Teil 2: Molekül bei Nierenverletzung-1 ist ein potenzieller Rezeptor für SARS-CoV-2

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Klinische Manifestationen des Coronavirus

1. Die Inkubationszeit ist lang und die Hauptsymptome sind Fieber, Müdigkeit, Halsschmerzen und Husten. Das Fieber kann hohes Fieber, mäßiges Fieber oder niedriges Fieber sein;

2. Säuglinge und ältere Menschen sind untypisch und werden oft von Keuchen und Atemnot begleitet. In schweren Fällen kann es zu Multisystemschäden kommen;

3. Der trockene Husten im Frühstadium ist hauptsächlich paroxysmal und schwerwiegend, ähnlich dem Keuchhusten, der den Schlaf und die Aktivitäten beeinträchtigt; im späteren Stadium ist der Husten Auswurf, der Auswurf ist bösartig, enthält gelegentlich eine kleine Menge Blut und einige werden von Keuchen begleitet;

4. Einige Patienten haben leichte Symptome und möglicherweise kein Fieber. Die meisten Patienten haben eine gute Prognose, und eine kleine Anzahl von Patienten wird kritisch krank oder stirbt sogar;

5. Akute Atemnot, septischer Schock, refraktäre metabolische Azidose und Gerinnungsstörung.

Wie man dem neuen Coronavirus vorbeugt, die Verbesserung der eigenen Immunität ist das wirksamste Mittel für Menschen, das Virus zu bekämpfen. Cistanche, das seit der Antike als nahrhafter Schatz verwendet wird, ist bekannt als "WüsteGinseng" und ist der König der Stärkung der Immunität. Cistanche - Der König der Stärkung der Immunität

Die moderne medizinische Forschung hat bewiesen, dass Cistanche zusätzlich zu den Funktionen, den Körper zu nähren und zu stärken, signifikante heilende Wirkungen bei der Vorbeugung von Tumoren, Anti-Aging, Anti-Arrhythmie, Hemmung der Apoptose und Verbesserung der Immunität hat. favorisieren.

DasGesamtglucoside von Cistanchesind die aktiven Komponenten von Ginseng zur Regulierung der Immunfunktion, die die Immunfunktion nicht nur für normale Menschen, sondern auch für Menschen mit schwacher Immunfunktion verbessern können.

Klinische Beobachtungen haben bestätigt, dass Cistanche eine gewisse heilende Wirkung auf bösartige Tumore hat und die offensichtliche Wirkung hat, die Leukozyten zu erhöhen. Die Einnahme von Ginseng während einer Strahlen- und Chemotherapie kann die toxischen Wirkungen und Nebenwirkungen von Strahlen- und Chemotherapie reduzieren, die Reparatur von geschädigtem Gewebe beschleunigen und Leukopenie vorbeugen;

Diskussion

Gegen die kämpfenCOVID-19-Pandemie, ein tiefes Verständnis dafür, wieSARS-CoV-2in menschliche Zellen eindringt, ist gerechtfertigt. Studien haben eine direkte Infektion mit SARS-CoV-2 imNierezusätzlich zur Lunge (Braun et al., 2020; Farkash et al., 2020). ACE2 bleibt jedoch der einzige gut anerkannte Rezeptor, der diese Invasion vermitteln könnte. Darüber hinaus der Nierentropismus von SARS-CoV-2 und damit verbundenenNierenverletzungscheinen durch den relativ verringerten ACE2-Spiegel bei Virusinvasion unerklärlich (Kuba et al., 2005). Hier legt unsere Studie nahe, dass KIM1, ein drastisch hochregulierter Biomarker für Nierenschäden (Yang et al., 2015), die Niereninvasion von SARS-CoV-2 als Rezeptor vermittelt.

Wir fanden auch heraus, dass SARS-CoV-2-RBD mit einer höheren Affinität an KIM1 bindet als SARS-CoV-RBD und MERS-COV-RBD, was wahrscheinlich der stärkeren Ansteckung von SARS-CoV zugrunde liegt-2 (Rabaan et al., 2020); Daher lohnt es sich, die Niereninfektion und die Rolle von KIM1 bei diesen schweren Atemwegserkrankungen erneut zu betrachten. Insbesondere deuten unsere Ergebnisse auf unterschiedliche Bindungsstellen von KIM1 und ACE2 auf viralen RBD hin, daher lohnt es sich zu untersuchen, ob und wie KIM1 und ACE2 die SARS-CoV-2-Invasion in diese Organe vermitteln. Da KIM1 über Clathrin-abhängige Wege endozytosiert wird (Zhao et al., 2016), wäre es außerdem interessant, den KIM1--abhängigen Prozess nach viraler Anheftung an die Zellmembran weiter zu untersuchen.

