Teil drei: DsbA-L interagiert mit VDAC1 bei der mitochondrienvermittelten tubulären Zellapoptose und trägt zum Fortschreiten einer akuten Nierenerkrankung bei

7. Die Generation von PT-VDAC1-KO-Mäusen

Um die Rolle von VDAC1 bei AKI zu untersuchen, haben wir ein Mausmodell etabliert, das den Knockout von VDAC1 in den proximalen Tubuli der Nieren zeigt. Abbildung 7a zeigt das Züchtungsprotokoll, das zur Erzeugung von PT-VDAC1-KO verwendet wird. Zur Genotypisierung der PT-VDAC1-KO-Mäuse wurde RT-PCR verwendet; Dies geschah durch Amplifikation eines 416-bp-DNA-Fragment-floxed-Allels und eines 370-bp-DNA-Fragments des Cre-Gens (Abbildung 7, b; Spuren 4 und 6). Den Wildtyp-Mäusen (PT-VDAC1-WT) fehlte das Cre-Gen (Abbildung 7, b, Spuren 2 und 3). Die Immunblot-Analyse ergab, dass die Expressionsniveaus von VDAC1 in den Nierenrinden der PTVDAC1-KO-Mäuse nach einer ischämischen oder Scheinbehandlung niedriger waren als die der PTVDAC1-WT-Mäuse (Abbildung 7 c und d). Dies wurde durch die immunhistochemische Färbung von VDAC1 weiter verifiziert (Abbildung 7e). Diese Daten bestätigten, dass wir erfolgreich ein PT-VDAC1-KO-Mausmodell etabliert hatten.

Abbildung 7. Erstellung und Eigenschaften des PT-VDAC1-KO-Mausmodells. (a, b) Das Zuchtprotokoll für die Erzeugung von PTVDAC1-KO-Mäusen und der PCR-Nachweis des Genotyps von Wildtyp- und Floxed-Allelen von VDAC1 und PEPCK-Cre-Allel. (c) Die Immunblot-Analyse von VDAC1 und b-Tubulin unter Verwendung von kortikalen Nierengeweben von PT-VDAC1-KO- und PT-VDAC1-WT-Wurfgeschwistermäusen nach einer IR-Verletzung. (d) Analyse des Graustufenbildes zwischen ihnen. (e) Immunhistochemische Färbung von VDAC1 im kortikalen Nierengewebe von Wildtyp- und VDAC1-Mäusen nach einer IR-Verletzung. Originalvergrößerung x 400. Narbenbalken: 100 µM. Jedes Experiment (c und e) wurde sechsmal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Für die Mehrfachgruppenvergleiche (d) wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet. # P<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.

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8. I/R-induzierte Nierenschäden, tubuläre Zellapoptose und mitochondriale Schäden wurden bei PTVDAC1-KO-Mäusen verbessert

Wurfgeschwister der PT-VDAC1-WT- und PT-VDAC1-KO-Mäuse wurden mit Ischämie (28 Minuten) und anschließender Reperfusionsschädigung (48 Stunden) behandelt. Anschließend entnahmen wir Blutproben und Nierengewebe zur weiteren Untersuchung. Wir fanden heraus, dass PT-VDAC1-KO den I/R-induzierten Anstieg der BUN- und Kreatininspiegel deutlich unterdrückte (Abbildung 8 a und b). Zweitens zeigten histologische und TUNEL-Analysen außerdem, dass PT-VDAC1-KO die I/R-induzierte Gewebeschädigung und Nierenzellapoptose deutlich abschwächte (Abbildung 8 c, d, f und g). Drittens ergaben EM-Analysen, dass PT-VDAC1-KO I/R-induzierte mitochondriale Schäden deutlich abschwächte (Abbildung 8 e und h). Schließlich bestätigte das Immunblotting, dass die PT-VDAC1-KO-Mäuse verringerte Mengen an gespaltener Caspase-3, eine geringere Akkumulation von Bax in den Mitochondrien und geringere Raten der Cyt-c-Freisetzung in das Zytosol aufwiesen (Abbildung 8 I- o). Diese Daten zeigten, dass VDAC1 auch den I/R-induzierten AKI vermittelte.

