Charakterisierung natürlicher und alkalisch oxidierter Proanthocyanidine in Pflanzenextrakten durch ultrahochauflösende UHPLC-MS/MS

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Abstrakt: In dieser Studie analysierten wir die Proanthocyanidin (PA)-Zusammensetzung von 55 Pflanzenextrakten vor und nach der alkalischen BehandlungOxidationdurch ultrahochauflösende UHPLC-MS/MS. Wir haben die natürlichen PA-Strukturen detailliert charakterisiert und die raffinierten Veränderungen in den modifizierten PA-Strukturen sowie die typischen Muster und Modelle von Reaktionen innerhalb verschiedener PA-Klassen aufgrund von Oxidation untersucht. Die natürlichen PAs waren PCs vom A- und B-Typ, PDs und PC/PD-Mischungen. Außerdem haben wir galloylierte PA nachgewiesen. B-Typ-PCs in verschiedenen Pflanzenextrakten waren ziemlich stabil und zeigten keine oder geringfügige Modifikation aufgrund deralkalische Oxidation. Bei einigen Proben haben wir die intramolekularen Reaktionen von PCs nachgewiesen, die Etherbindungen vom A-Typ erzeugen. PCs vom A-Typ waren auch ohne oder mit geringfügigen Modifikationen ziemlich stabil, aber in einigen Pflanzen bildete sich zusätzlicher EtherVerknüpfungenwurde festgestellt. PAs, die PD-Einheiten enthielten, waren reaktiver. Nach der alkalischen Oxidation wurden diese PAs oder ihre Oxidationsprodukte nicht mehr durch MS nachgewiesen, obwohl noch ein andersartiger und/oder verzögerter PA-Höcker durch UV bei 280 nm nachgewiesen wurde. Galloylierte PA waren unter alkalischer Oxidation ziemlich stabil, wenn sie PC-basiert waren, aber wir entdeckten die intramolekulare Umwandlung vom B-Typ zum A-Typ. Galloylierte PD waren reaktiver und reagierten ähnlich wie nicht-galloylierte PD.

Schlüsselwörter: hochauflösende Massenspektrometrie; Orbitrap;Oxidation; Tannine; UHPLC-DAD-MS/MS

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1. Einleitung

Proanthocyanidine(PAs, syn. condensed tannins) sind Oligomere und Polymere, die aus Flavan-3-ol-Monomereinheiten bestehen (Abbildung 1). Die Vielfalt der PA-Strukturen ergibt sich hauptsächlich aus ihren Hydroxylierungsmustern, der sequentiellen Reihenfolge der Flavan-3-ol-Einheiten und dem Polymerisationsgrad (DP), zusätzlich zu Unterschieden in der Stereochemie an C2 und C3 und Variationen in der Position und Stereochemie von interFlavanoidAnleihen [1]. Die häufigsten PAs sind Procyanidine (PCs), die aus (epi)Catechin-Einheiten bestehen, und Prodelphinidine (PDs), die aus (epi)Gallocatechin-Einheiten bestehen (Abbildung 1). Die in der Figur dargestellten PA-Strukturen haben die C4→C8-Verknüpfungen. Allerdings können PAs auch durch C4→C6-Bindungen verknüpft sein, und wir können diese beiden Verknüpfungen nicht durch Massenspektrometrie voneinander trennen.

PAs are the most commonly available subgroup of plant tannins, responsible for nearly 90% of the world's overall market for industrial tannins (>mehrere 100-Kilotonnen pro Jahr) und sind als Biopolymer chemisch und wirtschaftlich attraktiver [2-5]. Derzeit werden nur wenige Ressourcen wie Rinde oder Hölzer von Akazie, Mimose, Quebracho, Eiche, Kastanie, Mangrove, Sumach, Myrobalane und Tara für ihre Produktion und hauptsächlich für die Anforderungen der Ledergerbung, des Weins und der Mineralien verwendet Flotation und Ölbohrindustrie, zur Herstellung von Klebstoffen, zusätzlich zur Tierernährung [4,6,7]. Aber auch Abfälle oder Nebenprodukte aus der Handhabung und Verarbeitung von Obst, Gemüse und Waldressourcen aus den oben aufgeführten industriellen Anwendungen könnten eine potenzielle Quelle für natürliche PA sein [8-11]. Die PAs könnten auch weiter modifiziert werden, um ihre Verwendbarkeit und Bioaktivität zu verbessern [12,13].

Die chemischen Eigenschaften von PAs können durch Derivatisierungsreaktionen modifiziert werden [12]. Diese Reaktionen schließen zum Beispiel O-Acylierung durch eine Reaktion mit Säurechloriden oder -anhydriden oder Alkylierung mit Alkylhalogeniden ein. Die Derivatisierung modifiziert die physikalisch-chemischen Eigenschaften von PAs für ihre kommerziellen Anwendungen und Reinigungstechnologien. Um jedoch die tatsächlichen Reaktionen wirklich zu verstehen, müssen mehrere Parameter wie die verwendeten Reagenzien und Lösungsmittel, Temperatur, pH-Wert und Reaktionszeit reguliert werden [12]. Eine einfache und schnelle Möglichkeit, die Verwendbarkeit von pflanzlichen PAs zu verbessern, besteht darin, sie zu oxidieren, um neue PAs mit veränderten Molekülstrukturen zu erzeugen. Obwohl die Reaktionsbedingungen der Oxidation gut bekannt sind und verschiedene Reaktionsmechanismen vorgeschlagen wurden, sind die entsprechenden Strukturänderungen hauptsächlich für einzelne kleine PAs bekannt [14-18]. Beispielsweise wurden die Oxidations- und Umlagerungsreaktionen verschiedener monomerer und dimerer Flavan-3-ole bereits vor 30 Jahren elegant diskutiert, was zeigt, dass die Chemie dieser PAs bei alkalischem pH durch die Bildung von A- und/oder reguliert wird B-Ring-Chinonmethide als hochreaktive Zwischenprodukte, die die Umlagerungsreaktionen und die oxidative Umwandlung von PAs vom B-Typ in PAs vom A-Typ verursachen[15]. Stattdessen ist das Verhalten von PA-Mischungen in den Pflanzenextrakten nicht bekannt, was höchstwahrscheinlich auf Schwierigkeiten bei der Analyse strukturell unterschiedlicher Ausgangs-PAs zurückzuführen ist, die nach der Oxidation noch weiter herausgefordert werden. In unserer vorherigen Studie haben wir getestet, ob verschiedene Arten von natürlichen PAs chemisch modifiziert werden können, um neue Arten von PAs herzustellen, und die Auswirkungen einer unspezifischen alkalischen Oxidation untersucht, die den häufig verwendeten alkalischen Extraktionsprozess für Rindenabfälle nachahmt [19-23]. 102 PA-haltige Pflanzenextrakte [13]. Die Ergebnisse zeigten unterschiedliche Reaktivitäten für PCs und PDs. Das Ergebnis legte nahe, dass Pflanzen-PAs bei hohem pH-Wert modifiziert werden könnten, und das Vorhandensein von PD-Gruppen erhöhte die Wahrscheinlichkeit von Modifikationsreaktionen signifikant. Es wurde geschlossen, dass der Hauptreaktionsweg intramolekular ist, aber für PD-reiche und gallovlierte PAs wurden sowohl intra- als auch intermolekulare Reaktionen angezeigt [13]. Darüber hinaus haben andere Studien gezeigt, dass die Oxidation von PAs sowohl intramolekulare als auch intermolekulare Reaktionen umfasst [14,15,24,25].

