Teil Ⅰ Der Eisenchelator PBT434 moduliert den transzellulären Eisentransport in mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns

Abstrakt

Eisen und andere Übergangsmetalle wie Kupfer und Mangan sind für die Unterstützung der Gehirnfunktion unerlässlich, eine Überakkumulation ist jedoch zytotoxisch. Diese übermäßige Anreicherung von Metallen, insbesondere Eisen, ist bei mehreren neurologischen Erkrankungen üblich; Dazu gehören die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson-Krankheit, die Friedrich-Ataxie und andere Erkrankungen, die mit Neurodegeneration und einer damit verbundenen Eisenansammlung im Gehirn einhergehen. Die Steuerung des Eisenflusses durch die Blut-Hirn-Schranke stellt die erste Verteidigungslinie gegen die übermäßige Ansammlung von Eisen im normalen Körper und gegen diese pathologischen Zustände dar. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass der Eisenchelatbildner PBT434, der derzeit zur Behandlung der Parkinson-Krankheit und Multisystematrophie entwickelt wird, die Eisenaufnahme durch mikrovaskuläre Endothelzellen (hBMVEC) des menschlichen Gehirns durch Chelatisierung von extrazellulärem Fe moduliert^{2 plus}. Die Behandlung von hBMVEC mit PBT434 führt zu einer Zunahme der Häufigkeit der Transkripte für Transferrinrezeptor (TfR) und Coeruloplasmin (Cp). Auch Western-Blot- und ELISA-Analysen zeigen einen entsprechenden Anstieg der Proteine. Innerhalb der Zelle erhöht PBT434 den nachweisbaren Gehalt an wohltätigem, labilem Fe^{2 plus}; Daten deuten darauf hin, dass dieses Fe^{2 plus}wird aus Ferritin freigesetzt. Darüber hinaus verstärkt PBT434 den Eisenausfluss, was wahrscheinlich auf den Anstieg des zytosolischen Eiseneisens zurückzuführen ist, dem Substrat für den Eisenexporteur Ferroportin. PBT434 gleicht sich schnell und bidirektional über eine hBMVEC-Blut-Hirn-Schranke aus. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der PBT434--Eisenkomplex kein Substrat für die hBMVEC-Aufnahme ist und unterstützen somit ein Modell, bei dem PBT434 interstitielles Eisen chelatisiert und die Wiederaufnahme von Eisen durch Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke hemmt Außerdem hemmt es seine Aufnahme durch die anderen Zellen der neurovaskulären Einheit. Insgesamt stellt dies einen neuen und vielversprechenden Mechanismus für die therapeutische Eisenchelatbildung dar.

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Einführung

Die Metallchelattherapie (MCT) wird seit langem zur Behandlung von Übergangsmetallvergiftungen und genetischen Störungen im Stoffwechsel eines essentiellen Metallions eingesetzt, die zu einer Überakkumulation des Metalls führen [1–3]. Zwei Beispiele für Letzteres sind die Hyperakkumulation von Kupfer bei Morbus Wilson [4] und von Eisen bei hereditärer Hämochromatose [5]. Sowohl Kupfer als auch Eisen sind Katalysatoren von oxidativem Stress und daher zytotoxisch in Konzentrationen, die die Fähigkeit der Zelle und des Organismus übersteigen, diese redoxaktiven Übergangsmetalle zu „beaufsichtigen“ [6, 7]. Insbesondere die Ansammlung von Eisen ist im Großen und Ganzen idiopathisch; tatsächlich ist ein Anstieg des Eisenspiegels ein Kennzeichen eines alternden Gehirns [8–10]. Pathologisch gesehen ist diese Eisenansammlung im Gehirn ein Merkmal von Mutationen in Genen, die nichts mit dem Eisenstoffwechsel zu tun haben [11–15], sowie einer Vielzahl anderer neurodegenerativer Erkrankungen, von denen einige keinen spezifischen genetischen Zusammenhang haben, wie z. B. Alterung [16], Alzheimer-Krankheit [ 17], Friedreich-Ataxie [18] und Parkinson-Krankheit [19]. Als Gruppe können solche Störungen als Neurodegeneration mit Eisenansammlung im Gehirn (NBIA) betrachtet werden, obwohl dieses Akronym üblicherweise auf diejenigen beschränkt wurde, für die ein genetischer Zusammenhang festgestellt wurde [11, 13, 14].