Abbildung 8. Abschwächung von IR-induzierter Nierenschädigung, tubulärer Zellapoptose, Mitochondrienschäden und der Expression von Bax, Cyt-c und gespaltener Caspase3 in PT-VDAC1-KO-Mäusen. Die bilateralen Nierenarterien von PT-VDAC1-KO- und PT-VDAC1-WT-Wurfgeschwistermäusen wurden 28 Minuten lang abgeklemmt und dann 48 Stunden lang freigegeben, um ein IR-Modell zu erstellen. (ein Brötchen. (b) Serumkreatinin. (c) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. (d) Repräsentative Abschnitte von TUNEL-positiven Zellen. (e) Elektronenmikroskopischer Nachweis der Mitochondrienmorphologie. (f) Röhrenschadensbewertung. (g) Die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen. (h) Mitochondrien-Verletzungs-Score. (i) Die Immunoblots analysieren die Expression von gespaltener Caspase3, VDAC1 und DsbA-L sowie die Expression von BAX und Cyt-c in mitochondrialen und zytosolischen Fraktionen. b-Tubulin und GAPDH wurden als Gesamtlysat- bzw. Zytosolbeladungskontrolle verwendet. COX IV wurde als Mitochondrien-Beladungskontrolle verwendet. (j-p) Analyse des Graustufenbildes zwischen ihnen. Originalvergrößerung x 400. Narbenbalken: 100 µM in c und d, 20 µM in e. Jedes Experiment (c-e&i) wurde sechsmal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Für die Mehrfachgruppenvergleiche (a, b, f-h&j-p) wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet. # P<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.

Cistanche tubulosa

9. Die Überexpression von durch DsbA-L verstärkten I/R-induzierten Nierenschaden wurde in PT-VDAC1-KO-Mäusen abgeschwächt

von DsbA-L während einer ischämischen Verletzung. Eine Woche bevor das IR-Mausmodell etabliert wurde, injizierten wir das DsbA-L-Plasmid in die Schwanzvene jeder Maus (die Injektion wurde in dieser Woche zweimal durchgeführt). Die Überexpression von DsbA-L verschlimmerte die IR-induzierte Erhöhung der BUN- und Kreatininexpression, Nierenschäden und Nierenapoptose; Diese Effekte wurden bei den PTVDAC1-KO-Mäusen abgeschwächt (Abbildung 9 a–d, e und f). Immunblot-Ergebnisse zeigten außerdem, dass die Überexpression von DsbA-L den IR-induzierten Anstieg der gespaltenen Caspase-3, die Akkumulation von Bax in den Mitochondrien und die Freisetzung von Cyt-c in das Zytosol verstärkte; Diese Effekte waren bei den PT-VDAC1-KO-Mäusen reduziert (Abbildung 9 g und h-l). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse weiter, dass VDAC1 die Wirkung von DsbA-L während einer ischämischen Verletzung vermittelte.

Abbildung 9. Die Überexpression der durch DsbA-L verstärkten I/R-induzierten Nierenschädigung wurde in PT-VDAC1-KO-Mäusen abgeschwächt. Die PT-VDAC1-KO- und PT-DsbA-L-WT-Mäuse wurden mit oder ohne DsbA-L-Plasmid behandelt und anschließend ein IR-Modell erstellt. (ein Brötchen. (b) Serumkreatinin. (c) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. (d) Repräsentative Abschnitte von TUNEL-positiven Zellen. (e) Röhrenschadensbewertung. (f) Die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen. (g) Die Immunblots analysierten die Expression von gespaltener Caspase3, VDAC1 und DsbA-L sowie die Expression von BAX und Cyt-c in mitochondrialen und zytosolischen Fraktionen. b-Tubulin und GAPDH wurden als Gesamtlysat- bzw. Zytosolbeladungskontrolle verwendet. COX IV wurde als Mitochondrien-Beladungskontrolle verwendet. (h-n) Analyse des Graustufenbildes zwischen ihnen. Originalvergrößerung x 400. Narbenbalken: 100 mm. Jedes Experiment (c-e) wurde sechsmal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Für die Mehrfachgruppenvergleiche (a, b und f-n) wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet. # P<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.

