Teil 1: Ein neuartiger Ansatz zur Verbesserung des regenerativen Potenzials zirkulierender endothelialer Vorläuferzellen bei Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium

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Abstrakt: Aus dem Knochenmark stammende zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) erleichtern die Gefäßreparatur in mehreren Organen, einschließlich der Niere, werden jedoch im Endstadium zunehmend verringertNierenerkrankung(ESKD)-Patienten, was mit kardiovaskulären Ergebnissen und der damit verbundenen Mortalität korreliert. Wir stellten somit fest, ob die Verstärkung der gewebereparativen Wirkungen von mesenchymalen Stromazellen aus menschlichem Knochenmark (BM-MSCs) mit den vaskulogenischen Wirkungen von rekombinantem menschlichem Relaxin (RLX) die EPC-Proliferation und -Funktion fördern könnte. CD34 plus EPCs wurden aus dem Blut von gesunden und ESKD-Patienten isoliert, kultiviert, bis sich späte EPCs gebildet hatten, dann mit BM-MSC-abgeleitetem Zustandsmedium (CM; 25 Prozent o), RLX (1 oder 10 ng/ml) oder beiden stimuliert Behandlungen kombiniert. Während RLX allein die EPC-Proliferation, die Bildung von Kapillarröhrchen und die Wundheilung in vitro stimulierte, wurden diese Maßnahmen durch die kombinierten Wirkungen von BM-MSC-abgeleitetem CM und RLX bei EPCs, die sowohl von gesunden als auch von ESKD-Patienten stammten, schneller und deutlich verstärkt. Diese Ergebnisse haben wichtige klinische Implikationen, da eine neuartige Kombinationstherapie identifiziert wurde, die die EPC-Zahl und -Funktion bei ESKD-Patienten wiederherstellen und verbessern kann.

Schlüsselwörter: endotheliale Vorläuferzellen; Nierenerkrankung im Endstadium; aus Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen; Relaxin; Wundheilung; Angiogenese; Regeneration

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1. Einleitung

Chronisches Nierenleiden(CKD) ist ein globales Gesundheitsproblem, definiert als eine Verringerung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) von weniger als oder gleich 60 ml/min/1,73 m², die häufig zu einer Nierenerkrankung im Endstadium (Stadium V) (ESKD; definiert als GFR Weniger als oder gleich 15 ml/min/1,73 m2)[2]. Zu den pathologischen Merkmalen der chronischen Nierenerkrankung gehören eine tubuläre Atrophie, die mit einer Verringerung der Nierenkapillaren und Podozyten, der Zerstörung von Nierenendothelzellen und der Entwicklung vonNierenfibrose[3,4]. Das Nierenendothel wird während dieser Prozesse beeinträchtigt, was zu einer Beeinträchtigung der Angiogenese und Nierenfunktion führt [5]. FolgendNierenschädenwerden aus dem Knochenmark stammende endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) an Verletzungsstellen rekrutiert, um die Gewebereparatur zu erleichtern [6]. EPCs spielen eine zentrale Rolle bei der Reifung und Proliferation von Nierenendothelzellen, der Gefäßintegrität und der Reparatur des beschädigten Endothels. Allerdings werden die zirkulierenden EPC-Zahlen bei ESKD-Patienten zunehmend reduziert [7-9], was mit nachteiligen kardiovaskulären Folgen [9,10] und langfristiger Sterblichkeit korreliert.

Von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) wurde berichtet, dass sie die Angiogenese fördern, indem sie die EPC-Programmierung stimulieren. Während MSCs in verschiedenen klinischen Studien evaluiert wurden [13], wurde ihre Fähigkeit, die Regeneration des Nierenendothels zu erleichtern, nicht untersucht. Jüngste Studien aus unserem Labor haben das verbesserte therapeutische Potenzial der Kombination von aus menschlichem Knochenmark (BM) stammenden MSCs mit einem antifibrotischen Mittel, nämlich rekombinantem menschlichem (Gen-2)-Relaxin (Serelaxin; RLX[14), zur Besserung identifiziert Nierenschäden,Entzündungund Fibrose in vorklinischen Krankheitsmodellen. Während RLX allein die EPC-Proliferation aus menschlichem Blut und die Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) in vitro und die Vaskulogenese bei Mäusen in vivo stimulieren kann[18], bleibt unbekannt, ob seine kombinierten Wirkungen mit BM-MSCs EPC beschleunigen und/oder verstärken könnten. abgeleitete Angiogenese und Wundheilung. Diese Studie bewertete daher das therapeutische Potenzial der Kombination von RLX- und BM-MSC-abgeleiteten konditionierten Medien (CM) bei gesunder versus ESKD-Patienten-abgeleiteter EPC-Proliferation, Angiogenese und Wundheilung in vitro.