Die detaillierte Charakterisierung und das Verständnis von natürlichen und oxidierten PAs ist eine Herausforderung, aber die jüngsten Fortschritte bei der Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (UHPLC-MS/MS)-Instrumentierung mit hochauflösenden Massenanalysatoren haben die Charakterisierung vieler verschiedener Pflanzen-PAs ermöglicht [18, 26-28]. Die beliebten Massenanalysatoren für die Charakterisierung von PAs waren Orbitrap [27,28] und Quadrupol

Time-of-Flight (OTOF)[29,30] aufgrund ihrer hochauflösenden Eigenschaften, die die Bestimmung der genauen Massen und entsprechenden Summenformeln von untersuchten PAs in Pflanzenextrakten ermöglichen. In der Natur vorkommende PA enthalten normalerweise eine Mischung aus verschiedenen Oligo- und Polymerstrukturen, die bei der Elektrospray-Ionisation mehrfach geladene Ionen ergeben und den verwendeten Massenbereich erweitern [30-32]. Darüber hinaus haben PAs bekannte charakteristische Fragmentierungsmuster, die zu ihrer Identifizierung verwendet werden können: Dazu gehören Chinon-Methid (QM)-Spaltung, heterozyklische Ringspaltung (HRF) und Retro-Diels-Alder (RDA)-Fragmentierung [27, 31-33]. Die gleichen Fragmentierungsmuster sind normalerweise sowohl für PAs vom A-Typ als auch für PAs vom B-Typ vorhanden, und die beobachteten m/z-Werte für PAs vom A-Typ mit einer Etherbindung unterscheiden sich um 2 Da von den entsprechenden PAs vom B-Typ [26, {{ 19}}].

In dieser Studie haben wir UHPLC in Kombination mit ultrahochauflösender Tandem-Massenspektrometrie verwendet, um (a) die natürlichen PA-Strukturen in 55 PA-reichen Pflanzenproben im Detail zu untersuchen, (b) um die raffinierten Veränderungen in den modifizierten PA-Strukturen danach zu sehen die Luftoxidation unter alkalischen Bedingungen und (c) die typischen Muster und Modelle von Reaktionen innerhalb verschiedener PA-Klassen aufgrund der Oxidation zu erkennen.

2. Ergebnisse und Diskussion

Wir haben 55 PA-reiche Pflanzenproben ausgewählt, die interessante, aber komplexe Mischungen natürlicher PA enthalten, basierend auf unserer früheren Studie [13]. Diese Pflanzenproben wurden ähnlich wie in [13] durch Luftoxidation unter alkalischen Bedingungen oxidiert, und nach der Oxidation waren PAs noch komplexer. Diese natürlichen und modifizierten PAs wurden hier durch UHPLC-DAD in Verbindung mit ultrahochauflösender Q-Orbitrap-MS/MS untersucht, um die raffinierten Veränderungen in PA-Strukturen zu erkennen. PAs wurden anhand ihrer einfach und/oder mehrfach geladenen Ionen mit ihren entsprechenden exakten Massen und Molekülformeln identifiziert. Die Analysen wurden durch Umkehrphasen-LC durchgeführt, und daher waren oligomere und polymere PA hauptsächlich als unaufgelöste Höcker in den UV-Chromatogrammen bei 280 nm vorhanden, siehe den Blattextrakt von Ruprechtia salicifolia in Abbildung 2A für ein Beispiel. Im Gesamtionenchromatogramm war die Ionisierung anderer phenolischer Verbindungen intensiver als die der PAs, und daher war der PA-Höcker nicht so deutlich (Abbildung 2B). Die Genauigkeit von Orbitrap erleichtert jedoch die Interpretation von MS-Ergebnissen, da die Isotopenmuster mehrfach geladener Ionen klar definiert sind und die mögliche Überlappung von Peaks erkannt werden kann, wodurch die Bestimmung der genauen Massen und Molekülformeln verschiedener Oligo- und polymere PAs. Zum Beispiel zeigen galloyliertes (epi) Catechin bei m/z 441, galloyliertes dimeres PCat m/z729 und galloviertes trimeres PC bei m/z 1017 gut getrennte Peaks in extrahierten Ionenchromatogrammen (EICs) in Abbildung 2C-E, und sie lassen sich anhand ihrer UV- und Massenspektren, einschließlich exakter Massen und der entsprechenden Summenformel, leicht nachweisen. Die hier erhaltenen Ergebnisse stimmten mit früheren MS/MS-Ergebnissen überein, die zeigten, dass Blätter von Ruprechtia salicifolia 24 mg/g PA enthielten, von denen nur 3 Prozent PD-haltige PA waren, einige von ihnen galloyliert waren und mDP gefunden wurde 7 sein [13].