Im Falle einer Eisenüberladung besteht das Ziel darin, den Körper von überschüssigem Eisen zu „reinigen“, das auf eine Störung der Eisenaufnahme oder -ausleitung in den Zellen zurückzuführen ist. Hier besteht das Ziel darin, physiologische Eisenchelatoren mit dem Medikament zu übertreffen; Eine Verbindung, die eine gute Pharmakokinetik und eine hohe Affinität zu Eisen (II) aufweist, ist das Zielarzneimittel. Da der Körper mit dem essentiellen Metall übersättigt ist, bestehen kaum Bedenken, dass es im Laufe der Behandlung zu einem Mangel kommen könnte. Die Behandlung von Hirnerkrankungen mit einer Eisenchelat-Therapie erfordert eine andere Strategie. Hierbei handelt es sich nicht um ein Problem einer systemischen Eisenüberladung, sondern um eine Ansammlung von Eisen in pathologischen Bereichen mit schädlichen Folgeerscheinungen. Beispielsweise trägt die altersbedingte Eisenanreicherung bei der Parkinson-Krankheit (PD) potenziell zu oxidativen Stress-bedingten Zellschäden bei [20]. Überschüssiges labiles Eisen fördert die Fehlfaltung von -Synuclein in Neuronen der Substantia nigral. Die Verwendung eines Chelators mit hoher Affinität kann zwar zu einer gewissen Reduzierung der Eisenlast im Gehirn führen, wird aber höchstwahrscheinlich einen Eisenmangel hervorrufen, der zumindest in der älteren Bevölkerung angesichts des systemischen Eisenmangels, der in dieser Altersgruppe häufig vorkommt, kontraindiziert ist [21] . Ein Chelator mit optimaler Affinität hat das Potenzial, die Eisenansammlung sowie den damit verbundenen oxidativen Stress aufgrund von überschüssigem labilem Eisen und zugrunde liegenden Krankheitsprozessen zu reduzieren.

Cistanche tubulosaUndDie Wirkung von Cistanche

Ein zur Behandlung der transfusionsbedingten Eisenüberladung bei Thalassämie-Patienten zugelassener Chelator ist Deferipron (DFP, Markenname Ferriprox) [5, 22]. DFP wurde auch zur Behandlung der Friedreich-Ataxie [23] und der Parkinson-Krankheit [24, 25] eingesetzt. In einer Metaanalyse wurde gezeigt, dass DFP bei Thalassämie-Patienten zu einer signifikanten Reduzierung des myokardialen Eisengehalts sowie zu einem besseren Herzschutz führt als Deferoxamin, der klassische Eisenchelatbildner [5]. Andererseits wird DFP schnell von der Leber metabolisiert [26] und neuere Arbeiten haben gezeigt, dass es Fe2 plus am aktiven Zentrum eisenabhängiger Histon-Lysin-Demethylasen chelatisiert, eine Aktivität, die mit einer bisher nicht erkannten Zytotoxizität korreliert [27]. Dieser Befund unterstreicht eine wesentliche Einschränkung bei der Anwendung der Eisenchelat-Therapie, nämlich die Konkurrenz des Arzneimittels um physiologisch essentielles Eisen, sei es in einem Eisenspeicher oder in einem Protein, das eine prothetische Eisenspezies beherbergt. Nichtsdestotrotz hat DFP beispielsweise in einer Phase-2-Studie zur Behandlung der Parkinson-Krankheit Wirksamkeit gezeigt, wie sowohl durch analytische (reduzierte Eisenbelastung des Gehirns durch T2--gewichtete MRT) als auch durch Verhaltensindizes (kognitive und motorische Neuronenfunktion) angezeigt wurde [ 24, 25].