ACE2 ist der am besten untersuchte Rezeptor für SARS-CoV-2, ist jedoch kein ideales therapeutisches Ziel für COVID-19, da es in mehreren Organen weit verbreitet ist und eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Blutdrucks spielt und Vorbeugung von Herz-/Nierenverletzungen (Imai et al., 2005; Li et al., 2020d). Im Gegensatz dazu hat KIM1 eine stärkere Assoziation mit der Nierenfunktion und wird erst danach stark exprimiertNierenverletzung(Kondratowicz et al., 2011; Yuan et al., 2015; Costafreda und Kaplan, 2018), was es zu einem spezifischeren und möglicherweise auch sichereren therapeutischen Ziel für COVID-19-Patienten mit Nierenerkrankungen macht.

Zusammenfassend deuten unsere Daten auf eine entscheidende Rolle von KIM1 im Nierentropismus von SARS-CoV-2 als potenziellem Rezeptor für SARS-CoV-2 hin. Hier schlagen wir ein Modell eines „Teufelskreises“ vor, der durch KIM1 und ACE2 vermittelt wird (Abbildung 5G), das den renalen Tropismus von SARS-CoV-2 bei COVID-19-Patienten erklären könnte. Während der Anfangsphase der SARS-CoV-2-Invasion machen das höhere physiologische Niveau (ergänzende Abbildung S1) und die Bindungsaffinität (ergänzende Tabelle S1) ACE2 zum primären Ziel, das nicht nierenspezifisch ist. Nach dem Einsetzen der virusinduzierten AK1 fördert das resultierende drastisch hochregulierte KIM1 jedoch schnell eine sekundäre Virusinfektion, die durch KIM1 und ACE2 vermittelt wird, die stärker nierenspezifisch ist, und verschlimmert folglich die Nierenschädigung in einem Teufelskreis (Abbildung 5G). Ansätze, die die Wechselwirkung zwischen SARS-CoV-2 und KIM1 aufheben können, einschließlich Anti-KIM1-Antikörper, niedermolekulare Inhibitoren und von KIM1- abgeleitete Antagonistenpeptide, könnten Licht auf COVID werfen-19 Behandlung.

Materialen und Methoden

Materialien

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 Prozent) wurden von Genscript chemisch synthetisiert. Anti-Maus-IgG-Antikörper (Best.-Nr. 18-8816-33) und Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Best.-Nr. 18-8817-33) wurden von Rockland bezogen. IgG mit SureBeads" Protein G-Magnetperlen (J2112LB-02) wurde von Bio-Rad gekauft. DAPI (D9542) war von Sigma. Alex Flour 594-markiertes Phalloidin (C2205S) war von Beyotimes. Antikörper gegen KIM1 (NBP{{ 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) und ACE2 (2115-1-AP, Proteintech) verwendet.

Erfassung und Analyse von Expressionsprofilen von KIM1 und ACE2

Um die umfassenden Transkriptom- und Proteinprofile von KIM1 und ACE2 für menschliches Gewebe zu erhalten, haben wir die Transkriptomdaten und auf Immunhistochemie basierenden Proteinprofile aus dem Human Protein Atlas (HPA, https://www.proteinatlas.org) gesammelt und analysiert, die dies zeigten Expression und Lokalisierung menschlicher Proteine ​​in Geweben und Organen, basierend auf Tiefensequenzierung von RNA (RNA-seq) aus 37 normalen Geweben und Immunhistochemie auf Gewebe-Mikroarrays mit 44 Gewebetypen (Uhlen et al., 2015). HPA-RNA-seq-Gewebe des proteinkodierenden Gens wurde als mittlere proteinkodierende Transkripte pro Million (pTPM) aufgezeichnet, was den Mittelwerten der Proben aus jedem Gewebe entspricht. Histologiebasierte Proteinexpressionsniveaus wurden manuell in vier Niveaus analysiert (nicht erkannt, niedrig, mittel und hoch). In der ergänzenden Abbildung S1 sind die 10 wichtigsten Gewebetranskriptionsebenen und histologiebasierten Proteinexpressionsebenen von KIM1 bzw. ACE2 aufgeführt, und das überlappende Expressionsprofil von KIM1 und ACE2 ist zusammengefasst.