2.1.PCs vom B-Typ in den anfänglichen nicht-oxidierten Pflanzenextrakten

PCs vom B-Typ in den Pflanzenextrakten wurden neben den charakteristischen Fragmentierungsmustern anhand ihrer einfach und mehrfach geladenen Molekülionen nachgewiesen. Zum Beispiel PCs in Begonia Laube sind "Nigra"-Extrakt zeigten eine deutliche Reihe von [MH]-Ionen, getrennt durch 288 Da von m/z289 bis m/z 1729, entsprechend PCs vom B-Typ von Monomer bis Hexamer und von [M{{ 6}}H]'-Ionen getrennt durch 144 Da von m/z 1008 bis m/z 1296, entsprechend für PCs vom B-Typ von Heptameren zu Nonameren (Tabelle S1). Die Massenspektren von monomeren PCs, dh Flavan-3-olen, Catechin und Epicatechin, zeigten ein charakteristisches Fragmention bei m/z 245, wie zuvor berichtet [3132,36].

Im Allgemeinen zeigte die MS/MS von B-Typ-PC-Dimeren die charakteristischen Fragmentierungsmuster, die Ionen bei m/z 287 und 289 (QM-Spaltung), m/z 425 und 407 (RDA-Fragmentierung und die sequentielle Wassereliminierung) und m/z ergaben /z 451 (HRF; Abbildung 3). Die RDA-Fragmentierung wird als das wichtigste Fragmentierungsmuster für die Charakterisierung von B-Typ-PC-Dimeren angesehen, und die Fragmentierung an der Erweiterungseinheit wurde als energetisch günstiger angesehen, da sie Fragmentionen mit einem größeren π-π-hyperkonjugierten System erzeugt als die RDA-Fragmentierung auf der Terminaleinheit [31-33].

2.2.PCs vom Typ A in den anfänglichen nichtoxidierten Pflanzenextrakten

Das Vorhandensein von PAs vom A-Typ in den anfänglichen Pflanzenextrakten wurde durch ihre charakteristischen Fragmentierungsmuster ähnlich denen von PAs vom B-Typ bestätigt. Als Beispiele werden die charakteristischen Fragmentierungswege und die MS/MS-Daten von A-Typ-PC-Dimer und -Trimer mit einer A-Typ-Verknüpfung gezeigt und im Detail diskutiert (Abbildungen 4 und 5). Die Fragmentierung des PC-Dimers vom A-Typ erzeugte vier Fragmentionen (Abbildung 4). Die RDA-Fragmentierung der terminalen Einheit erzeugte ein Ion bei m/z 423, was das Vorhandensein einer A-Typ-Bindung bestätigt [26,34,35]. Zusätzlich schlagen wir vor, dass die RDA-Fragmentierung der Erweiterungseinheit und der nachfolgende Wasserverlust das Ion bei m/z 407 produzieren könnten. Das Ion bei m/z 449 ist die HRF-Produktion, dh das Ergebnis des Verlusts von die Phloroglucinol-Einheit [26]. Die Ionen bei m/z 285 und 289 entsprachen der QM-Spaltung. In ähnlicher Weise wies das PC-Trimer vom A-Typ ein Molekülion bei m/z 863 und charakteristische Fragmentionen in MS/MS bei m/z 711.693.573.559.451.411 und 289 auf, wie zuvor von Sui et al. (2016 )[26]. Die RDA-Fragmentierung des A-Typ-PC-Trimers erzeugte ein Ion bei m/z 711, was erneut das Vorhandensein einer A-Typ-Verknüpfung gemäß der vorherigen Studie bestätigt [26] und darauf hindeutet, dass die A-Typ-Verknüpfung zwischen zwei Verlängerungen bestehen könnte Einheiten. Wir schlagen vor, dass das Ion bei m/z 693 dem sequentiellen Wasserverlust entspricht und die Position der A-Typ-Verknüpfung unterstützt, wie in Abbildung 5 gezeigt. Außerdem schlagen wir vor, dass die zusätzliche RDA des heterocyclischen C-Rings des die terminale Flavan-3-ol-Einheit weist das Ion bei m/z559 auf. Dieses Ion war in unseren Studien unbedeutend. Die Ionen bei m/z573 und 289 entsprachen der QM-Spaltung der unteren Interflavanoidbindung [26]. Wir detektierten auch Ionen bei m/z 575 und 287. Wir schlagen vor, dass die Ionen bei m/z 451 und 411 der HRF des heterocyclischen C-Rings der mittleren Flavan-3-ol-Einheit entsprechen könnten, was die Position von unterstützt A-Verbindung zwischen den Erweiterungseinheiten gemäß Abbildung 5.

2.3. Modifikationen von PCs vom B-Typ in Pflanzenextrakten aufgrund der alkalischen Oxidation

Nach der Oxidation wurden PCs vom B-Typ in verschiedenen Pflanzenextrakten unterschiedlich modifiziert. Einige der Proben zeigten keine oder geringfügige Modifikationen; siehe zum Beispiel 6A , B für kürzere B-Typ-PC-Oligomere im Blattextrakt von Begonia Bower sind "Nigra" vor und nach der Oxidation. Wenn diese Arten von Pflanzenextrakten oxidiert wurden, waren die gesamten Massenspektren der anfänglichen und oxidierten Pflanzenextrakte ähnlich. In den detaillierten massenspektrometrischen Daten wurden jedoch winzige Unterschiede festgestellt. Beispielsweise wurde das PC-Dimer bei m/z 577 von m/z575 begleitet und das PC-Trimer bei m/z865 von m/z 863. Wenn die PC-Mengen vor der Oxidation niedrig waren, verschwanden ihre Signale nach der Oxidation fast aus den Massenspektren, was darauf hindeutet, dass sie sich aufgrund der Oxidation in nicht identifizierbare oder abgebaute umgewandelt hatten. Dieses Phänomen wurde beispielsweise für die Blattextrakte von Combretum Indicum und Euphorbia characias beobachtet, die geringe Mengen an wenigen kurzen PC-Oligomeren enthielten, und wurde durch frühere MS/MS-Daten gestützt, die zeigten, dass der PA-Gehalt von 4 mg/ml auf 1 mg abnahm /mL bzw. 7 mg/mL bis 1 mg/mL aufgrund der Oxidation [13]. Dieses Phänomen könnte mit den verwendeten experimentellen Bedingungen zusammenhängen, was bedeutet, dass sie schwerwiegender waren, wenn die anfänglichen PA-Gehalte niedrig waren. In einigen Proben wurde ein Teil der B-Typ-PCs stärker modifiziert, siehe Abbildung 6C, D, zum Beispiel für kürzere B-Typ-PColigomere im Blattextrakt von Cyperus owoaii vor und nach der Oxidation. Wenn diese Arten von Pflanzenextrakten oxidiert wurden, wurden sichtbare Unterschiede in den Gesamtmassenspektren festgestellt, die den Massenunterschied von 2 Da im Vergleich zu anfänglichen PCs zeigen (Abbildung 6C, D, Tabelle S2).