Die Affinität von DFP zu Fe3 plus bleibt jedoch besorgniserregend. Die stabile DFP-Eisenspezies ist der Tris-Komplex [Fe(DFP)3] 0 [28]. Während die Neutralität dieses Komplexes ideal für die Mobilisierung von Eisen aus der Zelle ist, macht seine Stabilitätskonstante von ~1037 DFP zu einem echten Eisenfänger; In diesem Zusammenhang ist die Hemmung eines Eisenenzyms wie der Lysin-Demethylase vorhersehbar [27]. Diese Bedenken spiegeln die Notwendigkeit wider, Eisenchelatoren zu entwickeln, die die Membranpermeabilität von DFP, aber eine deutlich schwächere Affinität sowohl für Fe2 plus als auch für Fe3 plus aufweisen. Dieses letztere Merkmal begrenzt das Abfangen von Arzneimitteln aus prothetischem Metall und das thermodynamische Potenzial des Chelatbildners, die Autooxidation von Eisen (II) zu katalysieren, die zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies führt. Im Wesentlichen katalysieren starke Eisenkomplexbildner die prooxidative Eigenschaft von Fe2 plus [29]. In dieser Studie berichten wir, wie ein solcher Eisenchelatbildner mit moderaten Affinitäten zu Eisen (III) und Eisen (II) den Eisenfluss in den mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns moduliert, die die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​bilden.

Cistanche-Tabletten

Dieses Medikament, PBT434 [5,7-dichlor-2-((methylamino)methyl)-8-hydroxy-3-methylchinazolin-4 (3H)-on, Abb. 1A] , bildet einen Biseisenkomplex mit logarithmischen Stabilitätskonstanten von ~11 und ~15 für Fe^{2 plus}und Fe^{3 plus}bzw. [30]. PBT434 verhinderte den Verlust von Substantia nigra pars compacta (SNpc)-Neuronen, verringerte die Nigral-Synuclein-Akkumulation, reduzierte den mit dem Parkinson-Krankheitsmodell verbundenen Eisengehalt im Mittelhirn und rettete die motorische Leistung in zwei Mausmodellen der Parkinson-Krankheit, ohne dass es zu einer offensichtlichen Erschöpfung der systemischen Eisenspeicher kam [30]. PBT434 ist auch in Mausmodellen der Multiplen Systematrophie (MSA) wirksam [30, 31], einer motorischen Störung, die in ihrem Erscheinungsbild der Parkinson-Krankheit ähnelt, die jedoch durch eine Fehlfaltung von -Synuclein und eine anschließende Akkumulation gekennzeichnet ist, was zur Bildung von glialen zytoplasmatischen Einschlüssen führt, die das Markenzeichen sind Pathologie der Krankheit [32]. Signifikant reduzierte PBT434 Marker für oxidativen Stress in Maus-PD-Modellen [30], was darauf hindeutet, dass 1) PBT434 auf Eisenspeicher abzielte, die ansonsten als Prooxidantien fungieren sollten, und 2) PBT434 diese entstehende, auf Oxidation basierende Zytotoxizität nicht verstärkte. PBT434 hat eine Phase-1-Studie zufriedenstellend abgeschlossen [33].

Die hier vorgestellte Arbeit sollte den Einfluss von PBT434 auf den Eisentransport in den Barrierezellen des Gehirns untersuchen, den mikrovaskulären Endothelzellen, die zusammen mit den darunter liegenden Gliazellen die Blut-Hirn-Schranke bilden. In diesen Studien wurde eine gut validierte immortalisierte Endothelzelllinie sowohl im Monolayer- als auch im Transwell-Kulturformat verwendet [34–37]. Das Hauptziel dieser Studien bestand darin, die Kinetik der Eisenaufnahme und des Eisenausflusses aus diesen Zellen sowie deren Modulation durch PBT434 zu bestimmen. Das Transwell-BBB-Modell wurde auch verwendet, um den bidirektionalen transzellulären PBT434-Fluss über die Endothelzellbarriere zu demonstrieren. Das Modell zeigte molekular, dass PBT434 die Eisenaufnahme durch Chelatbildung hemmt und gleichzeitig den Eisenausfluss stimuliert. Zell-Bildgebungsstudien deuten darauf hin, dass PBT434 auf denselben labilen Eisenpool zugreift, der von einem klassischen Fe untersucht wurde^{2 plus}Chelatbildner, 2,2'-Bipyridin oder Bipyridyl, und eine Fluoreszenzsonde für Eisen(II)-Eisen. Die Ergebnisse deuten auf einen möglichen Wirkmechanismus von PBT434 hin, der die Hemmung der Aufnahme von systemischem Eisen an der Blut-Hirn-Schranke und die anschließende Sequestrierung von Gehirneisen im interstitiellen Raum umfasst.

