Teil 2: DHHC21-Mangel dämpft Nierenfunktionsstörungen während einer septischen Verletzung

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Diskussion

In der vorliegenden Arbeit berichten wir über DHHC21 als neuartigen Regulator der Nierendurchblutung und -funktion während septischer Verletzungen. Unsere neuen Erkenntnisse zeigen: (1) Zdhhc21devde? Mäuse zeigen eine bessere Nierenfunktion und weniger Nierenschäden nach septischer Verletzung im Vergleich zu WT-Mäusen;(2)DHHC21-Funktionsmangel bewahrt die Durchblutung des Nierengewebes, Sauerstoffsättigung und RBF bei septischer Verletzung;(3)DHHC21-katalysierte alAR-Palmitoylierung ist erforderlich für die Aktivierung des alAR-Signalwegs und die alAR-induzierte Verengung der Nierenarterien. Diese Studie liefert neue mechanistische Einblicke in die Regulierung der Nierendurchblutung und -funktion während einer septischen Verletzung. Wir schlagen vor, dass ein funktioneller Mangel an DHHC21 eine schützende Wirkung hatNierenfunktionbei septischer Verletzung und dass die Hemmung von DHHC21 als therapeutische Strategie zur Bekämpfung dienen kannNierenfunktionsstörungwährend einer septischen Verletzung.

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Hypoperfusion/Hypoxie des Nierengewebes ist eine der Hauptursachen für Nierenfunktionsstörungen während einer septischen Verletzung3-5. Wir stellten bei Mäusen nach CLP eine renale Hypoperfusion fest, die sich durch eine abgeschwächte MSOT-Signalintensität des Gesamthämoglobins, eine verringerte Sauerstoffsättigung im Nierengewebe und eine verringerte RBF nach einer septischen Verletzung zeigte. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen wurde die Reduktion des RBF bei Sepsispatienten mit Nierenschädigung sowie in Großtiermodellen für septische Schädigungen beobachtet7,10l1. Es ist erwähnenswert, dass mehrere Studien berichten, dass sich bei Sepsistieren mit unveränderter Nierenfunktion eine Nierenfunktionsstörung entwickeln kann oder sogar RBF334 erhöht. Diese widersprüchlichen Befunde können auf verschiedene Tiermodelle und Methoden zur Messung des Blutflusses zurückgeführt werden. Während beispielsweise CLP-induzierte polymikrobielle septische Verletzungen häufig verwendet wurden, verwenden einige Studien eine intravenöse Injektion von Escherichia coli35.

Proteinpalmitylierung wurde kürzlich als neuer Regulator der Proteinfunktion beschrieben, der an der Pathogenese und dem Fortschreiten vieler Krankheiten beteiligt ist. Es wurde erstmals von Schmidt et al.3637 als eine neue Art von posttranslationaler Modifikation identifiziert. Die Entdeckung der DHHC-Familie hatte seitdem die rasche Expansion dieses Gebiets vorangetrieben38,39. Die Rolle von Palmitoylierung und PATs wurde bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Zuständen, einschließlich Lipidstoffwechsel,Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, und neurologische Störungen23,0,4. Obwohl bereits früher über die Beteiligung der Palmitoylierung an polyzystischen Nierenerkrankungen und Nierenkrebs berichtet wurde23, gab es nur sehr begrenzte Studien, die die funktionelle Rolle von PATs untersuchtenNierenerkrankungen, insbesondere bei Nierenfunktionsstörungen während einer septischen Verletzung. Nach bestem Wissen sind wir die ersten, die die Rolle von DHHC2l bei Nierenfunktionsstörungen bei septischen Verletzungen untersucht haben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung von DHHC21 die Nierenfunktion stark rettet und die Nierenstruktur bei septischer Verletzung bewahrt.

