Teil 2: Bioaktive Verbindungen aus Ephedra Fragilis: Extraktionsoptimierung, chemische Charakterisierung, Antioxidans- und Antiglykationsaktivitäten
Mar 26, 2022
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2.7.Antiglykationsaktivität
2.7.1. UV-Vis-Analyse
Das UV-Vis-Spektrum ist eine schnelle, konsistente und einfache Technik, die häufig zum Nachweis von Protein-Konformationsänderungen und Komplexbildung verwendet wird. Die Absorptionsspektren von nativem und glykiertem BSA, inkubiert für 15 Tage in Gegenwart oder Abwesenheit von CEE/Fraktionen sowieQuercetin(Positivkontrolle) sind in Abbildung 3A dargestellt.
Es wurde deutlich gezeigt, dass das native BSA einen charakteristischen Peak bei 入2s0 nm aufweist, der hauptsächlich auf die aromatischen Aminosäuren, einschließlich Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin, zurückzuführen ist [47].
Nach Modifikation mit Glucose war die Absorption bei λ280 nm 60,57 % hyperchromer als natives BSA. Die erhöhte Absorptionsintensität bei 入2s0 nm kann der glykationsinduzierten Entfaltung der Proteinhelix zugeschrieben werden, die ihre normale physiologische Funktion beeinträchtigen kann.
Treatment with CEE/fractions reduced significantly the absorbance at入2so nm compared to glycated BSA, and this reduction varied markedly between fractions according to the solvent polarity. Overall, descending antiglycation activity was portrayed as EAF>WBF>DMF>CCE>WF>HE, die 1,82, 1,71, 1,57, 1,35, 1,28 und 1,13--fach niedriger waren als glykiertes BSA. Dennoch war diese Aktivität deutlich geringer als die vonQuercetinals Positivkontrolle verwendet (2,24--fach niedriger als glykiertes BSA). Aus Absorptionsstudien kann somit eindeutig geschlossen werden, dass EAF aus E.fragilis eine schützende Wirkung gegen die durch Proteinglykation induzierte BSA-Entfaltung besitzt.
2.7.2. Hemmung der Proteinglykation im BSA-Glu-Modell
AGEs sind eine heterogene Gruppe von Verbindungen mit Fluoreszenzeigenschaften bei λ440 nm, wenn sie bei 370 nm angeregt werden. Die Fähigkeit von CEE und seinen verschiedenen Fraktionen aus E. fragilis, die Bildung von AGEs zu hemmen, wurde mit dem BSA-Glucose-Assay bewertet, und die Ergebnisse sind in Abbildung 3B dargestellt.
Wie aus Fig. 3B hervorgeht, zeigte die AGE-Inhibitionsrate aller getesteten Proben einen Aufwärtstrend mit steigenden Konzentrationen. Bei 1 mg/ml hemmten CCE, HE, DME, EAE, WBF, WF und Quercetin die AGE-Bildung um 53,26, 39,83, 54,82, 76,68, 69,09, 48,83 bzw. 97,84 Prozent nach der Inkubation für 15 Tage. Der EAF (ICs =0.375±0.034 mg/ml) war der wirksamste AGE-Inhibitor unter allen Fraktionen, gefolgt von WBF, DMF, CCE und WF mit IC5 0-Werte von 0,595 ± {{30}},047, 0,857 ± 0,018, 0,951 ± 0,099 und 1,044± 0,032 mg/ml. HF zeigte die schwächste Aktivität mit einem ICso-Wert von 1,212 ± 0,063 mg/ml.
Das HochAntiglykierungDas Potenzial von EAF könnte auf den hohen Gehalt an Phenolen und Flavonoiden zurückzuführen sein, die als sehr gute Inhibitoren der AGE-Bildung beschrieben wurden [48]. Eine höhere Antiglykierung des EAF von Liquidambar formosana Hance-Blattextrakt wurde auch von Zhang et al. [31]im Vergleich zu seinen Dichlormethan-, n-Butanol- und Wasserfraktionen.