Ergebnisse

1. PBT434 hat keine zytotoxischen Wirkungen auf mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns

Um einen geeigneten Bereich von Arbeitskonzentrationen für PBT434 in unserer In-vitro-Zellkultur zu bestimmen, verwendeten wir den MTT-Assay, um die Mitochondrienfunktion von hBMVEC als Reaktion auf PBT434 zu überwachen. Basierend auf früheren Berichten [30] wurden sie 24 Stunden lang mit einer Reihe von PBT434-Konzentrationen bis zu 100 μM behandelt. Wir beobachteten bei keiner der getesteten Konzentrationen signifikante Veränderungen in der Lebensfähigkeit von hBMVEC (Abb. 2).

2. PBT434 wird schnell aufgenommen und über die hBMVEC-Barriere transportiert

PBT434 ist ein oral bioverfügbares Medikament, das leicht in die Blut-Hirn-Schranke eindringen kann, wie Studien an Mäusen und Menschen zeigen [30, 38, 39]. Wir haben die Akkumulation von PBT434 in in Monoschichten gezüchteten hBMVEC unter Verwendung von 14C-markiertem PBT434 als Radiotracer überwacht. Die Daten zeigten, dass 14C-PBT434 in der ersten Phase schnell ein Gleichgewicht zwischen dem Aufnahmemedium und der Zelle herstellte. Auf diese anfängliche Aufnahme folgte eine weitere langsame Akkumulation über 3 Stunden, die eine Rate von 30,1 ± 9,8 pmol/mg/h aufwies (Abb. 3A). Im Aufnahmeprotokoll wird die Aufnahme gestoppt und die Zellen werden bei 4 °C gewaschen, bevor sie zur 14C-PBT434-Akkumulation verarbeitet werden (Methoden). In einem separaten Experiment untersuchten wir den Ausfluss von 14C-PBT434 aus hBMVEC nach einer 30-minütigen Belastungsperiode. Beim Efflux-Protokoll werden die Zellen bei 25 °C gewaschen. Die Daten in Abb. 3B zeigen, dass beim Waschen bei 25 °C etwa 92 Prozent des in der Zelle angesammelten 14C-PBT434 verloren gingen (vgl. 550 pmol 14C-PBT434/mg Protein in 3A nach 30 Minuten bis 43 pmol 14C-PBT434/mg). Protein bei t=0 in 3B). Es kam zu einem weiteren langsamen Verlust des verbleibenden 14C-PBT434 (Abb. 3B). Die Daten legen zwei Aspekte der Akkumulation und des Efflux von PBT434 durch hBMVEC nahe. Der Fluss durch die Plasmamembran erreicht schnell ein scheinbares Gleichgewicht, sei es während der Aufnahme oder des Ausflusses. In beiden Prozessen tritt jedoch ein weiterer langsamerer Prozess auf. Dies deutet darauf hin, dass sich innerhalb der Zelle ein Teil des Zell-PBT434 an einem Ort/Zustand befindet, der in einer kinetischen Steady-State-Beziehung mit dem Teil im Gleichgewicht mit dem extrazellulären Milieu steht. Die in Abbildung 3B dargestellte kinetische Analyse schätzte, dass dieser PBT434-Pool durch 27 ± 4 pmol/mg Protein im Zelllysat repräsentiert wurde, wenn die Zellen mit 20 μM Reagenz behandelt wurden.