Unsere Studie mit Zdhhc21dp/d4? Mäuse demonstrieren, dass die vorteilhaften Wirkungen des funktionellen Mangels von DHHC21 auf die Nierenfunktion seiner Fähigkeit zugeschrieben werden, die Durchblutung des Nierengewebes während einer septischen Verletzung zu verbessern. Unter basalen Bedingungen zeigen Zdhhc21ewaeP-Mäuse keine Anzeichen eines Salz/Wasser-Ungleichgewichts oder struktureller/funktionaler Nierenschäden5. Dennoch unterdrückt der DHHC21-Funktionsverlust die durch septische Verletzung induzierte Reduktion von RBF, Nierendurchblutung und renaler Sauerstoffsättigung. Ein erhöhter renaler Gefäßwiderstand, der durch eine übermäßige renale Vasokonstriktion verursacht wird, wird als Hauptgrund für eine beeinträchtigte Durchblutung des Nierengewebes bei septischen Verletzungen angesehen6.9. Unsere Ergebnisse weisen auf die Beteiligung von alAR an der Vermittlung einer durch septische Verletzung induzierten Hypoperfusion des Nierengewebes hin, wie durch die Zunahme der alAR-Palmitoylierung und die Aktivierung eines alAR-Signalwegs bei septischer Verletzung belegt wird. Ein funktioneller Mangel an DHHC21 hemmt jedoch die alAR-Palmitoylierung und führt zu einer abgeschwächten Fähigkeit von alAR, seinen nachgeschalteten Effektor zu aktivieren und eine Phenylephrin-induzierte Vasokonstriktion in den Nierenarterien zu vermitteln.

„Der molekulare Mechanismus, der der Regulation der alAR-Funktion durch DHHC21 zugrunde liegt, muss noch vollständig aufgeklärt werden. Der Defekt der alAR-Funktion, der durch den Funktionsverlust von DHHC21 verursacht wird, kann auf die Konformationsänderung von alAR zurückgeführt werden. Viele GPCRs verlassen sich für ihre Eignung auf die Palmitoylierung intrazelluläre Konformation: Das angehängte Palmitat in den C-terminalen Enden von GPCRs fügt sich in die Plasmamembran ein, um die vierte intrazelluläre Schleife zu bilden, die für die Wechselwirkung von GPCRs mit ihren Partnerproteinen und die Ausbreitung von GPCR-Signalen wesentlich ist.17,4 Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die Palmitoylierung von Albar auch in seiner C-terminalen Region stattfindet44. Daher kann das Fehlen einer DHHC21--vermittelten lAR-Palmitoylierung die intrazelluläre Konformation von alAR verändern und so die Ausbreitung von lAR-Signalen blockieren. Dies kann unterstützt werden durch unsere Ergebnisse, die zeigen, dass die Aktivierung von ERK, einem nachgeschalteten Signalisierungsereignis der alAR-Aktivierung, in Zdhhc21-Devider-Mäusen gehemmt wird, die sept ic Verletzung. Die DHHC21--regulierte Topologie des alAR-Carboxylterminus muss jedoch weiter unter Verwendung von Röntgenkristallographie bestätigt werden.

Ein weiterer neuer Aspekt unserer Studie ist die Verwendung von MSOT zur Bewertung der Nierenperfusion und -funktion während einer septischen Verletzung. MSOT wurde als markierungsfreie Methode zur Messung der Durchblutung verschiedener Organe und als zuverlässiges Bildgebungsverfahren zur Bestimmung der Nierenfunktion beschrieben2832,45. Im Vergleich zum Doppler-Durchflussmesser, der keine Visualisierung von Mikrogefäßen ermöglicht45, erzeugt MSOT Bilder mit hoher räumlicher Auflösung bei 150 um und liefert gleichzeitig eine quantitative Beurteilung des Perfusionsstatus in den Mikrogefäßen der Niere. Der wasserlösliche IRDye800CW ist ein sicherer Tracer zur Messung der renalen Clearance und verursacht bei einer Dosis von bis zu 20 mg/kg keine Toxizität. Die von uns beobachtete zweiphasige Bewegung von IRDye800CW stimmt mit zuvor veröffentlichten Studien überein. Unsere MSOT-Aufzeichnungen weisen auf eine größere Tmax-Verzögerung bei Sepsis-Nieren hin, was auf eine beeinträchtigte renale Clearance hindeutet. Eine Nephropathiestudie zeigt, dass die durch MSOT festgestellte eingeschränkte Nierenfunktion signifikant mit glomerulären histologischen Schäden korreliert30. Unsere Daten, die mit früheren Veröffentlichungen übereinstimmen, legen nahe, dass MSOT eine minimal-invasive und zuverlässige Technik zur Überwachung der Nierendurchblutung und -funktion ist.

Derzeit sind keine DHHC21--spezifischen Inhibitoren verfügbar. Der am häufigsten verwendete PAT-Inhibitor ist 2-BP, das eine breite Wirkung auf mehrere DHHCs hat und auch in den Fettsäurestoffwechsel eingreift47. Daher wäre die Entwicklung von niedermolekularen Inhibitoren, die speziell auf DHHC21 abzielen, eine vielversprechende Richtung. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass alAR nicht das einzige Substrat von DHHC21 ist. Mehrere andere DHHC21-Substrate wurden kürzlich identifiziert, darunter das Adhäsionsmolekül für Blutplättchen-Endothelzellen (PFCA M-1), Östrogenrezeptor-Caveolin-1, endotheliale Stickoxidsynthase (eNOS), Fyn, Superoxiddismutase (SOD{{ 8}}) und PLCB122,41,4s,49. Obwohl wir den Rahmen der vorliegenden Studie sprengen, können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass diese Substrate auch die Nierenfunktion während einer septischen Verletzung beeinflussen können.

Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie zum ersten Mal, dass DHHC21 eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Nierenperfusion während einer septischen Verletzung über Mechanismen spielt, die alAR-Palmitoylierung und alAR-vermittelte Vasokonstriktion umfassen. Darüber hinaus übt die Hemmung von DHHC21 Schutzwirkungen auf die Nierenfunktion während einer septischen Verletzung aus.

Materialen und Methoden

Reagenzien. Alle Reagenzien sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt.

Tiere. Zdhhc21depher-Mäuse und ihre Wildtyp-Kontrollmäuse (B6C3Fe) wurden von Jackson Laboratory gekauft. Der Genotyp von Zdhhc21dephe? Mäuse wurden durch Sequenzierung bestätigt (Genewiz, Inc., NJ, USA). Die für die Sequenzierung verwendeten Primer waren: AGCTGACTGAAGGGCACC (vorwärts) und AAAACCTGTAACGCATTTCCA (rückwärts)23. Die Tiere wurden in einem 12/12--h-Hell/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Für diese Studie wurden Mäuse (16-20 Wochen) beiderlei Geschlechts verwendet. Alle Tierversuche sind vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of South Florida genehmigt und entsprechen dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory

Blinddarmligatur und -punktion, Mäuse wurden mit Isofluran (3 % Induktion und 1 % Aufrechterhaltung) anästhesiert. In der rasierten Bauchregion wurde ein Mittellinienschnitt vorgenommen, und der Blinddarm wurde nach außen gebracht, 5 mm unterhalb der Ileozökalklappe fest abgebunden und zweimal mit einer 20--Gauge-Nadel distal zum Abbindepunkt perforiert. Aus jedem Einstichloch wurde 1 mm Kot extrudiert. Anschließend wurde der Blinddarm reponiert und das Abdomen in zwei Schichten verschlossen. 37 C-Laktat-Ringer-Lösung wurde topisch aufgetragen, um ein Austrocknen des Blinddarms zu verhindern. Den Mäusen wurde dann 37 Grad 0,9 Prozent Kochsalzlösung subkutan zur Flüssigkeitswiederbelebung verabreicht. Zur Analgesie wurde präoperativ eine Dosis von 0.5-1,5 mg/kg Buprenorphin Retard verabreicht. Scheinmäuse wurden demselben chirurgischen Eingriff unterzogen, jedoch ohne Zökumligatur und Punktion50,51.

Multispektrale optoakustische Tomographie. Beurteilung der renalen Ausscheidung von IRDye800CW. Mäuse wurden über Isofluran anästhesiert und um die Rumpfregion herum enthaart. Mäuse wurden mit dem Altera Medical MSOT Imaging System (München, Deutschland) bei mehreren Wellenlängen abgebildet: 700,730,760,775,785, 800,850 nm bei einer Rate von 10 Bildern/s. Mäuse wurden in einer Halterung in Rückenlage platziert und entlang der horizontalen Linearstufe bewegt, um die Nieren auf dem fest positionierten konkaven Wandler zu positionieren. Nach Aufzeichnung der Grundlinie wurden 60 nmol RDve800CW, gelöst in 100 ul 0,9-prozentiger Kochsalzlösung, intravenös über einen Zeitraum von 10 s injiziert. Bilder wurden unter Verwendung der Rückprojektionsformel rekonstruiert und mit Multispektralanalyse verarbeitet. Regions of Interest (ROIs) wurden um die Nierenrinde und die Medulla/Becken-Region gezogen, und die zeitlichen Änderungen des MSOT-Signals in den ROIs wurden dargestellt.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Nieren-Histopathologie. Die Nieren wurden fixiert, entlang der Sagittalebene geschnitten und für die Einbettung in Paraffin verarbeitet. Die Schnitte (5 μm) wurden entparaffiniert, rehydriert und 8 min bei Raumtemperatur (RT) mit Periodsäure oxidiert, gefolgt von einer 25-minütigen Inkubation mit Schiffs Lösung. Die Schnitte wurden dann mit Hämatoxylin gegengefärbt. Bilder wurden mit Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, USA) aufgenommen. Die Nierenstrukturschädigung wurde anhand der folgenden Merkmale bewertet: glomeruläre Anomalie, Verlust des Bürstensaums des proximalen Tubulus, Vakuolisierung, Dilatation des Tubulusepithels, tubuläre Zellablösung/Nekrose und Neutrophileninfiltration. Jedes Merkmal wurde basierend auf dem Schweregrad auf einer Skala von 0-5 bewertet.