Wie in Tabelle 5 angegeben, korrelierte die AGE-Hemmung stark und positiv sowohl mit TF(r=0.950;p<0.01)and tp(r=""><0.01)contents, which="" were="" in="" line="" with="" previously="" reported="" studies="" [2,29].="" the="" ages="" inhibition="" was="" also="" correlated="" in="" a="" positive="" way="" to="" dpph",abts,h2o2,reducing="" power,="" tac,andβ-carotene="" assays="" withr="">
r=0.914, r=0.983, r=0.975, r=0.923 und r=0.963 (S<0.01),respectively. these="" reflected="" that="" ages="" inhibition="" is="" linked="" to="" the="" efficiency="" of="" primary="" antioxidants="" [6].="" kaewseejan="" and="" siriamornpun="" [29]="" also="" reported="" that="" phenolic="" compounds="" prevented="" the="" formation="" of="" ages="" through="" its="">freie Radikale abfangenundAntioxidansKapazitäten.
2.7.3. Auswirkungen auf die durch Glykation induzierte Proteinoxidation
Die Glykierung von Proteinen (Maillard-Reaktion) ist eine Reaktion, die durch die kovalente Bindung von reduzierendem Zucker an eine Aminogruppe von Proteinen (hauptsächlich Lysin- und Argininreste) gestartet wird, was zur Bildung eines instabilen und reversiblen Produkts führt, dh einer Schiffschen Base, die weiter einer Amadori-Umlagerung unterzogen wird um stabilere Ketamin-Produkte mit dem Namen Amadori zu bilden. Anschließend werden Amadori-Produkte einer Endiol-Reaktion unterzogen, um carbonylierte Proteine herzustellen [48]. Der Abbau dieses Ketamins könnte entstehenfreie RadikaleB. Superoxidradikale, die über die Fenton-Reaktion weiter in HO·umgewandelt werden und oxidative und zelluläre Schäden verursachen [49].
Protein oxidation is accompanied by carbonyl protein formation and loss of protein thiols, which are often employed as protein oxidation indicators[50]. As given in Figure 3C, the level of carbonyl content in native BSA was 1.16±0.04 nmol/mg protein, which was increased to more than 3.62-fold (4.21 ± 0.10 nmol/mg protein) upon glycation. The treatment with CEE and its various fractions reduced the level of carbonyl content with the increase of samples concentrations ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Furthermore, the inhibition effect of quercetin on the formation of carbonyl proteins was stronger than that of all fractions at every concentration point. When the concentration was 1 mg/mL, CEE, HF, DMF, EAF, WBF, WF, and quercetin decreased the level of carbonyl content by 42.29, 17.37,58.68,73.44,69.17,28.84,and 98.68%, respectively, compared to native BSA. Overall descending, the inhibition of carbonyl content formation was portrayed as Q>EAF>WBF >DMF > CCE> WF >HF.
Die Auswirkungen von CEE/Fraktionen auf die glykierungsinduzierte Proteinthioloxidation sind in Abbildung 3D dargestellt. In nativem BSA betrug der Gehalt an Proteinthiol 1,06±0,086 nmol/mg Protein, was um mehr als das Dreifache verringert war (0 0,34 ± 0,021 nmol/mg Protein) in glykiertem Protein. In Gegenwart von CEE/Fraktionen war der Gehalt der Thiolgruppe dosisabhängig im Bereich von 0,1 bis 1 mg/ml signifikant erhöht. Darüber hinaus stieg der Gehalt an Proteinthiol in der folgenden Reihenfolge: HF<><><><>
Ähnliche Ergebnisse wurden in der Pflanze Teucrium polium beobachtet, da der EAF wirksamer als die anderen Fraktionen (Diethylether- und Wasserfraktionen) gegen die durch Glykation vermittelte Proteinoxidation war[51]. Auch Golshahi und Bahramikia [52] berichteten in ihrer Studie über ähnliche Ergebnisse bei der Verwendung mehrerer Lösungsmittel mit zunehmender Polarität (Diethylether und Wasser) bei der Spaltung einer Heilpflanze Trachyspermum copticum. Laut diesen Autoren hat der EAF die stärkste Schutzwirkung gegen Glykations-vermittelte Proteinoxidation, mit Abstand gefolgt von Diethylether und Wasser. Dies zeigt das Vorhandensein solcher Verbindungen in EAF, die eine vorbeugende Wirkung gegen durch Hyperglykämie induzierte oxidative Schäden an Proteinen besitzen könnten, von denen angenommen wird, dass sie unter den Glykoxidationsprozessen auftreten, indem sie die Proteincarbonylbildung reduzieren und Proteinthiole vor Oxidation schützen, wie die Daten vermuten lassen.