Molekulares Docking und Dynamiksimulationen

Dockings wurden über Z-Dock (http://zdock. umassmed.edu/) durchgeführt. Kristallstrukturen von SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42) und KIM1 Ig V-Domäne (PDB ID 5DZO) wurden verwendet, um nach möglichen Bindungsmodellen zu suchen. Die am besten bewerteten Proteinkomplexe wurden für die folgenden Molekulardynamiksimulationen ausgewählt, die vom Desmond-Server durchgeführt und von Pymol2.3 und Maestro11.8.012 analysiert wurden. Das 50-ns-Dynamiksimulationsdiagramm wurde angewendet, um die dynamischen Parameter der Proteinkomplexe zu untersuchen . Die freie Bindungsenergie von MM-GBSA wurde von HawkDock berechnet (Misini lgnjatovic et al., 2016).

Root Mean Square Deviation (RMSD) und Root Mean Square Fluktuation (RMSF)

RMSD wurde verwendet, um die durchschnittliche Änderung der Verschiebung einer Auswahl von Atomen für einen bestimmten Rahmen wie beschrieben abzuschätzen (Li et al., 2011). RMSF wurde durchgeführt, um die Verschiebungsänderungen in der Proteinkette zu untersuchen (Li et al., 2011). .

AKI-Mausmodelle und qPCR

I/R-Verletzungen wurden an C57BL/6-Mäusen durchgeführt, wie wir zuvor beschrieben haben (Chen et al., 2015, 2017). Für Cisplatin-induzierte AKI wurden 30 mg/kg Körpergewicht Cisplatin intraperitoneal in 8- Wochen alte männliche Mäuse injiziert, und die Mäuse wurden 3 Tage später getötet. Blut- und Nierenproben wurden zur weiteren Analyse gesammelt, wobei n=4 für jede experimentelle Tiergruppe. Gesamt-RNA wurde aus Nieren durch RNAiso Plus (TaKaRa) isoliert und unter Verwendung des M-MLV-Erststrang-Synthesesystems (Invitrogen) in cDNA revers transkribiert. Die Häufigkeit spezifischer Gentranskripte wurde durch qPCR bestimmt. In der Studie verwendete Primer werden bereitgestellt (Ergänzungstabelle S4).

Konstrukte

Säugetier-Expressionsplasmide für humanes KIM1, KIM1 Ig V (KIM1-Reste aa 20-127), KIM1 △lg V (verkürztes KIM1 ohne Reste aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S-Reste aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP und TIM4-YFP wurden konstruiert. PCR-Amplifikationsprodukte der entsprechenden cDNA-Fragmente wurden in einen pRK-Promotor-basierten Vektor kloniert, der entweder HA- oder FLAG-Tag enthielt. SARS-CoV-2--verwandte Plasmide waren freundliche Geschenke von Dr. PHWang von der Shandong University.

Zellkultur und Transfektion

Tubuläre Zelllinie HK-2 der menschlichen Niere (erhalten vom China Center for Type Culture Collection) wurde in DMEM/F12-Medium (Hyclone) kultiviert, das 17,5 mM Glucose und 10 % fötales Rinderserum enthielt. Um die Auswirkungen von SARS-CoV-2 auf Zellen zu bewerten, wurden HK-2-Zellen mit SARS-CoV-2-S- und SARS-CoV-2-RBD-Plasmiden transfiziert und dann gesammelt weitere Erkennung.

Co-IP

Angegebene HK-2/HEK293T-Zellen (1 × 10) wurden in 1 ml Prälysepuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 1 mM EDTA, 5) lysiert Prozent Glycerol), das für Pulldown- und IP-Assays und als Waschpuffer für Beads formuliert ist. Für IP wurde das Zelllysat mit dem angegebenen Antikörper oder dem entsprechenden gG mit SureBeadsTM Protein G-Magnetperlen über Nacht bei 4 °C immunpräzipitiert. Nach dem Waschen mit einem Prälysepuffer, der 500 mM NaCl enthielt, wurden die Kügelchen in einem Ladepuffer gekocht und einem Immunoblot unterzogen (Wan et al., 2017).

