoch ihre MPP?-induzierte Expression auf (Abb. 3). Darüber hinaus MPP? unterdrückte signifikant die Expression von GDNF in SH-SY5Y-Zellen, aber ECH kehrte dieses Phänomen teilweise um (Abb. 3B).

ECH hemmt MPP1-induzierte Caspase-3-Aktivierung in SH-SY5Y-Zellen

Hohe ATF3- und CHOP-Spiegel fördern direkt die neuronale Apoptose [9, 23]. Unsere Daten zeigten, dass ECH die ATF3- und CHOP-Expression dosisabhängig hemmte (Abb. 4A). ECH blockierte auch MPP?-induzierte Caspase-3

Aktivität (Abb. 4A, B). Die Immunfluoreszenzanalyse der gespaltenen Form von Caspase-3 zeigte weiterhin, dass ECH die Expression des gespaltenen Caspase-3-Proteins in MPP?-behandelten Zellen deutlich verringerte (Abb. 4C).

ECH kehrt MPP1-induzierte ATF3- und CHOP-Akkumulation in SH-SY5Y-Zellen um

Nach der Exposition gegenüber Umweltgiften lokalisieren sich ATF3- und CHOP-Proteine im Zytoplasma und im Zellkern [24, 25], was zu Apoptose führt. Unsere Ergebnisse deuteten darauf hin, dass MPP? Die Behandlung erhöhte die ATF3- und CHOP-Expression im Zellkern, und ECH schwächte diesen Prozess effektiv ab (Abb. 5A, B). Die westliche Blotting-Analyse zeigte, dass MPP? Deutlich erhöhte die Spiegel beider Proteine im Zytoplasma und im Zellkern. Interessanterweise hat ECH die MPP aufgehoben? Effekte und unterdrückte ATF3- und CHOP-Akkumulation im Zellkern (Abb. 5C–E).

ATF3 spielt eine entscheidende Rolle bei MPP1-induzierter Apoptose in SH-SY5Y-Zellen

Es wurde gezeigt, dass ATF3 die Apoptose in SH-SY5Y-Zellen induziert [23], und die Ergebnisse der vorliegenden Studie deuten darauf hin, dass ECH die durch MPP induzierte ATF3-mRNA- und Proteinexpression signifikant unterdrückt. in diesen Zellen. Die Rolle von ATF3 bei der Apoptose und dem ECH-Schutz des Zellüberlebens blieb jedoch unklar. Also verwendeten wir kleine Haarnadel-RNA (shRNA), die für ATF3 spezifisch ist, um dies zu untersuchen und fanden keinen Unterschied in der Lebensfähigkeit zwischen der ATF3-Knockdown-Gruppe und der Kontrollgruppe unter normalen Bedingungen (Abb. 6A). ATF3-Unterdrückung oder EKH-Behandlung jedoch die durch MPP induzierten morphologischen Veränderungen signifikant gerettet hat? (Abb. 6B). Die ATF3-Knockdown-Zellen hatten nach der Exposition gegenüber MPP eine höhere Lebensfähigkeit als die Kontrollgruppe? (Abb. 6C). Die Proteinspiegel von CHOP und aktivierter Caspase-3 waren in ATF3-Knockdown-Zellen niedriger als in

in Kontrollzellen mit unspezifischer shRNA (Abb. 6C, D). Diese Daten zeigten, dass ATF3 eine entscheidende Rolle bei der MPP?-induzierten Apoptose von Neuroblastomzellen spielt. Diese Ergebnisse unterstützen also die Hypothese, dass ECH SH-SY5Y-Zellen durch Herunterregulierung des ROS/ATF3/CHOP-Signalwegs vor MPP?-induzierten Effekten schützt. Interessanterweise zeigten unsere Daten, dass ECH auch den MPP?-induzierten Anstieg der p53- und PUMA-Spiegel (p53-upregulierter Modulator der Apoptose) in SH-SY5Y-Zellen hemmte (Abb. 7).

CistancheEchinacosidhat den Effekt, dassImmunität

ECH schützt DA-Neuronen vor Apoptose

Induziert durch MPP1 in vitro oder durch MPTP in vivo

Um die Wirkung von ECH bei PD zu bestätigen, wurden primäre DA-Neuronen mit MPP behandelt? oder MPP? und ECH. Die In-vitro-Experimente zeigten, dass MPP? reduzierte signifikant die Lebensfähigkeit von DA-Neuronen und dies wurde durch ECH verhindert

(Abb. 8). Wir untersuchten weiter die Apoptose in DA-Neuronen im SNc nach verschiedenen Behandlungen bei Mäusen mit MPTP-induzierter PD und Kontrollen. In diesem Bereich wurden in der Kontrolle mehr TH-positive Neuronen gefunden als in der MPTP-Gruppe (Abb. 9A). TUNEL-Assays zeigten, dass NS und ECH keine Apoptose in DA-Neuronen im SNc induzierten, MPTP jedoch und ECH die Neuronen davor schützte (Abb. 9B, S2). Interessanterweise zeigte das westliche Blotting von Lysaten des SNc aus dem Mausmodell von PD, dass die ATF3- und CHOP-Proteinspiegel auch durch ECH gesenkt wurden (Abb. 10).

CistancheEchinacosidhat eineAnti-apoptotische Wirkung