Es ist bekannt, dass die Oxidation von o-Dihydroxypolyphenolen, dh des Brenzcatechin-B-Rings von PCs, typischerweise o-Chinone mit einer Massendifferenz von 2 Da ergibt. Tatsächlich haben wir festgestellt, dass diese Art der Oxidation auch bei massenspektrometrischen Analysen auftreten kann. Es können geringfügige Signale in den Massenspektren vorhanden sein, deren m/z-Werte 2 Da kleiner sind als die m/z-Werte von PCs, was der möglichen Oxidation oder Bildung von Chinonformen von PCs während der Ionisierung entspricht (Daten nicht veröffentlicht). Denkbar ist, dass hier bei der alkalischen Oxidation o-Dihydroxypolyphenole die ersten o-Chinone bilden. Die gebildeten 0-Chinonformen sind jedoch instabil und reagieren höchstwahrscheinlich schnell weiter. Ein mögliches Ergebnis könnte die oxidative Umwandlung von B-Typ-PCs in A-Typ-PCs sein, wie zuvor in der Literatur berichtet [15]. Die Umwandlung von B-Typ-PCs in A-Typ-PCs beinhaltet als ersten Schritt die oxidative Entfernung des Hydridions an C2 des C-Rings: Die vorherrschenden basischen Bedingungen induzieren die Oxidation der o-Dihydroxyfunktionalität des B-Rings zu einem o-Chinon, das anschließend als ein dientOxidationsmittelfür die Umwandlung des Procyanidin-Dimers vom B-Typ in eines vom A-Typ [15] (Abbildung 7). Dieser Chinonmethid-Mechanismus wurde auch bei verschiedenen Temperaturen, pH-Werten und katalytischen Bedingungen [37], durch Radikaloxidation unter Verwendung von 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl-Radikalen unter neutralen Bedingungen [38] und durch Laccase ( EC1.10.3.2) [39].

Als wir die modifizierten PCs mit dem Massenunterschied von 2 Da in den oxidierten Extrakten und ihre durch MS/MS erhaltenen Produktionen untersuchten, wurde der Schluss gezogen, dass sie den A-Typ-PCs und ihren Fragmentionen ähnlich sind (wie oben in Abschnitt 2.2 diskutiert). zeigt die charakteristischen Fragmentierungsmuster, die Ionen bei m/z 285 und 289 (QM-Spaltung), m/z 423 (RDA-Fragmentierung) und m/z 449 (HRF) ergeben. Als Beispiel zeigen wir die Umwandlung der B-Typ-PC-Dimere des Blättchenextrakts von Microgramma Mauritania in A-Typ-PC-Dimere in 8nicht oxidiertAuszug, entdeckten wir vier B-Typ-PC-Dimere mit m/z-Werten 577 (Abbildung 8A), aber keine A-Typ-PC-Dimere mit m/z-Werten 575 (Abbildung 8B). Die winzigen Peaks im EIC bei m/z575 entsprachen vermutlich der Oxidation von B-Typ-PCs in der Ionenquelle, da die Retentionszeiten genau die gleichen sind wie bei B-Typ-PCs. Im oxidierten Extrakt entdeckten wir nur Spuren der anfänglichen B-Typ-PCs bei m/z 577 (Abbildung 8C), aber stattdessen entdeckten wir intensive Peaks bei späteren Retentionszeiten, die A-Typ-PCs bei m/z 575 entsprachen (Abbildung 8C). 8D). Die winzigen Peaks im EIC bei m/z577 mit genau denselben Retentionszeiten entsprachen den Isotopensignalen von m/z 575. Es muss angemerkt werden, dass diese Studie qualitativ war, was bedeutet, dass die Häufigkeiten der Ionen nicht sein können als solche verglichen. Außerdem muss beachtet werden, dass die Umwandlung von B-Typ-PC in A-Typ-PC nicht immer so vollständig war wie in diesem Beispiel und dass nicht alle B-Typ-PC in A-Typ-PC umgewandelt wurden; Grob geschätzt waren die Häufigkeiten der Ionen von PC-Oligomeren vom A-Typ und B-Typ gleich. Andererseits entdeckten wir in einigen Proben mehr Unterschiede von 2 Da; Beispielsweise könnte das PC-Heptamer bei m/z 2017 von Ionen bei m/z 2015 und 2013 begleitet sein, was auf die Bildung von einer bzw. zwei A-Typ-Verknüpfungen hindeutet.

Obwohl die Umwandlung von PCs vom B-Typ in Typ A der Hauptreaktionsmechanismus zu sein schien, können wir andere Modifikationsreaktionen nicht vollständig ausschließen. PAs waren als komplexe Mischungen in den anfänglichen nicht-oxidierten Extrakten vorhanden, und diese Mischungen waren noch komplexer nach der alkalischen Oxidation, die eine enorme Menge an MS-Daten erzeugte. Beispielsweise haben frühere Studien zu basenkatalysierten Oxidations- und Umlagerungsreaktionen von PAs gezeigt, dass PC-Dimere in verschiedene Produkte der C-Ring-Isomerisierung umgewandelt werden können, einschließlich Tetrahydroxypyranochromene, auch bekannt als Phlorotannine [15]. Diese Produkte würden sehr ähnliche m/z-Werte bei 577, aber unterschiedliche Retentionszeiten in LC und unterschiedliche Fragmentierungsmuster in MS aufweisen. Basierend auf den EICs bei m/z 577 konnten wir unter den verwendeten Reaktionsbedingungen keine Umlagerungen dieser Art feststellen. Die Umlagerungen und die Öffnung des heterocyclischen C-Rings könnten auch andere Produkte über Regioisomerisierung, Epimerisierung oder 13-Arylwanderung erzeugen [15]. Die Epimerisierung wurde hauptsächlich mit Herstellungsprozessen in Verbindung gebracht, und zum Beispiel führen die hohen Temperaturen beim Rösten von Kakao zu Flavan-3-ol-Verlusten, aber auch zur Epimerisierung von Flavan-3-ol-Monomeren, Dimeren und Trimere [40]. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Polyphenoloxidase in Bananenfruchtfleisch die Epimerisierung von (-)-Epigallocatechin zu (-)-Gallocatechin verursachte[41]. Wir haben die mögliche Epimerisierung von Flavan-3-olen unter Verwendung von EICs bei m/z289 untersucht und im Allgemeinen keine signifikante Epimerisierung festgestellt, die durch die verwendete alkalische Oxidation verursacht wurde. Wir können die Epimerisierung jedoch nicht vollständig ausschließen, da wir im oxidierten Extrakt von Pavonia-Blumenkohlblüten höhere Mengen an ( plus )-Catechin im Verhältnis zu (-)-Epicatechin nachgewiesen haben als im ursprünglichen nicht oxidierten Extrakt (Abbildung S1). Es muss auch beachtet werden, dass die oxidierten Extrakte vor der UHPLC-MS/MS neutralisiert wurden, was Redoxreaktionen verursacht haben könnte. In den oxidierten Formen sind Chinone Elektrophile, die mit dem vorhandenen nukleophilen Wasser reagieren können, und dies könnte einfach dazu führen, dass die Reduktionsreaktion B-Typ-PCs ergibt, was auch erklären könnte, warum einige der B-Typ-PCs unbeeinflusst zu sein scheinen.