Cistanche-Ergänzung

10. Die Abschwächung der I/R-induzierten Nierenschädigung bei PTDsbA-L-KO-Mäusen wurde durch die Überexpression von VDAC1 verringert

Um weiter zu bestätigen, ob DsbA-L-vermittelte tubuläre Schäden von VDAC1 abhängig waren, wurden die Wurfgeschwistermäuse von PTDsbA-L-WT- und PT-DsbA-L-KO-Mäusen zunächst einer I/R-Behandlung ausgesetzt und dann über die Schwanzvene injiziert mit dem VDAC1-Überexpressionsplasmid. Der I/R-induzierte Anstieg der BUN- und Kreatininspiegel wurde bei den PT-DsbA-L-KO-Mäusen verbessert; Dieser Effekt wurde jedoch durch die Überexpression von VDAC1 verhindert (Abbildung 10 a und b). HE- und TUNEL-Färbung zeigten, dass das relative Ausmaß der IR-induzierten Nierengewebeschädigung und der Nierenzellapoptose bei PT-DsbAL-KO-Mäusen verringert war und dass diese Effekte durch die Überexpression von VDAC1 blockiert wurden (Abbildung 10 cf). Immunoblotting zeigte, dass die PT-DsbA-L-KO-Mäuse geringere Mengen an gespaltener Caspase-3, geringere Mengen an Bax-Akkumulation in den Mitochondrien und geringere Raten der Cyt-c-Freisetzung in das Zytosol aufwiesen; Diese Effekte wurden jedoch durch die Überexpression von VDAC1 eliminiert (Abbildung 10 g-m). Diese Daten stützten die Tatsache, dass DsbA-L ischämische Verletzungen in einer von VDAC1 abhängigen Weise förderte.

Abbildung 10. PT-DsbA-L-KO verbesserte die IR-induzierte Nierenschädigung bei Mäusen und wurde durch die Überexpression von VDAC1 verringert. Die PT-DsbA-L-KO- und PT-DsbA-L-WT-Mäuse wurden mit oder ohne VDAC1-Plasmid behandelt und anschließend ein IR-Modell erstellt. (ein Brötchen. (b) Serumkreatinin. (c) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. (d) Repräsentative Abschnitte von TUNEL-positiven Zellen. (e) Röhrenschadensbewertung. (f) Die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen. (g) Die Immunblots analysierten die Expression von gespaltener Caspase3, VDAC1 und DsbA-L sowie die Expression von BAX und Cyt-c in mitochondrialen und zytosolischen Fraktionen. b-Tubulin und GAPDH wurden als Gesamtlysat- bzw. Zytosolbeladungskontrolle verwendet. COX IV wurde als Mitochondrien-Beladungskontrolle verwendet. (hm) Analyse des Graustufenbildes zwischen ihnen. Originalvergrößerung x 400. Narbenbalken: 100 mm. Jedes Experiment (c, d und g) wurde sechsmal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Für die Mehrfachgruppenvergleiche (a, b, e, f und h-m) wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet. # P<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.

Herba Cistanche

11. CLP-induzierte Nierenschäden wurden bei PT-DsbA-LKO- oder PT-VDAC1-KO-Mäusen abgeschwächt

Sepsis-induziertes AKI ist eine weitere häufige Ursache für AKI in der klinischen Praxis. Wurfgeschwister der Typen PT-DsbA-L oder VDAC-WT und PT-DsbA-L oder VDAC1-KO wurden dem CLP-Modell unterzogen und dann 18 Stunden nach der Operation eingeschläfert. Die Ergebnisse zeigten, dass PT-DsbA-L- oder VDAC1--KO-Mäuse die CLP-induzierten Erhöhungen der BUN- und Kreatininspiegel sowie die erhöhten Werte an Nierengewebeschäden und Nierenzellapoptose deutlich reduzierten (Abbildungen S1 und S2 a–f). ). Immunblotting bestätigte, dass PTDsbA-L- oder VDAC1-KO-Mäuse auch verringerte Mengen an gespaltener Caspase-3, geringere Mengen an Bax-Akkumulation in den Mitochondrien und geringere Raten der Cyt-c-Freisetzung in das Zytosol aufwiesen (Abbildungen). S1 und S2 g- n). Zusammengenommen zeigten diese Daten, dass sowohl DsbA-L als auch VDAC1 das Fortschreiten des septischen AKI vermittelten.

12. VAN-induzierte Nierenschäden wurden bei PT-DsbAL-KO- oder PT-VDAC1-KO-Mäusen abgeschwächt

Vancomycin (VAN)-induzierter AKI ist ebenfalls ein wichtiges Modell für AKI. Den Wurfgeschwistern von PT-DsbA-L oder VDAC1-WT und PT-DsbA-L oder VDAC1-KO wurde an sieben aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneal VAN (600 mg/kg) injiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass PT-DsbA-L- oder VDAC1-KO-Mäuse die VAN-induzierte Erhöhung des BUN- und Kreatininspiegels, die Schädigung des Nierengewebes und die Apoptose der Nierenzellen deutlich reduzierten (Abbildungen S3 und S4 und f). Immunblot-Analysen bestätigten außerdem, dass PTDsbA-L- oder VDAC1-KO-Mäuse auch verringerte Mengen an gespaltener Caspase-3, ein geringeres Ausmaß der Bax-Akkumulation in den Mitochondrien und geringere Raten der Cyt-c-Freisetzung in die Mitochondrien aufwiesen Zytosol (Abbildungen S3 und S4 g-m). Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass sowohl DsbA-L als auch VDAC1 eine VAN-induzierte AKI vermittelten.