2.8.Identifizierte Phenolverbindungen im EAF
Der EAF, der die höchste biologische Aktivität von anderen Fraktionen zeigte, wurde für die Identifizierung seiner wichtigsten bioaktiven Verbindungen durch RP-HPLC ausgewählt. Insgesamt sechs Verbindungen wurden identifiziert, indem ihre Retentionszeit mit der von Referenzstandards verglichen wurde. Die identifizierten Phenolverbindungen sind in Abbildung 4 dargestellt. Gallus-, Vanillinsäure, Kaffee- und Ferulasäure wurden als Phenolsäuren identifiziert, während nur zwei Verbindungen, nämlich Rutin und Quercetin, als Flavonoide identifiziert wurden. Laut einer Studie von Soumaya et al. [53], Ferulasäure, Luteolin-7--O-Glucosid, Myricetin und Kaempferol 3--O-Rutinosid wurden im EAF von oberirdischen Teilen des tunesischen E. fragilis als vorhanden identifiziert, wohingegen das Vorhandensein von Rutin , Quercetin, Gallussäure und Koffeinsäure wurden nur in unserer Studie zum ersten Mal nachgewiesen. Die Ungleichheit in der chemischen Zusammensetzung des aus derselben Pflanzenart gewonnenen EAF kann sich in verschiedenen Teilen einer Pflanze, dem Stadium der Pflanzenentwicklung, den Wachstumsbedingungen (z. B. Boden, Licht, Temperatur, Wasser, Feuchtigkeit und Düngemittel) unterscheiden. Erntezeit, das Trocknungssystem und das Extraktionsverfahren [54]. Die erhaltenen Ergebnisse aus dem phytochemischen Fingerabdruckprofil zeigten eine gute Fülle von E. fragilis, die mehrere phenolische Verbindungen aufwiesen, die als Hauptbeitragende zu den Aktivitäten zum Abfangen freier Radikale und zur antioxidativen Aktivität angesehen werden [55]. Darüber hinaus sind diese Verbindungen für ihre starken Antiglykationskapazitäten bekannt [48]. Mehrere Studien haben den direkten Zusammenhang zwischen den antioxidativen Aktivitäten von Phenolverbindungen und ihren Antiglykationskapazitäten aufgezeigt.