Um den transzellulären Fluss von PBT434 zu untersuchen, verwendeten wir ein gut validiertes In-vitro-BBB-Modell unter Verwendung von auf der apikalen Seite einer Transwell-Membran gewachsenen Zellen [35, 36, 40, 41]. Die Barriereeigenschaften dieser Transwell-Kulturen wurden durch Quantifizierung ihres transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) und ihrer Undurchlässigkeit für FITC-markiertes Dextran verifiziert (S1-Abb.). Wir verglichen die Aufnahme von 14C-PBT434 an der luminalen (oder apikalen, Blutseite) (Abb. 4A) mit der Aufnahme an der abluminalen (oder basolateralen, Gehirnseite) (Abb. 4C) Membran. Im gleichen Experiment wurde der entsprechende Efflux (transzellulärer Fluss) durch das Auftreten von 14C-PBT434 in der Effluxkammer quantifiziert (Abb. 4, Tafeln B und D). Die Geschwindigkeiten dieser Prozesse sind in Tabelle 1 angegeben. Die in Abb. 4 (Felder B und D) dargestellten Massendaten zeigen, dass der Nettofluss von PBT434 durch die Blut-Hirn-Schranke dieses Modells in beiden Richtungen gleich war. In der Basalkammer wurden 976 ± 185 pmol 14C-PBT434 angesammelt (Abb. 4B) und in der Basalkammer wurden 1033 ± 210 pmol quantifiziert (Abb. 4D). Diese nahezu Äquivalenz spiegelte sich auch in den nahezu ähnlichen Raten des PBT434-Ausflusses an den beiden Barrieremembranen wider (Tabelle 1). In diesem Barrieremodell kam es jedoch zu einer deutlich größeren Aufnahme von PBT434 an der basolateralen Membran, was durch den etwa 50 Prozent größeren Verlust der Verbindung aus der Basalkammer (Abb. 4C) veranschaulicht wird, der einer etwa 40 Prozent höheren Rate der scheinbaren Zellaufnahme entsprach (Tabelle 1). Eine stärkere Aufnahme würde voraussichtlich zu einer stärkeren Akkumulation führen. Die Analyse der Zellen nach 3 Stunden zeigte, dass sie unabhängig von der Flussrichtung etwa 6 μM PBT434 zurückhielten. Die Werte betrugen 8,1 ± 1,3 μM (apikal nach basal) und 4,7 ± 1,2 μM (basal nach apikal). Wie oben erwähnt, folgt diese Analyse dem Waschen der Zellen vor der Lyse und der Quantifizierung des gesamten Zellproteins und 14C-PBT434. Darüber hinaus enthielt das Medium in der apikalen Kammer RPMI plus 10 Prozent FBS und 10 Prozent NuSerum, während die basale „Gehirn“-Kammer nur RPMI enthielt (Methoden). Eine vernünftige Schlussfolgerung war, dass die stärkere „Aufnahme“ an der Basalmembran eine Zelloberflächenadsorption von PBT434 widerspiegelte, die in der apikalen Kammer durch das Vorhandensein von Proteinkomponenten im Serum begrenzt war. Beim Waschen der Zellen zur Anreicherung von PBT434 wurde dieses adsorbierte Material (das als „Aufnahme“ registriert wurde) entfernt. Die Wiederholung dieses Flux-Experiments, jedoch mit Serum in der Basalkammer, zeigte, dass Serum tatsächlich diese wahrscheinliche PBT434-Adsorption an der Zelloberfläche unterdrückte (S2-Abb.).

3. PBT434 schränkt im Gegensatz zu Bipyridyl die intrazelluläre Verfügbarkeit von labilem Eisen nicht ein

Da PBT434 im Vergleich zu klassischen Eisenchelatbildnern wie Deferipron oder Bipyridyl eine moderatere Affinität zu Eisen aufweist, haben wir untersucht, wie sich dieser Unterschied in der Wirkung von PBT434 auf den zellulären labilen Eisenpool (LIP) von hBMVEC widerspiegelt. Dazu nutzten wir das durchlässige Fe^{2 plus}-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff FerroOrange, der mit wohltätigem zytoplasmatischem Eisen reagiert. Wir sahen bei der Behandlung mit Bipyridyl eine signifikante Abschwächung der Fluoreszenz in Zellen, was mit der Chelatisierung des LIP durch diesen hochaffinen Eisen-Eisen-Chelator übereinstimmt und somit die Wirkung des fluoreszierenden Eisenindikators blockiert (Abb. 5A). Im Gegensatz dazu konkurrierte PBT434 nicht mit FerroOrange um Fe^{2 plus}, ein Verhalten, das mit seiner moderateren Affinität übereinstimmt [30]. Die Ergebnisse zeigten, dass PBT434, jedoch nicht das inaktive PBT434-met-Derivat, einen Anstieg des für FerroOrange zugänglichen Fe um 34 ± 9 Prozent induzierte^{2 plus}Dies deutet darauf hin, dass dieser Chelatbildner Eisen innerhalb der Zelle mobilisiert, ohne dass es gleichzeitig zu Toxizität kommt. Die unten dargestellten Daten deuten darauf hin, dass dieses Eisen aus Ferritin stammt.