Cistanche-Extrakt

13. DsbA-L-vermittelte I/R-induzierte Apoptose von HK-2-Zellen war mit VDAC1 assoziiert

Das obige Ergebnis ergab, dass DsbA-L an der Apoptose der BUMPT-Zellen beteiligt war. Die Funktion von DsbA in menschlichen Nierentubulizellen bleibt jedoch unklar. DsbA-L-siRNA wurde in HK2-Zellen transfiziert und dann 2 Stunden lang einer ATP-Depletion und einer 2-stündigen Erholung ausgesetzt. Die Immunoblot-Ergebnisse zeigten, dass DsbA-L-siRNA den I/R-induzierten Anstieg der Expression von gespaltener Caspase-3 und VDAC1, die erhöhte Akkumulation von Bax in den Mitochondrien und die erhöhte Produktion von Cyt-c im Zytosol deutlich verbesserte ( Abbildung S5 an-h). Die Daten legen auch nahe, dass die Rolle von DsbA-L bei der Apoptose von HK2-Zellen mit VDAC1 während der I/R-Behandlung zusammenhängt.

14. Die durch DsbA-L vermittelte I/R-induzierte Apoptose von HK-2-Zellen hängt vom VDAC1 ab

Um weiter zu überprüfen, ob die Rolle von DsbA-L bei der Apoptose von HK2-Zellen von VDAC1 abhängt. Zuerst wurden HK2-Zellen mit DsbA-L-siRNA plus mit oder ohne VDAC1-Plasmid co-transfiziert und dann 2 Stunden lang einer ATP-Depletion und einer 2-stündigen Erholung ausgesetzt. Die Immunblot-Ergebnisse zeigten, dass DsbA-L-siRNA den I/R-induzierten Anstieg der gespaltenen Caspase-3- und VDAC1-Expression, die erhöhte Akkumulation von Bax in den Mitochondrien und die erhöhte Produktion von Cyt-c im Zytosol deutlich abschwächte. Dieser Effekt wurde durch die Überexpression des VDAC1-Plasmids umgekehrt (Abbildung S6a-h). Zweitens wurden HK2-Zellen mit der VDAC1-siRNA plus mit oder ohne DsbA-L-Plasmid co-transfiziert und dann I (2 h)/R (2 h) ausgesetzt. Die Immunoblot-Ergebnisse zeigten, dass VDAC1-siRNA den I/R-induzierten Anstieg der gespaltenen Caspase-3- und VDAC1-Expression, die erhöhte Akkumulation von Bax in den Mitochondrien und die erhöhte Produktion von Cyt-c im Zytosol, diesen Effekt, deutlich verbesserte wurde durch die Überexpression des DsbA-L-Plasmids nicht verstärkt (Abbildung S7a-h). Die Daten bestätigten eindeutig, dass VDAC1 die Pro-Apoptose-Rolle von DsbA-L in HK-2-Zellen während der I/R-Behandlung vermittelte.

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h und Dongshan Zhang a,b *

eine Abteilung für Notfallmedizin, Volksrepublik China

b Institut für Notfallmedizin und schwierige Krankheiten, Zweites Xiangya-Krankenhaus, Central South University, Changsha, Hunan 410011, Volksrepublik China

c Abteilung für Augenheilkunde, Volksrepublik China

d Abteilung für Harnchirurgie, Volksrepublik China

e Abteilung für Brustchirurgie, Volksrepublik China

f Abteilung für Allgemeine Chirurgie, Zweites Xiangya-Krankenhaus, Volksrepublik China

g Abteilung für öffentliche Gesundheit, Central South University, Changsha, Hunan, Volksrepublik China

h Abteilung für Endokrinologie, Shenzhen People's Hospital, das zweite klinische medizinische College der Jinan-Universität, das erste angegliederte Krankenhaus der Southern University of Science and Technology, Shenzhen, Volksrepublik China

1 Xiaozhou Li und Jian Pan haben gleichermaßen zu dieser Studie beigetragen