2.9. Molekulare Docking-Studie identifizierter Verbindungen
Um den detaillierten Mechanismus, durch den die identifizierten Verbindungen im EAF von E. fragilis an BSA und RAGE binden, deutlich zu machen, führten wir eine molekulare Docking-Studie durch. Die Docking-Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt, während die Wechselwirkungen zwischen der aktivsten Verbindung und den Zielen in Abbildung 5 gezeigt sind. Die Ergebnisse zeigten, dass Quercetin genau in die Bindungsstelle passte, die sich in der hydrophoben Kavität der Subdomäne IB von BSA mit der niedrigsten Bindungsenergie von { {2}}.7 kcal/mol (Abbildung 5A). Im Gegensatz dazu wurde mit Ferulasäure, Vanillinsäure, Kaffeesäure, Gallussäure und Rutin (-6.35, {{7}) eine geringere Bindungsenergie erzielt. }.05, -5.84, -5.25 bzw. -4.41 kcal/mol). Normalerweise ist ein hohes Maß an Negativität der Bindungsenergie effektiver und die Verbindung würde zur Steuerung der Glykationsprozesse verwendet werden. Aus Abbildung 5B geht hervor, dass Quercetin acht Wasserstoffbrückenbindungen mit SER109, ASP111, LEU112, LEU115, ARG144, ARG185 und ARG458 von BSA und vier hydrophobe Wechselwirkungen bildet, die durch die aliphatischen Aminosäuren (PRO110, PRO113, LYS114 und ARG144) vermittelt werden. . Außerdem interagierten vier Aminosäuren (ASP108, HIS145, LEU189 und LEU462), die Quercetin umgeben, über Van-der-Waal-Kräfte. Es wurde berichtet, dass Lysin und Arginin die wichtigsten Aminosäurereste sind, die am Glykationsprozess beteiligt sind [56]. Daher könnte die Maskierung von Quercetin zu Lysin- und Argininresten einer der möglichen Mechanismen von E. fragilis sein, um die Proteinglykation in einem Anfangsstadium zu hemmen.
![. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively](/Content/uploads/2022842169/202203241046127d567c69ab264671b6814abd1b4544c7.png ". The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively")
Es ist bekannt, dass die Bindung von AGEs-Produkten an RAGE durch ROS-Bildung über NADPH-Oxidase und Mitochondrien [57] die Aktivierung mehrerer intrazellulärer Signalwege (einschließlich JAK/STAT, Phosphoinositol-3-Kinase, rho-GTPasen, SAPK/INK) auslöst MAP-Kinasen, p38 und erk1/2 (p44/p42) MAP-Kinasen) und gipfelt in der Aktivierung der NF-kB-Transkriptionsfaktoren [58], was zur Pathogenese von Diabetes und altersassoziierten Erkrankungen führt [5]. Daher kann die Blockierung der AGEs-RAGE-Interaktionen die stressauslösende Signaltransduktion unterdrücken, was als therapeutische Strategie zur Hemmung der Glykation in einem späteren Stadium angesehen wird. Docking-Ergebnisse mit RAGE, wie in Tabelle 6 gezeigt, bewiesen, dass Gallussäure den höchsten Docking-Score (G=-6,8 kcal/mol) im Vergleich zu denen von Vanillinsäure, Ferulasäure, Kaffeesäure, Quercetin und Rutin (-6.68, -5.94, -5.89, -5.58 bzw. -4.89 kcal/mol). Darüber hinaus zeigte die 2D-Modellierung von Gallussäure und RAGE, dass Gallussäure fünf herkömmliche Wasserstoffbrückenbindungen mit CYS38, GLY40, ALA41, LYS43 und SER83 von RAGE bildete (Abbildung 5C, D). Außerdem waren LYS37 und LYS43 für die hydrophoben Wechselwirkungen von Gallussäure mit RAGE verantwortlich. Fünf die Gallussäure umgebende Aminosäuren (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81 und GLY82) wurden durch van-der-Waals-Kräfte gebunden, wodurch der Gallussäure-RAGE-Komplex stabilisiert wurde, indem eine stark kohäsive Umgebung bereitgestellt wurde. Zusammenfassend hat die aktuelle Studie die effiziente Wechselwirkung bestimmter bioaktiver Verbindungen im EAF von E. fragilis mit den Zielproteinen von BSA und RAGE gezeigt. E. fragilis könnte eine Quelle potenzieller Konkurrenten für Glucose und AGEs sein, die ihnen widerstehen könnten an BSA bzw. RAGE binden und dadurch die nachfolgende Entwicklung von oxidativem Stress und Entzündungen reduzieren (Abbildung 6).