Messung von Kreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff. Mausblut wurde 24 h nach septischer Verletzung durch Herzpunktion gesammelt. Plasma wurde durch Zentrifugieren des Blutes bei 2500 g für 15 min bei RT erzeugt. Messung von Kreatinin: Plasma wurde unter Verwendung einer 10- kDa Spin Column deproteinisiert; die Kreatininspiegel im Filtrat wurden dann unter Verwendung eines Kreatinin-Assay-Kits gemessen. Der Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) wurde unter Verwendung eines kolorimetrischen Urea-Stickstoff-Nachweiskits gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.

Messung von RBF und MAP. Mäuse wurden unter Verwendung von Isofluran anästhesiert. Der Blutdruckwandler wurde in die Halsschlagader kanüliert. Ein Mittellinieneinschnitt wurde im Abdominalbereich vorgenommen, gefolgt von einem linken Quereinschnitt, um die Nierenarterie freizulegen. RBF wurde mit einem Ultraschall-Laufzeit-Durchflussmesser (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA) gemessen. Nach dem Platzieren der Strömungssonde um die exponierte Nierenarterie durften die Mäuse für mindestens 30 min stabilisiert werden. RBF und MAP wurden gleichzeitig mit PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA) aufgezeichnet. Die Daten wurden mit der Software LabChart Pro Version 74,55 analysiert

Harzunterstützte Erfassung. Nierenarterien wurden gesammelt und in Lysepuffer (100 mM HEPES, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μM Palmostatin B, Protease-Inhibitoren, pH 7,4）22, 56. Gewebelysate wurden mit Blockierungspuffer (100 mM HEPES, 1 mM EDTA, 2,5 % SDS, 6 μl/ml MMTS, pH 7,4) bei 50 °C für 30 min unter konstantem Vortexen inkubiert.Nach Ausfällen mit kaltem Aceton wurden Proteine durch Zentrifugation bei 5000 g für 30 min pelletiert und fünfmal mit 70 % kaltem Aceton gewaschen.Proteinpellets wurden in Bindungspuffer (100 mM HEPES, 1,0 % SDS, 1 mM EDTA,pH 7,4) resuspendiert Jede Proteinprobe wurde in zwei gleiche Teile geteilt, von denen jeder die gleiche Menge an Isopropyl-Sepharose-6B-Kügelchen, Hydroxylamin (0,2 M, pH 7,4) und NaCl (0,2 M) erhielt, die jeweils in jeden Teil gegeben wurden.Nach 4 h Inkubation bei RT bei konstanter Rotation wurden palmitoylierte Proteine ​​mit 50 mM DTT in 1 × Probenpuffer eluiert und für SDS-PAGE gesammelt.

Western-Blotting. Messung von palmitoyliertem lAR. Von RAC gesammelte Proben wurden auf ein 4-20-prozentiges Tris-Glycin-Gel aufgetragen und nach der Elektrophorese auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Nach einstündigem Blockieren bei RT wurde alAR über Nacht bei 4 Grad mit Kaninchen-Anti-lAR-Primärantikörper (1:500) sondiert. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wurde die Membran mit IRDye800CW Esel-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:20, 000) für 45 min bei RT inkubiert.

Messung der ERK-Phosphorylierung. Nierenarterien wurden in 1 × RIPA, enthaltend Protease- und Phosphatase-Inhibitoren, lysiert. Die Membran wurde mit Kaninchen-anti-ERK(1:1000)- und Maus-anti-phosphoryliertem ERK (1:1000)-Antikörpern sondiert. IRDye800CW Esel-Anti-Maus- und IRDye680RD Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper wurden für die sekundäre Inkubation (1:20.000) verwendet. Die Membranen wurden mit Li-COR Odyssey CLx abgebildet und analysiert.

