Teil 3: Aus Cistanche Tubulosa isoliertes Echinacosid stimuliert mutmaßlich die Wachstumshormonsekretion über die Aktivierung des Ghrelin-Rezeptors

Aus Cistanche tubulosa isoliertes Echinacosid stimuliert mutmaßlich die Wachstumshormonsekretion über die Aktivierung des Ghrelin-Rezeptors

Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4,* und Jason TC Tzen 1,*

1 Graduate Institute of Biotechnology, National Chung-Hsing University, Taichung 402, Taiwan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)

2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwan; rd1@koda.com.tw

3 Abteilung für Veterinärmedizin, Nationale Chung-Hsing-Universität, Taichung 402, Taiwan; wychen@dragon.nchu.edu.tw

4 Graduate Institute of Pharmacognosy, Taipei Medical University, Taipei 110, Taiwan

* Korrespondenz: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: plus 886-4-22840328 (Durchwahl 776) (JTCT); Fax: plus 886-4-22853527 (JTCT)

Akademischer Herausgeber: Pinarosa Avato

Eingegangen: 22. Januar 2019; Angenommen: 14. Februar 2019; Veröffentlicht: 17. Februar 2019

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakt:CistancheArt, dem Ginseng der Wüste, wurden viele biologische Aktivitäten im traditionellen chinesischen Arzneibuch nachgewiesen und als Anti-Aging-Medizin verwendet. Drei Phenylethanoidglykoside—Echinacosid, Tubulosid A und Acteosid – wurden im Wasserextrakt von nachgewiesenCistanche Tubulus(Schenk) R. Wight und der Hauptbestandteil,Echinacosid, wurde weiter gereinigt.Echinacosidin einer Konzentration von mehr als 10_6 M zeigte eine signifikante Aktivität zur Stimulierung der Wachstumshormonsekretion von Rattenhypophysenzellen. Ähnlich wie beim Wachstumshormon-Releasing-Hormon -6, einem synthetischen Analogon von Ghrelin, wurde die Stimulierung der Wachstumshormonsekretion durch Echinacosid durch die [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-Substanz P gehemmt , ein inverser Agonist des Ghrelin-Rezeptors. Molecular Modeling zeigte, dass alle drei Phenylethanoidglykoside angemessen mit der Bindungstasche des Ghrelin-Rezeptors interagierten und Echinacosid eine etwas bessere Interaktion mit dem Rezeptor zeigte als Tubulosid A und Acteosid. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Phenylethanoidglykoside, insbesondere Echinacosid, aktive Bestandteile sind, die mutmaßlich für die Anti-Aging-Wirkung von C. tubulosa verantwortlich sind, und man kann davon ausgehen, dass sie sich als Nicht-Peptidyl-Analoga von Ghrelin entwickeln.

Schlüsselwörter: Zistanchetubulosa;Echinacosid; Ghrelin; Wachstumshormonsekretion;PhenylethanoidGlykoside

EchinacosidinZistanchehat viele Wirkungen

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4. Materialien und Methoden

4.1. Chemikalien und Pflanzenmaterialien

Cistanchedeserticola YC Ma wurde von einem lokalen Markt bezogen und von Dr. Nan-Hei Lin authentifiziert.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wight wurde von Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, China) erworben. Acetonitril, Ameisensäure und Methanol in HPLC-Qualität wurden von ECHO Chemical Co., Ltd. (Miaoli, Taiwan) bezogen. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), dialysiertes fötales Rinderserum (DFBS) und Trypsin-EDTA wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) gekauft. DNase I wurde von Worthington Biochemical (Lakewood, NJ, USA) gekauft. Wachstumshormon freisetzendes Hormon -6 (GHRP-6) wurde von Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA, USA) bezogen. Collagenase Typ I und [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-Substanz P wurden von Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) gekauft. Rattenwachstumshormon-ELISA-Kit wurde von Sunred Biological Technology Corporation (Shanghai, China) gekauft.