3. Materialien und Methoden
3.1. Chemikalien und Reagenzien
22-Azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)(ABTS), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Natriumazid, Guanidinhydrochlorid, Tween-40,1,{ {7}}Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Folin-Ciocolteau-Reagenz, -Carotin, Linolsäure, Glucose, 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH),5,5'-Dithiobis-({{16 }}Nitrobenzoesäure (DTNB), Ammoniummolybdat und Polyphenolstandards wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Wasserstoffperoxid (H2O2) wurde von Fluka (Basel, Schweiz) bezogen. Aluminiumchlorid (AICl3), Natriumcarbonat (NazCO3), Eisenchlorid (FeCl3), Kaliumpersulfat (K2S2Os), Kaliumferricyanid (K3Fe(CN)6), Schwefelsäure und alle Lösungsmittel wurden von Merck Life Science (Darmstadt, Deutschland) bezogen ). Ascorbinsäure und Trichloressigsäure (TCA) wurden von Scharlau (Barcelona, Spanien) bezogen.
3.2.Pflanzenmaterialien
E. fragilis (Luftteile) wurde im Mai 2019 in Dour Lagfifat, Oulad Teima, Taroudant, Marokko (Breite 30 Grad 24'0" N; Länge 9 Grad 12'36" W) gesammelt wurde von Professor Najat ELKHIATI, einem Botaniker unseres Instituts, identifiziert, wo eine Sammlung von Belegexemplaren hinterlegt wurde. Die Pflanze wurde mit destilliertem Wasser gespült, luftgetrocknet, in einem Mixer pulverisiert und bis zur Verwendung bei 49°C gelagert.
3.3.Experimentelles Design
3.3.1.Auswahl von Variablen
Es ist bekannt, dass viele Parameter signifikante Auswirkungen auf die Extraktion von Phenolverbindungen haben, wie z. B. der Lösungsmitteltyp, die Lösungsmittelkonzentration, die Extraktionszeit und die Extraktionstemperatur [59]. Verschiedene Lösungsmittel wie Aceton, Methanol und Ethanol sind für die Extraktion verschiedener Phenolverbindungen geeignet [16], aber Ethanol wurde in dieser Studie aufgrund seiner Lebensmittelsicherheit und umweltfreundlichen Herstellung als Lösungsmittel ausgewählt [60]. Daher wurden alle Faktoren, einschließlich der Ethanolkonzentration (X), der Extraktionstemperatur (X2) und der Extraktionszeit (X3) als Variablen ausgewählt.
3.3.2. BBD zur Extraktionsoptimierung
Unter Verwendung von RSM wurde ein Optimierungsverfahren entwickelt, um die Auswirkungen von Extraktionsfaktoren zu bestimmen und die optimalen experimentellen Extraktionsbedingungen der phenolischen Verbindung von E. fragilis auszuwählen. Eine dreistufige Drei-Faktor-BBD wurde durchgeführt, um den Einfluss von drei unabhängigen Faktoren zu untersuchen, darunter X1 (Ethanolkonzentration, Prozent), X (Extraktionstemperatur, Grad) und X3 (Extraktionszeit, h) auf den TP- und TF-Gehalt von E, fragilis-Extrakten [17]. Zu Optimierungszwecken wurden insgesamt 15 Versuche mit drei zentralen Punkten nach dem Zufallsprinzip durchgeführt (Tabelle 1). Basierend auf unserem vorläufigen Einzelfaktor-Experiment (Daten nicht gezeigt) wurden alle Variablen auf drei Ebenen gesetzt (-1, 0 und plus 1), mit X, (40,60 und 80 Prozent), X , (25, 42,5 und 60 Grad) und X3 (6, 15 und 24 h) (Tabelle 1). Die folgende Polynomgleichung zweiter Ordnung (Gleichung (1)) wurde verwendet, um die Antwortvariablen anzupassen:
wobei Y die vorhergesagte Antwort ist; Ö, ; Ich und ; sind die Regressionskoeffizienten für Schnittpunkt-, lineare, quadratische bzw. Interaktionsterme; und X; und X; sind die unabhängigen Variablen (i ≠ j).