2. Materialien und Methoden

2.1. EPC-Isolierung und Kultur aus peripherem Blut

Nach Erhalt einer unterschriebenen Einwilligungserklärung des Patienten wurden etwa {{0}} ml Blut von gesunden männlichen Kontrollpersonen vom Australian Red Cross Blood Service entnommen. Im Gegensatz dazu wurden von männlichen ESKD-Patienten aufgrund ihres Gesundheitszustands nur maximal ~5 ml Blut aus dem Monash Medical Center entnommen. Alle Blutproben wurden innerhalb von 24 h nach der Entnahme verarbeitet. Alle Blutproben wurden mit 1× Hank's ausgewogener Salzlösung (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) auf ein Gesamtvolumen von 2 0 ml verdünnt. Dann wurde das Blut vorsichtig über 15 ml Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Schweden) in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) geschichtet und bei 400× zentrifugiert g für 40 Minuten bei Raumtemperatur, um den Buffy Coat von anderen Komponenten zu trennen, indem ein Dichtegradienten-Trennverfahren verwendet wird, wie zuvor beschrieben [19,20]. Nach der Gradiententrennung wurde die Plasma und Blutplättchen enthaltende obere Schicht durch vorsichtiges Einführen einer serologischen Pipette entfernt, wobei der Leukozytenfilm, der mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) enthielt und aus endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) bestand, ungestört blieb. Das Pellet wurde in 2 ml Endothelial Cell Growth Media (EGM)-2 Microvascular (MV)Bullet Kit (Produkt #CC-3162, Lonza, Hayward, CA, USA) resuspendiert; ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS), 0,04 % Hydrocortison, 0,4 % humanem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (hFGF) und 0,1 % vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), R3-insulinähnlichem Wachstumsfaktor (IGF )-1, Ascorbinsäure, menschlicher epidermaler Wachstumsfaktor (hEGF) und Gentamicinsulfat/Amphotericin (GA-1000), um isolierte EPCs zu kultivieren. Die Zellen wurden unter Verwendung eines CountessM Automated Cell Counter (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gezählt, bevor sie auf mit Fibronectin beschichtete Kulturplatten/Kolben ausgesät wurden.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 Zellen/Kolonie) unter Verwendung des Assays der Koloniebildenden Einheit (CFU).

2.2. Herstellung von konditionierten Medien (CM) aus kultivierten BM-MSC

Da die Zugabe von BM-MSCs zu EPC-Kulturen die zu messenden EPC-assoziierten Endpunkte beeinträchtigen würde, wurde entschieden, dass es besser wäre, die Auswirkungen von BM-MSC-abgeleitetem CM auf die EPC-Funktion zu analysieren, wie es zuvor für die Analyse verwendet wurde anderer Endpunkte [19]. Kurz gesagt, BM-MSCs wurden in Alpha-Minimum Essential Media (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australien) gezüchtet, ergänzt mit 16 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % 200 mM L-Glutamin und 1 Prozent Penicillin/Streptomycin. Sobald die Zellen ~80 % Konfluenz erreichten, wurden BM-MSCs weiter subkultiviert und in einer 12--Well-Platte mit einer Dichte von ~0,5 × 10 Grad pro Well ausplattiert und für 24-48 h in Kultur gehalten Zellbindung zu gewährleisten. Um konditionierte Medien (CM) aus BM-MSCs herzustellen, wurden die Zellen kurz dreimal mit vorgewärmtem 1 ml 1 × HBSS gewaschen. Nach den Waschschritten werden 500 μl Serum und wachstumsfaktorfreies Endothelzellen-Basalmedium（EBM; Produkt #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA) wurde zu den Zellen gegeben und weitere 24 h bei 5 % CO, 37 Grad in Kultur gehalten. Am Ende dieser Inkubationszeit wurde CM gesammelt und 10 Minuten lang bei 400 × g zentrifugiert, um jegliche Zelltrümmer zu entfernen. CM in 500-μl-Aliquoten wurde bis zur zukünftigen Verwendung bei -80 Grad gelagert.