Zuvor konnte gezeigt werden, dass PBT434 die Expression abgereicherter Ferroportin-Proteine ​​in MPTP-behandelten Mäusen auf ein Niveau wiederherstellt, das dem von Mäusen ohne Läsionen ähnelt [30]. Dieses Ergebnis deutete zusammen mit der Zunahme der intrazellulären Eisenfärbung als Reaktion auf PBT434 auf eine mögliche Auswirkung auf das zelluläre Eisenreaktionssystem und die Funktion nachgeschalteter eisenbezogener Proteine ​​hin. Um dies zu beurteilen, führten wir zunächst eine quantitative PCR (qPCR)-Analyse des PBT434-Effekts auf die Häufigkeit der Transkripte für mehrere Eisen-handhabende Proteine ​​durch (Abb. 6). Während die Transkripte für das Eisen-Efflux-Protein Ferroportin (Fpn) und die beiden zytoplasmatischen Eisen-Chaperone PCBP1 und 2 unbeeinflusst blieben, war dies bei der Häufigkeit der mRNAs für den Transferrin-Rezeptor (TfR) und die Ferroxidase Coeruloplasmin (Cp) der Fall ändern. Die TfR- und Cp-Transkripte stiegen um das 2,8- bzw. 3-{13}fache. Die Expression des Transferrinrezeptors (TfR) ist mit dem System Eisen-responsives Element (IRE)/Eisen-regulatorisches Protein (IRP) verknüpft [42–44]. Der Anstieg der TfR-mRNA legt nahe, dass PBT434 mit der PCBP1-abhängigen Eisenabgabe um den Aufbau des Fe-S-Clusters konkurriert, der das regulatorische IREBP von einem RNA-bindenden Protein in zytosolische Aconitase umwandelt [45]. Somit verschiebt PBT434 diese regulatorische Modulation in Richtung RNA-Bindung und der entsprechenden Hemmung des TfR-mRNA-Abbaus. Bei zellulärem Eisenmangel wird die Cp-Expression teilweise durch HIF-1 reguliert [46]. Eine Erhöhung der HIF-1-Funktion ergibt sich aus dem Abbau seiner Hydroxylierung durch die Prolylhydroxylase-Aktivität in einer eisenabhängigen Reaktion [47]. Wie im Fall des IREBP scheint PBT434 den Eisenvorrat zu verringern, der als Cofaktor bei der HIF-1-Hydroxylierung und dem Abbau dient. In diesem Modell erhöht der Anstieg des Steady-State-Spiegels dieses Transkriptionsaktivators die Cp-Transkription.

Mithilfe einer Kombination aus ELISA-Analyse und Western-Blot untersuchten wir die Expression von Eisen-handhabenden Proteinen in mit PBT434 oder PBT434-met behandeltem hBMVEC; Beispiele für die WB-Analysen sind in Abb. 7A dargestellt. Die Daten zeigten, dass die Häufigkeit von TfR-Monomer und -Dimer innerhalb von 24 Stunden deutlich zunahm, ebenso wie Cp (Abb. 7B und 7C). Beide Anstiege verliefen parallel zum PBT434--abhängigen Anstieg der jeweiligen Transkripte (Abb. 6). Im Gegensatz dazu war die Expression des Eisen-Efflux-Proteins Fpn unempfindlich gegenüber der PBT434-Behandlung (Abb. 7D).