4.2. HPLC/UV- und LC_MSn-Analysen der Wasserextraktion von Cistanche spp.

Getrockneter Stiel (25 g) vonCistancheDeserticola YC Ma oderCistanchetubulosa (Schenk) R wurde dreimal mit 500 ml destilliertem Wasser für 60 min bei 50 Grad im Wasserbad extrahiert. Die Lösung wurde durch einen 13 mm Syrischen Filter mit 0,45 um PP-Membranfilter (Pall Corporation, Glen Cove, NY, USA) filtriert und den folgenden Analysen unterzogen. Die chemischen Bestandteile in den Extrakten wurden analysiert

unter Verwendung einer Syncronis C18-Säule (4,6 × 250 mm Innendurchmesser, 5 μm, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) im HPLC-System gekoppelt mit einem Modell 600E Photodiodenarray-Detektor (Waters Corporation,

Milford, MA, USA). Die mobile Phase bestand aus (A) Wasser mit {{0}},1 Prozent Ameisensäure und (B) Acetonitril. Der Elutionsgradient war wie folgt: 0–60 min, linearer Gradient von 14 Prozent B; 0–3 min, 14 % bis 17 % B; 3–4 min, 17 Prozent B; 4–15 min, 17 % bis 20 % B; 15–20 min, 20 Prozent B; 20–50 min, 20 % bis 14 % B; 50–60

min, 14 Prozent B. Die Ultraviolett(UV)-Absorptionsdetektionswellenlänge wurde auf 330 nm eingestellt. Ein Tandem-Massenspektrometer mit linearem Trap-Quadrupol (LTQ) (Thermo Electron, San Jose, CA, USA), das mit einer Elektrospray-Ionisationsschnittstelle (ESI) ausgestattet war, wurde mit einem Surveyor LC-System (Thermo Electron) verbunden.

mit einer 5-ul-Probenschleife. Der Elutionsgradient war wie folgt: 0–90 min, linearer Gradient von 14 Prozent B; 0–24 min, 14 Prozent bis 17 Prozent B; 24–25 min, 17 Prozent B; 25–36 min, 17 % bis 20 % B; 36–37 min, 20 Prozent B; 37–80 Minuten,

20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 Prozent ) als Kollisionsgas.

4.3. Isolierung von Echinacosid

Der Wasserextrakt aus dem getrockneten Stamm (25 g) von C. tubulosa wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um einen tiefbraunen Sirup zu ergeben. Die Rohextraktion wurde mit destilliertem Wasser suspendiert und durch einen Gefriertrockner lyophilisiert. Das Pulver von 100 mg wurde in 5 ml destilliertem Wasser gelöst und einer Reinigung unter Verwendung einer Sephadex LH-20-Säule (100 ml; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Schweden) unterzogen, eluiert mit 10 % wässriger Methanollösung und überwacht durch HPLC . Die Fraktionen, die Echinacosid enthielten, wurden durch Ablesen der Extinktion bei 245 nm nachgewiesen und unter Verwendung eines Autosamplers geerntet.

4.4. Tiere

Die Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der National Chung_Hsing University mit der Genehmigungsnummer IACUC 106-079 genehmigt. Männliche Sprague_Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250_300 g wurden von BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan) bezogen. Zwei Tiere pro Käfig wurden in einer kontrollierten Umgebung von 23 02, 60 bis 10 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Die Ratten wurden mit einer Standard-Chow-Diät gefüttert (Kalorien angegeben

durch 28,7 Prozent Protein, 13,4 Prozent Fett und 57,9 Prozent Kohlenhydrate, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, USA) und destilliertes Wasser nach Belieben.

4.5. Primäre Hypophysenzellkultur

Hypophysenzellen wurden nach einem modifizierten enzymatischen Dispersionsverfahren isoliert, das von Yamazaki et al. [29]. Kurz gesagt, männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden mit Zoletil 50 (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, Frankreich) anästhesiert, und die vorderen Hypophysen wurden entfernt und dispergiert, um Hypophysenzellen in Suspension zu kultivieren, wie zuvor beschrieben [30].

4.6. Wachstumshormonsekretionsassay

Die primären Hypophysenvorderlappenzellen mit 4 × 104 Zellen/Vertiefung wurden bei 37 Grad unter 5 Prozent CO2 für 2 Tage vor dem Wachstumshormonsekretionsassay gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll kultiviert [30].