2.3. Funktionelle Assays

2.3.1. Behandlung von kultivierten späten EPCs

Sobald die späten EPCs geerntet waren, wurden funktionelle Assays durchgeführt. Alle Experimente wurden in den Passagen 3-6 durchgeführt. Es wurden funktionelle Assays durchgeführt, um die Wirkung von (i) 25 % BM-MSC-abgeleiteten konditionierten Medien (25 % CM)[20]; (ii) 1 [RLX-1] oder 10 [RLX-10 ] ng/ml [18] RLX (repräsentiert zirkulierende Spiegel von H2-Relaxin, die bei schwangeren Frauen gefunden wurden [21]); oder (i) die kombinierten Wirkungen von 25 Prozent CM und 1 oder 10 ng/ml RLX; (iv) 20 Prozent FBS wurden als Positivkontrolle auf das Proliferations- und Röhrenbildungs(angiogene)-Potenzial der späten EPCs verwendet, die von Kontrollpatienten stammten . Behandlungsgruppen wurden mit unbehandelten Zellen verglichen.

2.3.2.Viabilitäts- und Proliferationsassay

Die Lebensfähigkeit und das proliferative Potenzial der späten EPCs wurden unter Verwendung des {{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australien). Kurz gesagt wurden ~5 × 10 3 Zellen pro Vertiefung in 96--Well-Platten (BD Falcon, North Ryde, NSW, Australien) ausgesät, wonach die Zellen mit BM-MSC-abgeleitetem CM, RLX (10 ng/ ml) oder eine Kombination aus CM und RLX bei 1 oder 10 ng/ml für 24 h. Am Ende der Inkubationszeit wurden 10 μl MTT-Markierungsreagenz hinzugefügt (0,5 mg/ml, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australien) und weitere 4 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden durch die Zugabe von 100 μl der Solubilisierungslösung (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia) solubilisiert, und das Proliferationspotential der späten EPCs wurde durch Messen der Extinktion jeder Probe bei 590 nm unter Verwendung einer Mikroplatte bestimmt Reader (Bio-Strategy, Balwyn North, VIC, Australien) und mit der Software SoftMax Pro für Windows OS (Ver. 7.3, Molecular Devices LLC, CA, USA) analysiert. Jede der Behandlungsgruppen wurde in sechs Wiederholungen durchgeführt und analysiert.

2.3.3. Röhrchenbildungsassay

Die Wirkungen der verschiedenen Behandlungen zur Förderung des angiogenen Potenzials der späten EPCs unter Verwendung eines Röhrchenbildungsassays wurden unter Verwendung des μ-Angiogenese-Assays (Abidi, Fitchburg, WI, USA) bestimmt. Kurz gesagt, 10 μl Wachstumsfaktor-reduziertes (GFR) Matrigel (Produkt Nr. 356231, Corning, Tewksbury, MA, USA) wurden in die innere Vertiefung des μ-Objektträgers des Angiogenese-Assay-Kits (Abidi, Fitchburg, WI, USA) gegeben ). Konfluente Kulturen der späten EPCs wurden auf die beschichteten Zellen ausgesät und mit BM-MSC-abgeleitetem CM, RLX (10 ng/ml) oder einer Kombination aus CM und RLX mit 10 ng/ml behandelt. Ein Gesamtvolumen von 50 &mgr;l Zellsuspension mit ~1 × 10 4 Zellen wurde in jede Vertiefung gegeben. Bilder wurden sofort aufgenommen und als 0-Stunden-Zeitpunkt gekennzeichnet. Die Fähigkeit der Zellen unter verschiedenen Behandlungen zu

Formröhrchen wurden beobachtet und Bilder wurden um 2-24 h nach der Zellaussaat unter Verwendung eines Lichtmikroskops aufgenommen. Die Anzahl der Röhren, die Röhrenlänge und die Anzahl der Verzweigungspunkte wurden unter Verwendung der ImageJ-Software bestimmt.