2.4. Modifikationen von A-Typ-PCs in Pflanzenextrakten aufgrund der alkalischen Oxidation

PCs vom A-Typ in verschiedenen Pflanzenextrakten reagierten aufgrund der alkalischen Oxidation unterschiedlich. Einige der Proben zeigten keine oder geringfügige Modifikationen. Wenn diese Arten von Pflanzenextrakten einer alkalischen Oxidation unterzogen wurden, wurden keine signifikanten Unterschiede in den Gesamtmassenspektren festgestellt (siehe beispielsweise Tabelle S3 für die Hauptionen, die im Blattextrakt von Aglaonema commutatum var. maculatum vor und nach der Oxidation beobachtet wurden). Allerdings konnten winzige Unterschiede in den detaillierten massenspektrometrischen Daten mit der Massendifferenz von 2 Da festgestellt werden, was darauf hindeutet, dass zusätzliche A-Typ-Etherbindungen gebildet werden könnten. Dieses Phänomen war bei einigen Proben mit PCs vom Typ A deutlicher; Es wurde festgestellt, dass diese A-Typ-PCs aufgrund der alkalischen Oxidation zusätzliche A-Typ-Etherbindungen bilden (Abbildung 9). Wenn diese Arten von Pflanzenextrakten oxidiert wurden, wurden deutliche Unterschiede in den Gesamtmassenspektren festgestellt, die den Massenunterschied von 2 Da im Vergleich zu anfänglichen A-Typ-PCs zeigten. Das [MH]-Ion bei m/z 863 entsprach einem PC-Trimer mit einer A-Typ-Etherbindung und das Ion bei m/z 861 einem PC-Trimer mit zwei Etherbindungen (Abbildung 9A ). In ähnlicher Weise wurden tetramere PCs mit einer, zwei und drei Etherbindungen durch die [M-H]-Ionen bei m/z 1151, 1149 bzw. 1147 nachgewiesen (Fig. 9B). Im Verhältnis dazu haben pentamere und hexamere PCs eine , zwei und drei Etherbindungen wurden von den [M -H]-Ionen bei m/z 1439, 1437 und 1435 bzw. bei m/z 1727, 1725 und 1723 nachgewiesen (Abbildung 9C, D; jedoch die [M -2H]2--Ion bei m/z 861 eines PC-Hexamers war deutlich häufiger als das [MH]-Ion bei m/z 1723 und daher in der gezeigt Zahl).

Die Bildung zusätzlicher A-Typ-Verknüpfungen beeinflußte auch die Retentionszeiten dieser Oligomere. Die Zahl der zusätzlichen Etherbindungen schien mit zunehmendem Polymerisationsgrad der PCs bis zu einem gewissen Grad zuzunehmen, was zu erwarten ist, da es mehr Positionen für die zusätzlichen Bindungen gibt. Es muss jedoch auch beachtet werden, dass es geringfügige Signale mit der Massendifferenz von 2 Da geben kann, die der möglichen Oxidation oder Bildung von Chinonformen von PCs während der Ionisierung entsprechen, wie oben diskutiert. Diese Peaks sind auch in den Massenspektren in Fig. 9 vor den Hauptpeaks sichtbar, die PCs vom A-Typ entsprechen. Die Häufigkeit der Ionen, die Formen der Isotopenmuster und die charakteristischen Fragmentionen, die durch MS/MS erhalten wurden, bestätigten die Beobachtung zusätzlicher A-Typ-Etherbindungen. Es ist auch wichtig anzumerken, dass diese beobachteten intramolekularen Reaktionen den mittleren Polymerisationsgrad nicht zu beeinflussen schienen, da die höheren PA-Oligomere oder -Polymere in den oxidierten Extrakten im Vergleich zu nicht-oxidierten Extrakten nicht nachgewiesen wurden. Die Beobachtung wird von Mouls und Fulcrand (2012) [14] unterstützt.

2.5. Pflanzenextrakte mit PAs, die sowohl PC- als auch PD-Untereinheiten aufweisen, und ihre Modifikationen aufgrund der alkalischen Oxidation

