Teil 1: Echinacosid schützt vor MPP+-induzierter neuronaler Apoptose über ROS / ATF3 / CHOP-Signalwegregulation

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

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Arten (ROS) tragen ebenfalls zu ihrer Entwicklung bei [3]. Ähnliche Eigenschaften wie PD können durch verschiedene Umweltgifte induziert werden, einschließlich 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), Cyanid, Schwefelkohlenstoff und Toluol. MPTP wird häufig verwendet, um Tiermodelle von PD zu induzieren, und sein aktiver Metabolit, das 1-Methyl-4-phenylpyridinium-Ion (MPP?), wird in Zellmodellen von PD verwendet [4, 5]. MPP? hemmt selektiv die Elektronentransportkette und führt zu einer übermäßigen ROS-Produktion, wodurch der neuronale Tod und ein PD-ähnliches Syndrom induziert werden [6]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass MPP? induziert mehrere Signalwege in einem in vitro PD-Modell, einschließlich erhöhter GSK3B-Phosphorylierung (pY206) und a-Synuclein-Akkumulation [5], Hochregulierung der Häm-Oxygenase-1/Ni-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphatoxidase/ROS-Achse [7, 8], erhöhter Expression des aktiven Transkriptionsfaktors 3 (ATF3) und Wachstumsstopp über DNA-Schadens-induzierbares 153 (GADD153)/C/EBP-homologes Protein (CHOP) [9]. In der klinischen Behandlung ist die Unterdrückung von ROS-Produkten eine der wichtigsten Strategien für das Überleben von Neuronen und die Behandlung von Parkinson [1].

Echinacosid(ECH, Abb. 1A), eine natürlichePhenylethanoidin vielen Heilpflanzen gefunden, ist ein Hauptbestandteil derPhenylethanoidglykosideisoliert aus dem traditionellen chinesischen Kraut,CistancheSalsa [10]. Interessanterweise haben neuere Studien gezeigt, dassECHhat schützende Wirkungen in einem Mausmodell von PD, das durch MPTP induziert wird [10, 11].ECHDämpft auch Neuroblastom-Zellapoptose, die durch Tumornekrosefaktor-A oder 6-Hydroxydopamin in vitro induziert wird [12, 13]. Die Mechanismen, durch dieECHfördert das Überleben von Neuronen im MPP?-induzierten PD-Zellmodell bleibt unklar.

Wir haben gezeigt, dassECHdie durch MPP induzierten ROS-Produkte deutlich reduziert haben? in SH-SY5Y-Zellen.ECHhemmte auch die MPP?-induzierte Expression von ATF3, CHOP und a-Synuclein und unterdrückte die Aktivierung der Pro-Apoptose-Proteine Caspase-3 und Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP).

CistancheEchinacosidhatNeuroprotektiveEffekte

Materialien und Methoden

Reagenzien

Dulbeccos minimales essentielles Medium (DMEM), das fetale Rinderserum, 0,25% Trypsin, 1% Penicillin/Streptomycin und das TRIzol-Reagenz stammten von Life Technologies (Grand Island, NY). Der Chromatinfarbstoff Bisbenzimid (Hoechst 33342), Poly-L-Lysin, MPP? iodid und MPTP stammten aus Sigma (St. Louis, MO). Das Lipidperoxidations-Malondialdehyd (MDA)-Assay-Kit und Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) stammten von Beyotime Biotech (Haimen, China). ECH von C98% Reinheit stammte von Push Biotechnology (Chengdu, China).

Tiere und Behandlungen

Tierpflege und -behandlungen waren wie zuvor beschrieben [14]. Wir verwendeten männliche C57BL/6-Mäuse (Shanghai Laboratory Animal Co., Shanghai, China) mit einem Gewicht von 24–26 g im Alter von 10 Wochen. Die Tiere wurden unter Standardbedingungen (12:12 h Licht: Dunkelzyklus, 21 ± 2C und relative Luftfeuchtigkeit 40%) gehalten und erlaubten den Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum. Alle Verfahren wurden von der Tierethikkommission des Zhongshan-Krankenhauses der Fudan-Universität genehmigt und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von

Labortieren.

Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen (10 Mäuse/Gruppe) eingeteilt: Gruppe A, Fahrzeugkontrollgruppe, bei gleichem Volumen (500 lL) normaler Kochsalzlösung (NS); Gruppe B, ECH-Kontrollgruppe, mit 20 mg/kg ECH; Gruppe C, MPTP-Modellgruppe, vorbehandelt mit einem gleichen NS-Volumen; und Gruppe D, ECH-behandelte Gruppe, vorbehandelt mit 20 mg/kgECH.ECHwurde in NS aufgelöst und durch intragastrische Verabreichung alle 24 h an 15 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Das Maus-PD-Modell für die Gruppen C und D wurde durch fünf aufeinanderfolgende intraperitoneale Injektionen von 30 mg/kg MPTP alle 24 h von Tag 11 bis Tag 15 erzeugt. Mäuse wurden durch Zervixdislokation oder Perfusion getötet, die 24 h nach der letzten Behandlung intraperitoneal durch 10% Chloralhydrat (3,6 mg/kg) narkotisiert wurden.

Perfusion und Gewebeverarbeitung waren wie zuvor beschrieben [14]. Nach der intrakardialen Perfusion wurden Hirnproben gesammelt und in 4% Paraformaldehyd für 24 h bei 4C fixiert, in Paraffin eingebettet, und koronale Abschnitte, die das gesamte SNc (stereotaktische Koordinaten anteroposterior -3,64 bis -2,92 mm relativ zu Bregma umfassen) umfassten, wurden bei 5 lm geschnitten.

Weitere 5 Tiere aus jeder Gruppe wurden durch Zervixdislokation getötet und das ventrale Mittelhirn wurde schnell in 1% SDS-Lysepuffer auf Eis lysiert. CHOP- und ATF3-Proteinspiegel im Lysat wurden durch Western Blotting analysiert.

CistancheEchinacosidbelebt dieNiere

Kultur des ventralen Mittelhirns (VM) der Ratte

Dopaminerge Neuronen

Trächtige Wistar-Ratten wurden von der Shanghai Laboratory Animal Co. (Shanghai, China) gekauft. DA-Neuronen in der VM wurden am 14. Embryonaltag isoliert. Die VM wurde wie zuvor beschrieben für die Etablierung primärer VM-DA-Neuronenkulturen seziert und verarbeitet [15, 16]. Kurz gesagt, Gewebestücke wurden in eiskalter Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) gesammelt und bei 1000 U / min bei 4 ° C für 5 min zentrifugiert. Das Gewebepellet wurde in 750 lL 0,1% Trypsin-HBSS für 15 min bei 37C mit 5% CO2 inkubiert. Fetales Wadenserum (FCS; 750 lL) wurde verwendet, um Trypsin zu inaktivieren, und Gewebe wurden durch sanfte Verreibung dissoziiert

mit einer sterilisierten Pasteur-Pipette. Zellsuspensionen wurden bei 1000 U/min für 4 min bei 4C zentrifugiert und in Differenzierungsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium/F12, 33 mmol / L D-Glukose, 1% L-Glutamin und 1% FCS, ergänzt mit 2% B27) resuspendiert. Die Zellen wurden auf Poly-D-Lysin (Sigma)-beschichteten 24-Well-Gewebekulturplatten bei 5 9 104 Zellen/Well in 500 lL Differenzierungsmedium bei 37C mit 5% CO2 für 10 Tage ausgesät, um sich zu entwickeln

reife DA-Neuronen. VM DA-Neuronen waren durch Immunfluoreszenz mit Anti-b-Tubulin-Isotyp-III-Antikörper und Tyrosinhydroxylase (TH)-Antikörper gekennzeichnet (Abb. S1). Die Zellen wurden mit 1 mmol/L MPP?, 40 LG/mL ECH, einer Kombination aus MPP? und ECH oder PBS allein als Kontrolle. Die Zelllebensfähigkeit wurde nach 96 Stunden Behandlung mit CCK-8-Reagenz analysiert.

und werden als Mittelwert ± SD dargestellt (n = 6; **P \0,01 vs Kontrolle, #P \ 0,05, ##P \0,01 vs MPP? Behandlung). C Lichtmikroskopische Aufnahmen morphologischer Veränderungen, die durch MPP induziert werden? oder MPP? und ECH. a, PBS-Kontrolle; b, 40 lg/ml ECH; c, 1 mmol/L MPP?; d, 1 mmol/L MPP? und 10 lg/ml ECH; e, 1 mmol/L MPP? und 20 lg/ml ECH; f, 1 mmol/L MPP? und 40 lg/ml ECH (Skalenbalken, 200 lm).