2.3.4.Wundheilungstest

Die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf das regenerative Potenzial der späten EPCs wurden mit einem Wundheilungsassay bestimmt. Zur Durchführung des Assays wurden ca. 1 × 10 Zellen in 50 μl Wachstumsmedium suspendiert und für den Wundheilungsassay in Silikon mit 2 Vertiefungen in einer 35-mm-Schale ausgesät (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA). Künstliche Wunden in den Schalen wurden durch vorsichtiges Entfernen der Silikonvertiefungen mit einer sterilen Pinzette (Spaltabstand =500 ± 100 μm) erzeugt. Die Schalen wurden mit 2 ml 50-prozentigem EGM-2 unter Zugabe verschiedener aufgefüllt Behandlungen einschließlich BM-MSC-abgeleitetem CM, RLX (10 ng/ml) oder einer Kombination aus CM und RLX bei 1 oder 10 ng/ml. Die Anzahl der Zellen, die migrierten, um die Wunde zu schließen, wurde unter Verwendung von Lichtmikroskopie bewertet migrierte Zellen wurden 0-24 h nach der Behandlung eingefangen. Der Prozentsatz der Lückenschließfläche wurde unter Verwendung der Image]-Software bestimmt.

2.3.5.Bildanalysen

Alle Bildanalysen für die funktionellen Assays wurden mit ImageJ für MacOS (Ver. 1.8, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) durchgeführt. Für das Röhrenbildungspotential der späten EPCs wurden die Bilder unter Verwendung des Angiogenese-Assay-Plugins analysiert und vier verschiedene Parameter aufgezeichnet, einschließlich Gesamtlänge, Anzahl der Maschen, Anzahl der Verbindungen und Anzahl der Verzweigungen. Für den Wundheilungsassay wurde der Wundverschlussbereich analysiert, indem der zellfreie Bereich zu jedem der Zeitpunkte manuell markiert wurde. Alle Messungen wurden mindestens dreimal durchgeführt, um die Schwankungen zu kontrollieren.

2.3.6. Immunfluoreszenz

Die Proteinlokalisierung des Peptidrezeptors 1 der Relaxin-Familie (RXFP1; der verwandte RLX-Rezeptor) in kultivierten späten EPCs wurde unter Verwendung von Immunfluoreszenzfärbung bestimmt. Zunächst wurden ~1 × 1{{20}}-Grad-Zellen, die auf einem 13-mm-Glasdeckglas (mit Poly-D-Lysin beschichtet) in einer 12--Well-Platte gezüchtet wurden, in 4 % PFA für fixiert 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die fixierten Zellen wurden für unspezifische Proteinbindung unter Verwendung von 1 Prozent Rinderserumalbumin (BSA) für 60 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Zellen in PBS für 5 min (dreimal) gewaschen und mit einem polyklonalen Kaninchen-RXFP1-Antikörper (aa 609-624; A 9227; 1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Deutschland) inkubiert )in 0,01 Prozent BSA über Nacht bei 4 Grad. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit Ziege-anti-Kaninchen-Alexa-fluor 594-Sekundärantikörper (1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Australien) in 0,01 % BSA für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Kerngegenfärbung wurde durch Zugabe von 40 &mgr;l DAPI in Vectashield-Eindeckmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) und Eindecken durchgeführt. Das immunreaktive RXFP1-Protein wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops bei 40-facher Vergrößerung (Olympus BX51) sichtbar gemacht, und die Bilder wurden unter Verwendung der ImageJ-Software zusammengeführt.

2.4. Statistische Analysen

Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM gezeigt und alle statistischen Analysen wurden unter Verwendung von GraphPad Prism'M (Ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt. Eine Weg-ANOVA wurde verwendet, um die Wirkung verschiedener Behandlungen auf die Proliferation (MTT-Assay) und das angiogene Potenzial (Röhrenbildungsassay) der späten EPCs zu vergleichen, gefolgt von einem Post-hoc-Test nach Tukey, um mehrere Vergleiche zwischen den Behandlungsgruppen zu ermöglichen. Eine Zweiweg-ANOVA mit wiederholter Messung wurde verwendet, um die Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf den Wundverschluss durch die späten EPCs im Laufe der Zeit zu vergleichen, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test, um jede der Behandlungsgruppen zu vergleichen. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.