Viele der Proben enthielten PAs mit sowohl (epi)catechin- als auch (epi)gallocatechin-Einheiten, dh die PAs waren PC/PD-Mischungen. Das Schicksal dieser PC/PD-Mischungen aufgrund der Modifizierung durch alkalische Oxidation war anders als bei PCs. PC/PD-Mischungen wurden in den Pflanzenextrakten vor der Oxidation sowohl durch UV als auch durch MS eindeutig nachgewiesen; siehe zum Beispiel die kleinen PA-Oligomere im anfänglichen Blattextrakt von Podocarpus macrophyllus (Abbildung 10A und Tabelle S4). Nach der Oxidation wurden die modifizierten PAs immer noch durch UV bei 280 nm als anderer Typ und/oder verzögerter Buckel nachgewiesen (Abbildung S2), aber sie wurden nicht mehr durch MS nachgewiesen, siehe zum Beispiel die fehlenden PA-Oligomere im oxidierten Blatt Extrakt von Podocarpus microphallus (Abbildung 10B und Tabelle S4). Wir haben keine anderen Signale festgestellt, die den modifizierten PC/PD-Mischungen oder ihren möglichen Abbauprodukten entsprechen könnten. Zum Beispiel konnten wir für das PC-Dimer bei m/z 577 das entsprechende A-Typ-PC-Dimer bei m/z 575 im oxidierten Extrakt nachweisen, aber ähnliche deutliche Beobachtungen konnten nicht für PC/PD-Dimere oder -Trimere gemacht werden (Abbildung 10B). Ursache für den Verlust nachweisbarer PC/PD-Oligomere in der ESI-MS können beispielsweise intermolekulare Reaktionen zwischen PAs sein [13-15,24,25]. Es ist bekannt, dass die intermolekularen Reaktionen zur Bildung von modifizierten PAs durch die Verbindung zweier unterschiedlicher oligomerer Ketten führen und typischerweise zu einer Erhöhung des mittleren Polymerisationsgrades führen [14]. Beispielsweise haben Vernhet et al. (2014) haben durch Kleinwinkel-Röntgenstreuexperimente festgestellt, dass, wenn PAs in konzentrierten Lösungen oxidiert werden, die modifizierten PAs Hochpolymere mit langen linearen oder verzweigten Ketten sind [25]. Eine weitere Oxidation kann auch zu einer Cyclisierung zwischen A- und B-Ringen verschiedener PAs führen [24]. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass diese neuen Bindungen und Strukturen gegenüber säurekatalysierter Spaltung resistent sind und daher die Erhöhung des mittleren Polymerisationsgrades nur durch nicht-depolymerisierende Methoden abgeschätzt werden kann [14,24. Unsere Ergebnisse zeigten jedoch, dass diese modifizierten PAs auch nicht unter den für PAs verwendeten Standard-ESI-MS-Bedingungen erkannt werden (Abbildung 10). In unserer vorherigen Studie verwendeten wir eine Methode, die auf der Überwachung ausgewählter Reaktionen durch Triple-Quadrupol basierte, um die PAs in nicht oxidierten und oxidierten Proben nachzuweisen, und stellten fest, dass sich die Zusammensetzung der Untereinheiten aufgrund der alkalischen Oxidation änderte, sodass die Methode nicht mehr zum Nachweis geeignet war die modifizierten PAs [13]. Die vorliegenden hochauflösenden MS-Ergebnisse unterstützen unsere früheren Beobachtungen durch Triple-Quadrupol, dass die modifizierten PAs in den oxidierten Extrakten viel komplexer sind als die ursprünglichen PAs in den nicht-oxidierten Extrakten und dass sie unter ähnlichen UPLC-MS/MS-Bedingungen nicht nachgewiesen werden [13].

Die in der Literatur verwendeten Methoden zur Oxidation von PAs unterscheiden sich ziemlich von unserer Methode, und daher sind die Ergebnisse möglicherweise nicht direkt vergleichbar [14,24,25]. In früheren Studien wurde die Oxidation in mit Trifluoressigsäure angesäuertem Wasser bei pH 3,5 durchgeführt, um den pH-Wert von Wein nachzuahmen, und die eigentliche Oxidation wurde durch mehrtägiges Rühren der Probe in Gegenwart von Luft erreicht [14,24, 25]. Wir verwendeten eine alkalische Oxidation durch Carbonatpuffer bei pH 10 nur für eine Stunde.

Die meisten Pflanzenextrakte enthielten PAs mit sowohl PC- als auch PD-Untereinheiten, und nur in zwei Proben konnten die PAs als nahezu PD-rein angesehen werden. Diese beiden Proben waren die Extrakte von Callisia gentlei varelegans und Pellaea ooata. Die B-Typ-PDs wurden in der Callisia gentle var. detektiert. Elegans-Extrakt vor der Oxidation; siehe zum Beispiel die kleinen PD-Oligomere in Tabelle S5, aber nach der Oxidation wurden diese PDs nicht mehr durch MS nachgewiesen. Wir haben keine anderen Signale entdeckt, die den modifizierten PDs oder ihren möglichen Abbauprodukten entsprechen könnten. Einige der modifizierten PAs wurden jedoch immer noch durch UV bei 280 nm als niedrigerer und verzögerter Buckel nachgewiesen (Abbildung S3). Interessanterweise wurden vor der Oxidation trimere PDs vom A-Typ im Pellaea-Datenextrakt nachgewiesen, und nach der Oxidation waren diese Signale immer noch vorhanden, aber ihre Intensitäten waren wesentlich geringer

durch MS und zusätzlich wurden m/z-Werte, die der Bildung zusätzlicher A-Typ-Verknüpfungen in PD-Trimeren entsprechen, ähnlich wie in A-Typ-PCs nachgewiesen (Tabelle S6). Dies kann darauf hindeuten, dass zusätzlich zu den intermolekularen Reaktionen, die für homo- und heterogene PDs vom B-Typ beobachtet wurden, die PDs vom A-Typ auch ähnliche intramolekulare Reaktionen aufweisen könnten, die für PCs vom A-Typ nachgewiesen wurden.

2.6. Gallolierte PAs in Pflanzenextrakten und ihre Modifikationen durch alkalische Oxidation

Einige der Pflanzen enthielten galloylierte PA. Das Vorhandensein zugeordneter PCs, PDs und PC/PDs in Pflanzenextrakten wurde durch ihre charakteristischen Fragmentierungsmuster bestätigt. Im Allgemeinen erfolgte die Fragmentierung von galovlierten PAs in der MS-Analyse ähnlich über RDA.-, HRF- und QM-Mechanismen, wie oben diskutiert [31-33]. Als Beispiel werden der charakteristische Fragmentierungsweg und MS/MS-Daten eines galloylierten PC-Dimers im Blattextrakt von Ruprechtia salicifolia gezeigt und ausführlich diskutiert (Abbildung 11). Die Position der Galloylgruppe ist nur ein Hinweis, und sie könnte an jede andere freie Hydroxylgruppe in der Endeinheit gebunden sein. Das Ion bei m/z603 ist die HRF-Produktion. Die Ionen bei m/z 287 und 441 entsprachen der QM-Spaltung. Darüber hinaus haben wir die Spaltung der Galloylgruppe festgestellt, die zu dem Ion führte, das dem PC-Dimer bei m/z577 entspricht, und die anschließende RDA-Fragmentierung mit einem Ion bei m/z425 und die weitere Spaltung von Wasser mit einem Ion bei m/z 407. Die HRF von m/z 577 erzeugte das Fragment-Ion bei m/z 451. Außerdem entdeckten wir kleine Fragment-Ionen bei m/z 109, 123 und 125, die den aromatischen Ringen entsprechen. Die galloylierten PAs könnten mehrere Galloylgruppen in ihren Strukturen enthalten (Tabelle S7).