Wir verwendeten ELISA als zusätzliche Methode, um die durch die Western-Blot-Daten angezeigten Faltungsänderungen zu quantifizieren. Daher wurden hBMVEC 24 Stunden lang mit PBT434 behandelt und Zelllysate wurden mittels ELISA auf TfR untersucht (Abb. 8A). Der durch ELISA quantifizierte fache Anstieg des TfR als Reaktion auf die PBT434-Behandlung entsprach dem durch die Analyse der Western Blots ermittelten Wert (Abb. 7B). ELISA wurde auch verwendet, um die Häufigkeit von sekretiertem und GPI-gebundenem Cp-Protein zu bewerten, wobei HepG2-Zellen als Positivkontrolle verwendet wurden. In Bezug auf das in Wachstumsmedien sezernierte Cp war dieser Ansatz insofern eingeschränkt, als die sCp-Häufigkeit sowohl in HepG2- als auch in hBMVEC-konditionierten Medien bei oder unter der unteren Empfindlichkeitsgrenze dieses Tests lag (S3-Abb.). Es ermöglichte jedoch die Beurteilung der GPI-Cp-Häufigkeit. Bei dieser Methode wurden Zellen mit Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC) behandelt, die den GPI-Anker spaltet; Die so konditionierten Medien wurden konzentriert und mittels Cp-ELISA analysiert. Während dieser Ansatz zeigte, dass PBT434 die Menge an GPI-Cp in HepG2-Zellen erhöhte, konnte erneut kein vom PI-PLC freigesetztes Cp nachgewiesen werden (Abb. 8B). ELISA bot auch eine direkte Methode zur Quantifizierung von Ferritin. Zu diesem Zweck wurden hBMVEC 24 Stunden lang mit 1 uM Fe-Citrat beladen und anschließend eine weitere Stunde lang in Abwesenheit oder Gegenwart von PBT434 behandelt. Die resultierenden Zelllysate wurden einer ELISA-Analyse auf Ferritin unterzogen (Abb. 8C). Im Gegensatz zum Anstieg des TfR führte die Behandlung mit PBT434 zu einem Rückgang des Ferritin (Ft)-Proteins um etwa 18 Prozent. Tatsächlich war dieser Verlust an Ft-Protein bereits nach einer einstündigen Behandlung mit dem Reagenz erkennbar. Die zeitliche Natur dieses Ergebnisses kann mit dem oben erwähnten Anstieg des wohltätigen Fe2 Plus nach einer 30-minütigen Behandlung mit PBT434 korreliert werden. Wie später erläutert, wurde der Abbau von Ferritin nach der Behandlung mit anderen zellgängigen Fe2-Plus-Chelatbildnern nachgewiesen [48].

4. ⁵⁵Fe^{2 plus}Die Aufnahme wird durch Komplexierung mit PBT434 gehemmt

Angesichts der schnellen Äquilibrierung von PBT434 in hBMVEC innerhalb von 30 Minuten im Vergleich zur langsamen, zweiphasigen Aufnahme und Äquilibrierung von Fe2 plus über 24 Stunden [49] stellten wir die Hypothese auf, dass PBT434 und Fe2 plus nicht den gleichen Aufnahmemechanismus haben. Um dies zu testen, wurden Monoschichten mit radioaktiv markiertem 55Fe2 plus in Abwesenheit oder Gegenwart von PBT434 oder PBT434-met inkubiert und die 55Fe2 plus-Aufnahme über 3 Stunden überwacht (Abb. 9A). PBT434 verringerte die Aufnahmerate von 55Fe2 plus deutlich und verringerte auch die Gesamtakkumulation von 55Fe2 plus in Zelllysaten (Abb. 9C). Dieser Effekt wurde bei PBT434-met nicht beobachtet. Ein Vergleich der Aufnahmeraten von PBT434 und 55Fe zeigt, dass PBT434 und Fe2 plus über unterschiedliche Transportwege aufgenommen werden. Darüber hinaus lässt die Hemmung der 55Fe-Aufnahme in Gegenwart von PBT434, aber nicht von PBT434-met darauf schließen, dass ein extrazellulärer PBT434--Eisenkomplex kein Ligand für die Eisen-Eisen-Transporter in hBMVEC, nämlich ZIP8, ist PLZ14.

