Pentraxin-3--vermittelte Komplementaktivierung in einem Schweinemodell einer renalen Ischämie/Reperfusionsverletzung

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Chiara Divellaet al

ABSTRAKT

Pentraxine sind eine Familie von evolutionär konservierten Mustererkennungsmolekülen mit entscheidender Rolle bei der angeborenen Immunität und Entzündung, wie z. B. der Opsonisierung von Krankheitserregern während bakterieller und viraler Infektionen. Insbesondere hat sich gezeigt, dass das lange Pentraxin 3 (PTX3) mehrere Aspekte der Gefäß- und Gewebeentzündung während der Transplantation fester Organe reguliert.

Unsere Studie untersuchte die Rolle von PTX3 als möglicher Modulator der Komplementaktivierung in einem Schweinemodell einer renalen Ischämie/Reperfusionsverletzung (I/R). Wir haben gezeigt, dass I/R-Verletzungen induzierte frühe PTX3-Ablagerungen auf peritubulären und glomerulären Kapillarniveaus. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie zeigte PTX3-Ablagerungen, die zusammen mit CD31 plus Endothelzellen lokalisiert waren. Darüber hinaus war PTX3 mit infiltrierenden Makrophagen (CD163), dendritischen Zellen (SWC3a) und Myofibroblasten (FSP1) assoziiert. Insbesondere zeigten wir eine signifikante PTX3--vermittelte Aktivierung klassischer (C1q-vermittelter) und Lektin- (MBL-vermittelter) Wege des Komplements. Interessanterweise kolokalisierten PTX3-Ablagerungen mit der Aktivierung des terminalen Komplementkomplexes (C5b-9) auf Endothelzellen, was darauf hindeutet, dass die PTX3--vermittelte Komplementaktivierung hauptsächlich auf der Ebene der Nierengefäße stattfand. Zusammenfassend weisen diese Daten darauf hin, dass PTX3 ein potenzielles therapeutisches Ziel sein könnte, um eine Komplement-induzierte I/R-Verletzung zu verhindern.

Korrespondenz:Giuseppe Castellano

Schlüsselwörter:Ischämie/Reperfusionsschaden, Komplementsystem, Pentraxin 3,Niere, klassischer Weg

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EINLEITUNG

Ischämie-Reperfusions(I/R)-Schädigung ist die Hauptursache für akuteNiereVerletzungnach Transplantation und ist durch eine signifikante Aktivierung des Komplementsystems gekennzeichnet [1, 2]. In diesem Szenario spielen Endothelzellen (EC) eine entscheidende Rolle bei der maladaptiven Reparatur nach I/R, was zu einer frühen Fibrose durch Endothel-zu-Mesenchym-Übergang (EndMT) führt [3]. Während der Reperfusionsphase orchestriert Komplement immunologische und entzündliche Prozesse und trägt zu verschiedenen Immun- und Entzündungserkrankungen bei [2–5]. Andere wesentliche Komponenten des humoralen Arms des angeborenen Immunsystems werden durch Pentraxine repräsentiert, von denen angenommen wird, dass sie eine zentrale Rolle in der Gefäßbiologie spielen [6].

Pentraxine sind eine Familie multimerer löslicher Proteine ​​[6], die aufgrund ihrer Struktur in kurze und lange Familien eingeteilt werden [7]. Diese evolutionär konservierten Proteine ​​sind Akute-Phase-Effektoren, die als Sensoren für die Entzündungsinitiierung dienen und während der Infektion schnell im Plasma ansteigen [8]. Das lange Pentraxin 3 (PTX3) ist ein lösliches Mustererkennungsmolekül, das entscheidend für den angeborenen Immunschutz ist und das Komplementsystem aktivieren kann [9–11].

Insbesondere induzierte PTX3 die Aktivierung des klassischen und des Lektinwegs durch Bindung an C1q, MBL, Ficolin-2 und kann den alternativen Weg über CFH beeinflussen [10–12].