Die verschiedenen galloylierten PAs verhielten sich während der Luftoxidation unter alkalischen Bedingungen unterschiedlich. Galloylierte PCs waren ziemlich stabil und reagierten ähnlich wie nicht-galloylierte PCs. Beispielsweise wurden keine nennenswerten Veränderungen für die galloylierten PCs mit einer Galloylgruppe in ihrer Struktur im oxidierten Blattextrakt von Nepenthes maxima festgestellt (Tabelle S7). Allerdings muss beachtet werden, dass die Intensitäten der Ionen für die galloylierten PCs mit zwei oder mehr Galloylgruppen im oxidierten Extrakt von Nepenthes maxima geringer waren und beispielsweise die galloylierten PC-Pentamere mit mehreren Galeerengruppen nicht mehr nachweisbar waren (Tab S7). Die ganzzahligen m/z-Werte für einige galloylierte PCs ähneln den m/z-Werten für PC/PDs, und daher ist die ultrahochauflösende MS erforderlich. Zum Beispiel entspricht m/z 881 einem trimeren PA, das aus zwei PC- und einer PD-Einheit besteht (C4sH3; O19, mberechnet 882,20074) und einem galloylierten PC-Dimer mit zwei Galloylgruppen (C44H34O20, mberechnet, 882,16435). wie im oxidierten Blattextrakt von Coccoloba uvifera wurden galloylierte PCs aufgrund von Oxidation in galloylierte PCs vom A-Typ umgewandelt, obwohl die galloylierten PAs im ursprünglichen Extrakt denen in Nepenthes maxima ähnlich zu sein schienen. Zum Beispiel war das zugeordnete PC-Dimer mit einer Galloylgruppe und einem Ion m/z 729 (Tabelle S7) während der alkalischen Oxidation im Blattextrakt von Nepenthes maxima stabil, aber teilweise modifiziert im Blattextrakt von Coccoloba ugifera, der Ionen sowohl bei m /z 727 und 729. Das erstgenannte Ion entsprach einem galloylierten A-Typ-PCdimer (m/z727.13148, C37H2O16) und zeigte charakteristische MS/MS-Fragmente, die die A-Typ-Verknüpfung unterstützen: m/z601 (HRF-Produkt von m/z 727), 575 (A-Typ-PCdimer), 557 (Spaltung von Wasser aus m/z 575), 449 (HRF von m/z 575, siehe Abbildung 4), 423 (RDA von m/z 575, siehe Abbildung 4), 285 (QM von m/z575, siehe Abbildung 4), 169 (Gallussäure), 125 (siehe Abbildung 11) und 109 (siehe Abbildung 11). Ein Grund für diese Unterschiede in ähnlichen PAs zwischen Pflanzenextrakten könnten die anderen Verbindungen sein, die in den Extrakten vorhanden sind und die Reaktionen von PAs beeinflussen.

Galloylierte PC/PD-Mischungen und PDs waren ähnlich reaktiv und modifiziert wie die nicht-galloylierten PC/PD-Mischungen und PDs. Nach der Oxidation wurden diese PAs nicht durch MS nachgewiesen, obwohl sie noch im UV bei 280 nm sichtbar waren. Wir haben keine anderen Signale festgestellt, die diesen modifizierten PAs oder ihren möglichen Abbauprodukten entsprechen könnten. In einer Probe, nämlich in Acacia Karroo-Blättern, wurden die modifizierten galloylierten und nicht galloylierten PDs auch nicht durch UV bei 280 nm nachgewiesen.

In unserer vorherigen Studie [13], in der PAs in nicht oxidierten und oxidierten Extrakten durch ausgewählte Reaktionsüberwachungsmethoden analysiert wurden, stellten wir fest, dass mit der galloylspezifischen MS/MS-Methode in den oxidierten Proben ein deutlicher Galloylbuckel nachgewiesen wurde, aber die Form des Buckels hatte sich verändert und entsprechend dem beobachteten Buckel im UV-Chromatogramm verschoben. Die ursprünglich galvlierten PAs waren so modifiziert worden, dass die Galloylgruppe mit der gewählten Reaktionsüberwachungsmethode noch nachweisbar war [13]. Frühere Studien zu (-)-Epigallocatechingallat und (-)-Epigallocatechin haben gezeigt, dass der Trihydroxyphenyl-B-Ring der Hauptwirkungsort für die Oxidation ist und dass es keine nachweisbaren Produkte gibt, die aus der Oxidation der Galloyleinheit resultieren [42]. Die verwendeten Reaktionsbedingungen und die erhaltenen Oxidationsprodukte waren jedoch im Vergleich zu unserer Studie ziemlich unterschiedlich, da die Oxidation mit Peroxylradikalen durchgeführt wurde, die durch Thermolyse des Azo-Initiators 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril) erzeugt wurden. [42].

Neben galloylierten PAs wurden zwei Proben, nämlich Cephalotaxus harringtomia subsp. Steinblütler-Blättchen und Laurus nobilis-Blätter schienen glykosylierte PCs zu enthalten, bei denen eine Zuckereinheit an eine PC-Struktur gebunden war. Bei einigen dieser glykosylierten B-Typ-PCs wurde festgestellt, dass sie sich während der alkalischen Oxidation ohne Spaltung der Zuckereinheit in glykosylierte A-Typ-PCs umwandeln. Außerdem wurde die Bildung zusätzlicher Etherbindungen an PCs vom A-Typ nachgewiesen.