3.3.3. Extraktionsverfahren
Die pulverisierte Probe (10 g) wurde durch Mazerationsverfahren in einer bestimmten Ethanolkonzentration (40-80 Prozent; 1:10, w/v) bei unterschiedlichen Temperaturen (25-60 Grad) für verschiedene Zeiträume ({ {5}} h) auf einem Orbitalschüttler-Inkubator (160 U/min). Gaze und Whatman-Filterpapier Nr. 1 wurden verwendet, um die unlösliche Masse zu entfernen. Das Filtrat wurde dann bei 40 Grad unter niedrigem Druck unter Verwendung von R-3 Rotavapor (Büchi) getrocknet, um den rohen ethanolischen Extrakt (CEE) zu ergeben.
3.4. Fraktionierung des unter optimalen Bedingungen erhaltenen CEE
Das unter optimalen Bedingungen erhaltene CEE wurde in destilliertem Wasser (100 ml) solubilisiert und eine Flüssig-Flüssig-Extraktion wurde mit verschiedenen Lösungsmitteln zunehmender Polarität durchgeführt, um eine Hexanfraktion (HF, 3 × 100 ml), eine Dichlormethanfraktion (DMF, 3 × 100 ml) zu ergeben mL), Ethylacetat-Fraktion (EAF.3×100 mL), eine wassergesättigte n-Butanol-Fraktion (WBF, 3× 100 mL),
und der verbleibende Wasseranteil (WF). Diese Fraktionen wurden dann wie oben beschrieben filtriert und getrocknet und die Extraktionsausbeute gemäß Gleichung (2) aufgezeichnet:
Wo und W sind das Gewicht von getrockneten CEE/Fraktionen und das Anfangsgewicht von E. fragilis-Pulver; beziehungsweise.
3.5. Phytochemische Analyse
Die spektrophotometrischen Techniken, die zur Bewertung des phytochemischen Inhalts von E. fragilis-Extrakten verwendet werden, sind in den ergänzenden Materialien [61,62] detailliert beschrieben.
3.6. Biologische Aktivitäten
Einzelheiten zu den Antioxidans-[43,63-67]- und Antiglykationsaktivitäten [68-70]-Tests in vitro wurden in den ergänzenden Materialien angegeben.
3.7. RP-HPLC-Analyse von EAF
Die Analyse von Phenolverbindungen im EAF wurde mit Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) durchgeführt, das mit einer analytischen ZORBAX Eclipse SB-C18-Umkehrphasensäule von 100 × 4 mm und 3,5 μm ausgestattet war Partikelgröße [71]. Die Säulentemperatur wurde konstant bei 48 Grad gehalten. Isokratische Elution mit Acetonitril, 0,1 Prozent Essigsäure in Wasser (12:88, v/v) als mobile Phase und 1 ml/min Flussrate stellten eine gute Trennung von Polyphenolen im EAF von E. fragilis sicher. Das injizierte Volumen betrug 10 μl und Chromatogramme wurden bei 330 nm gemessen. Die Retentionszeiten von phenolischen Verbindungen im EAF wurden mit denen von rein verfügbaren Standards verglichen, um sie zu identifizieren.
3.8. Molekulares Andocken
AutoDock Tools (ADT) Version 1.5.6 wurde verwendet, um eine molekulare Docking-Studie durchzuführen. Das SDF-Format aller Verbindungen wurde von der PubChem-Datenbank erhalten und dann unter Verwendung von Open Babel GUI (Version 2.4.1) in eine 3Dpdb-Datei konvertiert. Die Kristallstrukturen von BSA (PDB ID: 4ORO) und RAGE (PDB ID: 4LP5) wurden von der RCSB Protein Data Bank (PDB) gesammelt. Kurz gesagt wurden die Proteine zunächst für das Andocken vorbereitet, indem (i) alle Heteroatome und Wassermoleküle entfernt, (i) polare Wasserstoffatome hinzugefügt und (ii) Kollman-Ladungen zugewiesen wurden. Die Abmessungen des Rasterfelds wurden auf x{{10}},y=126,z=126 und x=80,y=80.Z{{ 15}} mit Rasterzentrum von ×=8.415,y=21.626,z=106.57 und x=37.98,y=-43.581 ,z=9.371 mit einem Gitterabstand von 0,375 Å, der um die Bindungsstelle von BSA bzw. RAGE herum erzeugt wurde. Die Docking-Software wurde 100 Mal unter Verwendung des Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) ausgeführt, um die beste Bindungspose zu finden. Der Ligand mit der niedrigsten Bindungsenergiebewertung wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Zur Visualisierung der Andockergebnisse wurde die Software Discovery Studio Version 2020 (BIOVIA, San Diego, CA, USA) verwendet.