Cistanche-Ergänzungsmittel

Um die Rolle von PBT434 bei der Eisenakkumulation weiter zu untersuchen, haben wir die Auswirkung seiner Vorexposition auf die Aufnahme von 55Fe2 plus getestet. Mit PBT434 vorbehandelte Zellen, die nach dem Waschen 55Fe2 plus ausgesetzt wurden, zeigten nach 3 Stunden einen Anstieg der Aufnahme- und Akkumulationsrate von 55Fe2 plus (Abb. 9, Tafeln B und D). Diese erhöhte Akkumulation hielt mindestens 24 Stunden lang an. Diese Daten legen nahe, dass die Vorexposition von Zellen gegenüber PBT434 die Eisenaufnahme vorübergehend verstärkt. Unerwarteterweise zeigte PBT434-met vor der Behandlung auch einen Anstieg sowohl der Aufnahme als auch der Akkumulation (Abb. 9B), dieser Effekt war jedoch nicht so signifikant oder anhaltend wie der von PBT434 gezeigte.

Wir haben gezeigt, dass die Aufnahme von Eisen aus 59Fe-Transferrin durch Ferri-Reduktion und Ferro-Permeation an der Plasmamembran von HA unterstützt wird [50, 51]. Ein experimentelles Ergebnis zur Unterstützung dieses TBI-Eisenaufnahmemodells war die Unterdrückung dieser Aufnahme durch Hemmung der extrazytoplasmatischen Ferrireduktaseaktivität; Ein weiteres Ergebnis war eine 60-prozentige Hemmung der TBI-Eisenaufnahme durch Ferrozine, einen starken Eisen-Eisen-Chelatbildner [50]. Diese letztere Strategie wurde verwendet, um zu zeigen, dass PBT434, aber nicht PBT434-met, auch die TBI-Eisenaufnahme hemmte (Abb. 10).

5. PBT434 stimuliert den Fpn-abhängigen 55Fe2-Plus-Efflux

PBT434 verfügt über etwa 20 Prozent der Fähigkeit von Deferipron, eine scheinbare Stimulierung des Fe2-Plus-Ausflusses aus neuronalen Zellen zu bewirken [30]. Wir untersuchten den Ausfluss von 55Fe2 plus aus hBMVEC in Abwesenheit oder Anwesenheit von PBT434 in Kontrollzellen oder Zellen, die mit einem Mini-Hepcidin, PR73, behandelt wurden. Hepcidin ist ein Peptidhormon, das sowohl systemisch als auch im Interstitium des Gehirns vorkommt, an Fpn bindet und den Transporter zum Abbau ansteuert. Die Auswirkungen von Hepcidin auf die Eisenexportfunktion von Fpn wurden ausführlich untersucht [52–54]. Wir haben zuvor gezeigt, dass der Ausfluss von Fe2 plus aus hBMVEC Fpn-abhängig ist [35, 49]. PR73 hat einen EC50 von ~4 nM für den Fpn-Abbau in einem GFP-Reporter-Assay [55]. hBMVEC in Monoschichten wurden 24 Stunden lang in Abwesenheit oder Gegenwart von PR73 mit 55Fe2 plus beladen. Der 55Fe-Ausfluss wurde dann über einen Zeitraum von 5 Stunden bei fortgesetzter Abwesenheit oder Anwesenheit von PR73 in Kombination mit der Abwesenheit und Anwesenheit von PBT434 quantifiziert (Abb. 11). Während PR73 den 55Fe-Ausfluss sowohl aus der Kontrollkultur als auch aus den mit PBT434- behandelten Kulturen unterdrückte, unterdrückte PBT434 teilweise die Hemmung aufgrund des Mini-Hepcidins. In Abwesenheit von PBT434 wurde der Eisenausfluss aus den mit PR73-behandelten Kulturen um etwa 75 Prozent verringert, während der Abbau in den mit PBT434-behandelten Kulturen nur etwa 50 Prozent betrug (Abb. 11 und Tabelle 2). Aus diesen Ergebnissen lassen sich zwei Schlussfolgerungen ziehen. Erstens reguliert der Abbau von Fpn durch PR73 den 55Fe-Ausfluss sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von PBT434 herunter. Zweitens unterstützt PBT434 unter beiden Bedingungen eine signifikante, wenn auch geringe Stimulation des Eisenausflusses.

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Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman

Abteilung für Biochemie, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, State University of New York at Buffalo, Buffalo, NY, Vereinigte Staaten von Amerika