3. Materialien und Methoden

Das Sammeln von Pflanzenmaterial, ihre Verarbeitung und Extraktion zusätzlich zur Oxidation bei pH 1 {{10}} wurde wie zuvor berichtet durchgeführt [13]. Die anfängliche Studie enthielt 102 Proben, von denen wir insgesamt 55 weitere Proben analysierten (Tabelle S8). Für die Luftoxidation wurden 20μL jedes Extrakts mit 18{{40}}μL pH 1{{60}}-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur oxidiert. Die Oxidation wurde durch Zugabe von 100 &mgr;l 0,6-prozentiger wässriger HCOOH gestoppt. Außerdem wurden vor der Analyse 280 μl Wasser zu 20 μl der anfänglich nicht oxidierten Proben hinzugefügt, um das Endvolumen von 300 μl sowohl für die nicht oxidierten als auch für die oxidierten Proben zu erhalten. Die ultrahochauflösende massenspektrometrische Analyse wurde mit einem UPLC-DAD-ESI-QOrbitrap-MS/MS durchgeführt. Das Instrument bestand aus einem Acquity UPLC-System (Waters Corp., Milford, MA, USA) gekoppelt mit einem Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometer (QExactiveTM, Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen, Deutschland). Als Säule wurde eine Acquity UPLC BEH Phenyl-Säule (2,1 x 100 mm, 1,7 µm, Waters Corp., Wexford, Irland) verwendet. Die Eluenten waren A= Acetonitril und B=0,1 % HCOOH. Es wurde eine Flussrate von 0,5 ml/min-1 verwendet, und das Elutionsprofil war wie folgt:0-0. 5 min, 0,1 Prozent A in B (isokratisch); 0,5-5 min, 0,1-30 Prozent A in B (linearer Gradient);5-6 min, 30 Prozent {{44} } Prozent A in B (linearer Gradient);6-6.1 min, 35-90 Prozent A in B (linearer Gradient); 6,1-9,5 min, Säulenwäsche und Reäquilibrierung. Das Injektionsvolumen betrug 5 μl. Die UV- (λ=190-500nm) und MS-Daten wurden während der gesamten Analyse aufgezeichnet. Negative Ionisierung wurde in einer beheizten ESI-Quelle mit einer Sprühspannung von -3,0 kV, einer Flussrate des Schutzgases (N2) von 60, einer Flussrate des Hilfsgases (N2) von 20 und einer Spülgasflussrate von 0 verwendet. die Kapillartemperatur von plus 380 Grad und die kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) in der Quelle von 30 eV. Für Full-Scan-MS war der Massenbereich der Orbitrap m/z150-2250, die Auflösung 35,000 und die automatische Verstärkungsregelung 3×10*. Für MS/MS-Analysen, nämlich dd-MS2(TopN), waren die Parameter die folgenden: TopN 3; die stufenweise normalisierten Kollisionsenergien 20, 50 und 80 eV, die Auflösung 17.500 und die automatische Verstärkungsregelung 1 × 105. Die Kalibrierung wurde mit Pierce ESI Negative Ion Calibration Solution (Thermo Fisher Scentific Inc., Waltham, MA, USA) durchgeführt. Die Daten wurden mit der Thermo Xcalibur Oral Browser Software (Version 3.0.63, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verarbeitet. Da die oxidierten Proben unter Verwendung von Natriumcarbonatpuffer (pH 10) erhalten wurden, bildete Natrium während der UHPLC-MS/MS-Analyse mit Ameisensäure Clusterionen. Daher wurde zu Beginn jedes Gesamtionenchromatogramms oxidierter Proben ein starker Peak von Natriumformiat-Clustern nachgewiesen (Tabelle S9). Das Muster war leicht zu erkennen und beeinflusste die Analyse von PAs nicht. MS/MS-Fragmentionen kleiner PA-Oligomere sind in Tabelle S10 dargestellt.

4. Schlussfolgerung

In dieser Studie analysierten wir die PA-Zusammensetzung von 55 Pflanzenextrakten vor und nach alkalischer Oxidation durch ultrahochauflösende UHPLC-MS/MS (Tabelle S8). Die natürlichen PA-Strukturen enthielten zusätzlich zu den zugeordneten PCs, PDs und PC/PD-Mischungen vom A- und B-Typ. Die PA-Zusammensetzungen waren komplex, und die ultrahochauflösende MS war erforderlich, um die genauen Massen und die entsprechenden Molekülformeln verschiedener PAs zu messen. B-Typ-PCs in verschiedenen Pflanzenextrakten waren ziemlich stabil und zeigten keine oder geringfügige Modifikation aufgrund der alkalischen Oxidation. Bei einigen Proben haben wir die intramolekularen Reaktionen von PCs nachgewiesen, die Etherbindungen vom A-Typ erzeugen. PCs vom A-Typ waren auch ohne oder mit geringfügiger Modifikation ziemlich stabil, aber in einigen Pflanzen wurde die Bildung zusätzlicher Etherbindungen nachgewiesen. Pflanzenextrakte, die PD-Einheiten in PAs (entweder reine PDs oder PC/PD-Mischungen) enthielten, waren reaktiver. Nach alkalischer Oxidation wurden diese PAs oder ihre Oxidationsprodukte nicht mehr durch MS nachgewiesen, obwohl noch ein andersartiger und/oder verzögerter PA-Höcker durch UV bei 280nm nachgewiesen wurde. Die intermolekularen Reaktionen zwischen PAs modifizierten diese PAs wahrscheinlich so, dass sie unter den Standard-ESI-MS-Bedingungen nicht nachgewiesen wurden. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese modifizierten PA auch nicht durch Abbaumethoden untersucht werden können. Daher wäre eine neue Analysemethode zu ihrer Identifizierung und Charakterisierung erforderlich. Galloylierte PAs waren unter alkalischer Oxidation relativ stabil, wenn sie PC-basiert waren, aber es wurden zusätzliche Etherbindungen gebildet, die die Umwandlung von galloylierten PAs vom B-Typ in galloylierte PAs vom A-Typ unterstützten. PAs mit zwei oder mehr Galloylgruppen waren reaktiver als solche mit nur einer Gruppe. Gallovlierte PC/PD-Mischungen und PDs waren reaktiver und reagierten ähnlich wie nicht-galloylierte. Es muss jedoch beachtet werden, dass die intra- und intermolekularen Reaktionen nicht ausschließend waren und diese Reaktionen gleichzeitig auftreten konnten. Darüber hinaus beeinflussten die Pflanzenmatrix und andere vorhandene Verbindungen diese Wechselwirkungen.