Beurteilung der Vasoreaktivität mittels Drahtmyograph. Nierenarterien der Maus. Nierenarterien ({{0}} μm Durchmesser) wurden aus WT- und Zdhhc21dp/de-Mäusen isoliert und in eiskalte, mit Sauerstoff angereicherte (95 % O,/5 % CO.) physiologische Kochsalzlösung (PSS,13{ {47}} mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,18 mM KH, PO, 1,17 mM MgSO, 7 H, O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM Glucose, 0,026 mM EDTA und 1,6 mM CaCl, pH 7,4). 2 mm lang) wurden auf der Drahtmyographenkammer (Living Systems Instrumentation, VT, USA) zwischen zwei Wolframdrähten (30 um Durchmesser) montiert. Die isometrische Spannung wurde mit dem Living Systems Signalkonditionierer (MYO-SC-1) in Verbindung mit der Software LabScribe v4 iWorks aufgezeichnet. Nach 30-minütiger Äquilibrierung bei 37 Grad Cin PSS wurde das Normalisierungsverfahren durchgeführt, um den optimalen Innenumfang L,=0,9 × L(Lo=-Innenumfang, der einem transmuralen Druck von 100 mmHg entspricht) zu bestimmen. . Als nächstes wurde die Gefäßlebensfähigkeit mit 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,18 mM KH, PO, 1,17 mM MgSO, 7 H, O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM Glucose, 0,026 mM EDTA, 1,6 mM CaCl, pH getestet 7.4). Arterien, die nicht auf KPSS ansprachen, wurden verworfen. Die Arterien wurden mit steigenden Konzentrationen von Phenylephrin (10 nM -30 μM) behandelt. Die Endothelintegrität wurde dann unter Verwendung von Acetylcholin (10 μM) bewertet. Die Konzentrations-Antwort-Kurven wurden konstruiert.

Kleine Arterien aus menschlichen Nieren. Kleine Arterien (~10 um im Durchmesser) wurden aus intakten lebensfähigen menschlichen Nieren präpariert, die für eine Transplantationsoperation abgelehnt wurden. Gefäßsegmente (ca. 2 mm lang) wurden auf den I-Stäben (250 um Durchmesser) der Draht-Myographenkammer montiert. Ähnliche Äquilibrierungs- und Normalisierungsverfahren wurden an menschlichen Arterien durchgeführt. Als nächstes wurden die Arterien mit Vehikelkontrolle (0,02 % DMSO in PSS) für 1 h inkubiert. Die Gefäße wurden dann mit 60 mM KPSS auf Lebensfähigkeit getestet und mit steigenden Konzentrationen von Phenylephrin (10 nM -30 uM) behandelt. Nach dem Abwaschen wurden die Gefäße mit 2-BP (100 μM) für 1 h inkubiert; die Gefäßlebensfähigkeit wurde dann erneut mit 60 mM KPSS mit 100 μM 2-BP getestet. Die kleinen Arterien ohne oder mit reduziertem Ansprechen auf KPSS wurden verworfen. Die Arterien wurden dann mit den gleichen Konzentrationen von Phenylephrin, gefolgt von Acetylcholin (10 &mgr;M), herausgefordert. Die Konzentrations-Antwort-Kurven von Vehikelkontroll- oder 2-BP-behandelten Arterien wurden konstruiert und verglichen.

Immunfluoreszenz. Menschliche Nierenarterien wurden in 10 Prozent Formalin für 48 h fixiert, in Paraffin eingebettet und geschnitten. Die Objektträger wurden dann entparaffiniert, rehydriert und mit PBS, das 0,05 % Triton X-1002 enthielt, permeabilisiert. Nach dem Blockieren wurden die Objektträger mit Kaninchen-Anti-DHHC21- und Ziegen-Anti-lAR-Antikörpern (1:100) über Nacht bei 4 Grad C markiert. Nach dem Waschen erfolgte eine sekundäre Antikörperinkubation mit Esel-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 und Esel-Anti-Ziege Alexa Fluor 568 (1:500). Nach dem Eindecken mit ProLong Diamond Eindeckmedium mit DAPI wurden die Objektträger mit dem konfokalen Spektralinversions-Laserscanning-Mikroskop Leica SP8 abgebildet.

statistische Analyse. Detaillierte Informationen (z. B. Name des Tests, Post-hoc-Test, n-Wert, Alpha-Niveau, p-Wert) für jeden statistischen Test sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt. Alle Daten erfüllen die Normalverteilungsannahme. Der Normalitätstest wurde unter Verwendung des Shapiro-Wilk-Tests mit einem auf 0,05 eingestellten Alpha-Level durchgeführt. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden unter Verwendung des Student's t-Tests (zweiseitig) analysiert, und drei oder mehr Gruppen wurden mittels Einweg-ANOVA mit Tukey-Post-Hoc-Analyse verglichen. Der Vergleich für Draht-Myograph-Kurven wurde unter Verwendung von Two-way ANOVA.p durchgeführt<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">