Im Gegensatz zu anderen von der Leber produzierten Pentraxinen im Blutkreislauf (dh CRP) kann PTX3 von residenten Zellen innerhalb des Entzündungsortes freigesetzt werden, beispielsweise von mononukleären Phagozyten, dendritischen Zellen, Fibroblasten und EC [9], die parakrin wirken [13]. PTX3 wird auch in vorgefertigter Form in Neutrophilen gespeichert, in spezifischen Granula lokalisiert und als Reaktion auf die Erkennung mikrobieller Einheiten ausgeschieden [14]. Bei EC wird die Expression von PTX3 leicht durch TNF- und IL-1 induziert, was einen Übergang von einem ruhenden, entzündungshemmenden Phänotyp zu einem prokoagulierenden und proinflammatorischen Zustand bewirkt, wodurch die mikrovaskuläre Funktion stark reguliert wird [7, 8 ]. Aus diesem Grund wurden die PTX3-Spiegel als beschriebenchronischNiereErkrankungwurde der Anstieg der Proteinspiegel von PTX3 mit GFR-Abnahmen und kardiovaskulären Komplikationen korreliert, jedoch ist noch wenig über die Rolle von PTX3 in den frühen Situationen als I/R-induzierte Akuterkrankung bekanntNiereVerletzung [15, 16].

Die Rolle von PTX3 bei entzündlichen Nierenerkrankungen ist zweiwertig, einerseits kann das Protein klassische und Lektinwege aktivieren, die anfängliche Entzündungen und Verletzungen fördern [10–12]. Auf der anderen Seite schwächte die N-terminale Domäne von PTX3 die Komplementaktivierung ab und hemmte die Leukozytenrekrutierung und hemmte die interstitielle Fibrose bei akuter Nierenschädigung, was die Gewebereparatur förderte [17–20].

Das Komplement spielt eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie von I/R-Verletzungs-induzierten AkutenNiereVerletzung[21, 22]. In einem Schweinemodell einer renalen I/R-Verletzung haben wir die zentrale Rolle der Aktivierung des Komplementsystems bei der Induktion von EndMT und früher Fibrose unter Beteiligung sowohl klassischer als auch Lektinwege demonstriert [23]. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die therapeutische Hemmung dieser Komplementwege durch rekombinantes C1-INH (rhC1INH) zu einer signifikanten Verringerung der Komplementablagerung führte, mit verringerter Rekrutierung infiltrierender Entzündungszellen und tubulointerstitieller Schädigung [23]. Diese Ergebnisse wurden auch von Delpech PO et al [24] bestätigt; eine signifikante Modulation der glomerulären und tubulären C1q-, MASP- und C4d-Ablagerung wurde 30 Minuten nach der Reperfusion festgestellt, was auf eine zentrale Rolle von C1-INH bei der Bekämpfung klassischer und Lektinwege hinweist.

In dieser Studie untersuchten wir die mögliche Beteiligung von PTX3 an der Vermittlung einer frühen Komplementaktivierung bei Nieren-I/R-Verletzungen und charakterisierten die verschiedenen zellulären Quellen von PTX3.

ERGEBNISSE

PTX3 wird von Endothelzellen und immuninfiltrierenden Zellen in einem Schweinemodell der I/R-Verletzung exprimiert

Zuerst untersuchten wir das Vorhandensein von PTX3 in einem Schweinemodell einer warmen I/R-induzierten Nierenschädigung. Wir beobachteten sehr begrenzte PTX3-Ablagerungen in normalem Gewebe (Abbildung 1A). I/R-Verletzung verursachte eine diffuse Ablagerung von PTX3 bereits 15 Minuten nach der Reperfusion (Abbildung 1B, 1C) im tubulointerstitiellen Bereich (Abbildung 1E), an peritubulären Kapillaren (Abbildung 1D; Pfeil) und auf glomerulärer Ebene (Abbildung 1D). PTX3-Ablagerungen waren noch 1 Stunde nach der Reperfusion auf der Ebene der peritubulären Kapillaren nachweisbar (Abbildung 1G). In unserer früheren Arbeit [23] haben wir gezeigt, dass die Hauptmerkmale einer I/R-Verletzung die Apoptose tubulärer Epithelzellen und die Rekrutierung von infiltrierenden Entzündungszellen wie Monozyten, dendritischen Zellen und Lymphozyten sind. Dennoch haben wir durch routinemäßige histologische Auswertung (ergänzende Abbildung 1) gezeigt, dass 30 Minuten warme Ischämie, gefolgt von 15 Minuten Reperfusions-induzierter früher interstitieller Tubulusschädigung, gekennzeichnet durch eine größere Kapillarverstopfung und fokale zytoplasmatische Vakuolisierung des Nierentubulusepithels im Vergleich zu basal Bedingung.