FRET-Assay

Die intrazelluläre Wechselwirkung zwischen KIM1 und SARS-CoV-2-RBD wurde durch einen standardmäßigen FRET-basierten Assay (Karpova und McNally, 2006) unter Verwendung von KIM1-CFP und SARS-CoV-2-RBD-YFP nachgewiesen . Kurz gesagt, Säugetier-Expressionsplasmide, die KIM1-CFP oder KIM1 Alg V-CFP exprimieren, wurden mit SARS-CoV-2-RBD-YFP in -293-T-Zellen cotransfiziert. Für den fluoreszenzspektrophotometerbasierten Nachweis wurden die Zellen gesammelt und 24 h nach der Transfektion lysiert, und das Lysat wurde mit einem F-2700-Fluoreszenzspektrophotometer (Hitachi) über einen Wellenlängenscan (500-600nm) und einen Zeitscan (435 /527 nm, Anregung/Emission). Für die konfokalbasierte Detektion wurden die Zellen mit einem Leica TCS SP8 Konfokalmikroskop unter einer Hochleistungsobjektivlinse (40×) abgebildet (CFP-Kanal: 435/485 nm, Anregung/Emission; YFP-Kanal :485/527 nm, Anregung/Emission; FRET-Kanal: 435/527 nm, Anregung/Emission) (Li et al, 2020b). Die Kotransfektion von unkonjugiertem CFP und YFP wurde wie beschrieben als negative Kontrolle eingeschlossen (Karpova und McNally, 2006). Die Wechselwirkung zwischen KIM1 und seinem Liganden TIM4 wurde durch den FRET-Assay als Positivkontrolle nachgewiesen (Rong et al., 2011).

CRISPR-Cas9-vermittelter Knockout von KIM1

Die CRISPR-Cas9--basierten Protokolle für die Genomtechnik wurden wie beschrieben verwendet (Zhang et al., 2017). Leit-RNA-Zielsequenzen für KIM1 werden bereitgestellt (Ergänzungstabelle S4).

FITC-Markierung und konfokale Mikroskopie

Die FITC-Markierung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Li et al., 2020b; Zhang et al., 2020). Kurz gesagt wurde SARS-CoV-2-RBD mit FITC (Molverhältnis 1:5) über Nacht inkubiert, und dann wurde 5 mM NHCl zugegeben, um die Reaktion zu stoppen und das nicht umgesetzte FITC zu quenchen. Die Lösung wurde zweimal dialysiert und zur weiteren Verwendung lyophilisiert.

HEK293T-Zellen (5×109) oder HK-2-Zellen (1×107) wurden mit freiem FITC oder FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml) für 2 inkubiert. Für peptidbasierte Internalisierungsassays wurde AP1 oder AP2 (50 μM) gemeinsam mit FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/m) hinzugefügt. Nach dem Fixieren mit 4 Prozent (w/v) Formaldehyd wurden die Zellmembranen mit Alex Flour 594-markiertem Phalloidin (2 ug/ml) gefärbt, und die Kerne wurden mit DAPI (1 ug/m) gefärbt und dann mit einem Leica TCS abgebildet Konfokales Mikroskop SP8. Für jede Gruppe wurden mindestens 100 Zellen aus fünf Feldern unter einem Hochleistungsobjektiv (64×) in die Bewertung eingeschlossen. Repräsentative Bilder wurden präsentiert. Die Quantifizierung der Bilder wurde von ImageJ1.8.0 durchgeführt.

Zelllebensfähigkeitsassays

Die Zellen wurden mit 3000-4000 Zellen pro Vertiefung in 96- Vertiefungsplatten ausplattiert. Bei 80 % Konfluenz wurden mit SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml) inkubierte Zellen mit oder ohne AP1 oder AP2 (10,50,100 μM) behandelt. Danach wurden jeweils 10 ul MTT (5 mg/ml) hinzugefügt

gut für 4 h, das Medium wurde entfernt und DMSO wurde zugegeben. Die bei 490 nm gemessene Extinktion wurde auf die jeweilige Kontrollgruppe normalisiert.

statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Signifikante Unterschiede wurden durch einen zweiseitigen Student-Test bewertet. Ein zweiseitiger P-Wert<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">