Cistanche-Echinacosid hat die Wirkung, die Apoptose zu hemmen

SH-SY5Y Zellkultur

SH-SY5Y-Zellen stammten vom Cell Bank of Shanghai Institute of Cell Biology (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) und wurden in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin und 100 U / ml Streptomycinen. Die Zellen wurden in einem befeuchteten 37C-Inkubator gehalten, der mit 5% CO2 versorgt wurde. MPP? wurde in sterilem Wasser aufgelöst und sofort verwendet. ECH wurde in PBS aufgelöst. Um die ROS-bezogene Genexpression und die Proteinspiegel zu untersuchen, wurden die Zellen in 6-Well-Platten gesät und für 24 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden dann mit frischem Medium gefüttert, das MPP?, ECH, eine Kombination aus MPP? enthielt. und ECH oder PBS allein als Kontrolle. Nach 24 Stunden Behandlung wurden die Zellen mit 1% SDS-Lysepuffer (1% SDS, 25 mmol / L EDTA, 45 mmol / L Tris-HCl, pH 6,5) für die Western-Blot-Analyse lysiert, und die gesamte RNA wurde direkt mit TRIzol-Reagenz isoliert.

Um die ATF3- und CHOP-Verteilung nach der Behandlung zu analysieren, wurden nukleare und zytoplasmatische Extraktionsreagenzien-Kits (Thermo Fisher, Waltham, MA) verwendet, um zytoplasmatische und nukleare Fraktionen aus medikamentenbehandelten und Kontrollzellen zu extrahieren.

Zelllebensfähigkeits-Assay

SH-SY5Y-Zellen wurden in 96-Well-Platten gesät und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden alle 24 Stunden mit einem frischen vollständigen Medium, das verschiedene Medikamente enthielt, gefüttert und 3 Tage lang aufbewahrt. Anschließend wurde die Lebensfähigkeit mit dem CCK8-Zellzählerkit (Dojindo, Japan) bewertet. Die Daten wurden auf die Ergebnisse der PBS-Kontrolle normalisiert und werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Um die Lebensfähigkeit in ATF3-Knockdown-SH-SY5Y- (ATF3 shRNA) und Kontrollzellen (GFP shRNA) zu analysieren, wurden die Zellen zu 96-Well-Platten hinzugefügt und für 14-16 h kultiviert. ATF3 shRNA oder GFP shRNA Plasmide wurden mit Lipofectamine 2000 in SH-SY5Y-Zellen transfiziert (Life Technologies, Carlsbad, CA). die Zellen mit 1 mmol/L MPP? behandelt wurden oder ein gleiches Volumen von PBS nach 24 h Transfektion und wurden dann für 3 Tage inkubiert. Die Zellnummern wurden jeden Tag gezählt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt.

shRNA-Konstrukte und Oligo-Primer

pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) und GFP control shRNA Konstrukte stammen von GeneChem Co. (Shanghai, China). Die ATF3-Zielsequenz war 50-GCAAAGT G! CCGAAACAAGA-30 aus zuvor beschriebenen Methoden [17, 18]. Um die durch MPP? induzierte Genexpression nachzuweisen, wurden ROS-stressbezogene und PD-assoziierte Gene für die qRT-PCR ausgewählt, und GAPDH wurde als Kontrolle verwendet. Alle Primer wurden von Sangon Biotech Co. (Shanghai, China) synthetisiert, und die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Real-Time PCR

Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Reverse-Transkription und quantitative real-time PCR (qRT-PCR) wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. Die umgekehrte Transkriptionsreaktion wurde mit dem RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Für die qRT-PCR wurde das SYB Premix Ex Taq II Kit (TaKaRa, Dalian, China) verwendet: 20-lL-Reaktionssysteme wurden mit ABI (Life Technologies, Carlsbad, CA) verwendet. Die PCR-Parameter umfassten die folgenden Schritte: 95C für 3 min, 1 Zyklus; 95C für 5 s und 60C für 40 s, 40 Zyklen. Die endgültigen Daten waren noch nicht

moralisiert zu GAPDH und werden als Verhältnis zur Kontrolle dargestellt. Die für die Verstärkung verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Westliches Blotting

Die Western-Blot-Analyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [19]. Die primären Antikörper waren anti-gespaltene Caspase 3 und p53 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Anti-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), Anti-GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, China) und Anti-ATF3, Anti-PARP, Anti-PUMA und Anti-Histon 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Meerrettichperoxidase-markierte sekundäre Antikörper stammten von Jackson Immune Research Laboratories (Western Grove, PA). Die PVDF-Membranen stammten aus EMD Millipore (Billerica, MA) und das ECL-Substrat aus CWBio (Suzhou, China). Relative Proteinspiegel basierend auf Graustufen aus dem Bild wurden mit der Tanon GIS-Software (Tanon Biotech, Shanghai, China) analysiert, und die Daten werden als Verhältnis des Zielproteins zu GAPDH dargestellt.

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