3.9. Statistische Analyse
Zur Durchführung von RSM wurde die Design-Expert-Softwareversion 119 (Stat-Ease Inc. und Minneapolis, MN, USA) verwendet. Die Datenanalyse wurde durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Duncans Post-Hoc-Test unter Verwendung von SPSS 26.0(IBM Co., USA);p<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" pearson="" correlation="" analysis="" was="" conducted="" to="" investigate="" correlations="" between="" variables="" and="" their="" significance.="" all="" graphics="" were="" constructed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0="" software="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" all="" experiments="" were="" conducted="" in="" triplicate="" and="" presented="" as="" mean="" values="" ±standard="" deviation="">
4. Schlussfolgerung
RSM mit einem BBD wurde eingesetzt, um die optimierten Parameter für die Extraktion der bioaktiven Verbindungen aus der marokkanischen Heilpflanze E. fragilis einzustellen. Die optimale Ethanolkonzentration, Extraktionstemperatur und Extraktionszeit wurden für das Maximum vorhergesagt
Extraktionsausbeute von phenolischen Verbindungen und betrug 61,93 Prozent, 44,43 Grad C bzw. 15,84 Stunden. Das unter optimalen Extraktionsbedingungen gewonnene CEE und seine verschiedenen Fraktionen wurden auf ihre TP- und TF-Gehalte sowie deren Gehalte analysiertAntioxidansund Antiglykationsaktivitäten. Die EAF-Fraktion zeigt im Vergleich zu anderen Fraktionen die höchsten TP- und TF-Gehalte und die stärksten antioxidativen Aktivitäten. Auch die Bewertung mehrerer Biomarker wie UV-Vis-Absorptionsspektrum, spezifische AGE-Fluoreszenz, Carbonylgehalt und freie Thiolgruppe zeigte die größte Schutzwirkung von EAF gegen Glykation, die durch Glukose vermittelt wird. Darüber hinaus wurde eine signifikant positive Beziehung zwischen den antioxidativen Kapazitäten von phenolischen Verbindungen und ihren Antiglykationsaktivitäten beobachtet. Dies weist darauf hin, dass phenolische Verbindungen die vorherrschenden Hauptkomponenten sein können, die sowohl für antioxidative als auch für antiglykierende Aktivitäten verantwortlich sind. Die bioaktiven Verbindungen im EAF wurden durch RP-HPLC-Analyse charakterisiert, und es wurde eine Gesamtzahl von sechs Verbindungen identifiziert. Molekulare Docking-Analysen in silico zeigten auch eine effektive Wechselwirkung zwischen Quercetin und Gallussäure mit BSA bzw. RAGE als Zielproteinen. Insgesamt deutet diese Studie darauf hin, dass E. fragilis eine potenzielle Quelle für natürliche bioaktive Verbindungen mit starken antioxidativen und Antiglykationsaktivitäten sein könnte und zur Behandlung und Vorbeugung von Alterungs- und glykationsbedingten Komplikationen eingesetzt werden sollte. Weitere Studien zur Isolierung bioaktiver Verbindungen und zum pharmakologischen Screening (dh Zytotoxizitätsstudie) müssen durchgeführt werden, um die Phytochemie und Wirkungsmechanismen der pharmakologischen Eigenschaften von E. fragilis zu untersuchen.
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