Nach der Entfernung des Kulturmediums wurden die Zellen in serumfreiem Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) für 90 min ausgehungert, um die basale Hormonsekretion zu stabilisieren. Das Hungermedium wurde durch frisches DMEM ersetzt, das Echinacosid (von 10_8 bis 10_5 M) oder GHRP -6 (ein Agonist eines menschlichen Ghrelin-Rezeptors, GHSR, 10_7 M) enthielt. als positive Kontrolle, und die Zellen wurden für 15 und 30 Minuten bei 37 Grad unter 5 Prozent CO2 inkubiert. Zum Nachweis der antagonistischen Wirkung wurden die Zellen mit einem GHSR inkubiert

inverser Agonist, [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-Substanz P (0,5 uM), und dann behandelt mit DMEM, enthaltend Echinacosid (10_5 M) oder GHRP-6 (10_7 M) für 30 min. Das Medium wurde für gesammelt

Bestimmung der Wachstumshormonsekretion durch einen Ratten-Wachstumshormon-ELISA-Kit (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).

4.7. Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwerte o SD dargestellt. Die Unterschiede wurden mittels T-Test analysiert. Statistische Berechnungen wurden mit GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Ein Wert von p < 0,05="" wurde="" als="" statistisch="" signifikant="">

4.8. Homologiemodellierung und Docking

Die Homologiemodellierung und das Andocken an einen menschlichen Ghrelin-Rezeptor, Wachstumshormon-Sekretagogen-Rezeptor (GHSR, Zugangsnummer AAI13548), wurde durch Befolgen unserer vorherigen Konstruktion etabliert [21, 24]. Kurz gesagt, Kristallstrukturen von 1 und 2 adrenergen Rezeptoren (PDB 2YCY und 3PDS) mit gebundenen Liganden, Cyanopindolol und FAUC50 wurden als Template verwendet, um die GHSR-Struktur zu konstruieren [31,32]. Die GHSR-Struktur mit der niedrigsten PDF-Gesamtenergie wurde für das weitere Docking mit GHRP-6, Echinacosid, Tubulosid A und Acteosid ausgewählt. Alle Modellierungsprozesse wurden unter Verwendung der Plattform Discovery Studio 2.1 (http://accelrys.com/) durchgeführt.

Die 3D-Struktur von GHRP-6 wurde von der Pub-Chem-Verbindungsdatenbank auf der NCBI-Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) heruntergeladen. Die 3D-Strukturen von Echinacosid, Tubulosid A und Acteosid wurden mit dem Programm Chem3D (http://www.cambridgesoft.com/) erstellt. Die Ligandenbindungsstelle von GHSR wurde als kugelförmiger Raum mit einem Radius von 14 Å vom Zentrum der Bindungstasche in der Docking-Simulation definiert. Das Andocken von GHRP-6, Echinacosid, Tubulosid A oder Acteosid an die Bindungsstelle von GHSR wurde in silico durchgeführt, indem das LibDock-Modul im Discover Studio 2.1-Paket verwendet und durch einen intelligenten Minimierungsalgorithmus mit CHARMm-Kraftfeld in weiter minimiert wurde Entdecken Sie das Paket Studio 2.1 [33]. Um die relativen Bindungsaffinitäten von Echinacosid, Tubulosid A und Acteosid in GHSR zu vergleichen, wurde der mit GHRP-6 konstruierte Bereich des aktiven Zentrums in GHSR zum Andocken verwendet und die Bindungsenergie von GEMDOCK (The Institute of Bioinformatics , National Chiao Tung University, Taiwan).

Autorenbeiträge: Tierversuche, C.-JW, Y.-CL und W.-YC; Identifizierung und Reinigung: MY.C., N.-HL und C.-HC; Molekulare Modellierung: C.-JW, Y.-CL und JTCT; Projektdesign und Schreiben: C.-HC und JTCT

Finanzierung: Die Arbeit wurde teilweise durch ein Stipendium an Jason TC Tzen von der National Chung-Hsing University (NCHU-102D604) unterstützt.

Danksagung: Die Autoren danken Tian-Shun Weng für das Teilen seiner beruflichen Erfahrung in der Verwendung von Cistanche-Arten.

Interessenkonflikte: Alle Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

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