Um die zelluläre Lokalisierung von PTX3-Ablagerungen weiter zu charakterisieren und ihre potenzielle Wirkung bei der Modulation von Entzündungsreaktionen und Verletzungen zu bewerten, führten wir eine doppelte Immunfärbung und konfokale Mikroskopieanalyse durch. Die PTX3-Proteinexpression wurde 15 Minuten nach der Reperfusion in den meisten EC auf peritubulärer (Abbildung 2A) und glomerulärer (Abbildung 2B) Kapillarebene nachgewiesen.

Es ist allgemein bekannt, dass eine I/R-Verletzung durch eine erhöhte Aktivierung der angeborenen und adaptiven Immunantwort gekennzeichnet ist, einschließlich des Transports von Entzündungszellen in das erkrankte Organ, was die Verletzung über Immunzellen und das Komplementsystem weiter verschlimmert [25]. In unserem Schweinemodell beobachteten wir auch bereits 15 min nach der Reperfusion ein dichtes entzündliches Infiltrat, das hauptsächlich aus Makrophagen und dendritischen Zellen im Tubulus-Interstitial-Bereich bestand. Wir fanden heraus, dass diese beiden antigenpräsentierenden Zellen im Vergleich zu T0 durch eine erhöhte PTX3-Expression gekennzeichnet waren, da wir eine erhöhte Anzahl von CD163 plus /PTX3 plus (Abbildung 2E, 2F, 2K) und SWC3a plus /PTX3 plus beobachteten (Abbildung 2G, 2H, 2L) Zellen auf Tubulus-Interstitial-Ebenen bei T15.

Die PTX3-Expression kann zu EndMT bei I/R-Verletzungen beitragen

In früheren Beobachtungen haben wir gezeigt, dass eine I/R-Verletzung für EndMT verantwortlich war [26, 27], gekennzeichnet durch den Erwerb eines mesenchymalen Phänotyps durch EC mit dem Verlust spezifischer endothelialer Marker und dem Gewinn mesenchymaler Marker, wie Fibroblasten-spezifisch Protein 1 (FSP-1), neuronales Cadherin (N-Cadherin) und Alpha-Glattmuskel-Aktin (Alpha-SMA). Daher untersuchten wir, ob die PTX3-Expression durch EC diesen Prozess beeinflussen könnte. Als wir die Alpha-SMA-Expression als Marker für aktivierte Myofibroblasten untersuchten, fanden wir erwartungsgemäß keine Co-Lokalisierung zwischen Alpha-SMA und PTX3 (Abbildung 2C, 2D). Im Gegenteil, wir beobachteten während des gesamten Beobachtungszeitraums einen Anstieg der tubulointerstitiellen FSP1 plus /PTX3 plus Myofibroblasten (Abbildung 2K–2M).

PTX3-Ablagerungen sind mit der Aktivierung des Komplementsystems verbunden

Schließlich untersuchten wir, ob PTX3-Ablagerungen mit der Komplementaktivierung verbunden waren. Tatsächlich kann PTX3, wie andere Komponenten der Pentraxin-Familie, die Aktivierung des klassischen Komplementwegs regulieren [7]. Um die Beziehung zwischen PTX3 und Komplementaktivierung zu definieren, führten wir eine Doppelmarkierungs-Immunfluoreszenz durch, um die Expression von PTX3 und das Terminal zu bewerten Komplementkomplex, C5b-9, unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen ein C9-neoepitop gerichtet ist. Wir beobachteten eine signifikante Co-Lokalisierung von PTX3- und C5b-9-Lagerstätten (Abbildung 3A, 3B). Der Komplement-terminale Komplex war auf peritubulärer Ebene sowie innerhalb der peritubulären Kapillaren zusammen mit der Endothelzellschicht lokalisiert, wie wir zuvor gezeigt haben [23, 28]. Da PTX3 das Komplementsystem über die klassischen und Lektinwege aktivieren kann, haben wir die Ablagerung von C1q und MBL im Nierenparenchym untersucht. Interessanterweise wurden C1q- (Abbildung 3E, 3F) und MBL- (Abbildung 3C, 3D) Ablagerungen hauptsächlich auf interstitieller und kapillarer Ebene (Abbildung 3C bis 3F) gefunden, wie zuvor beschrieben [23] und mit PTX3-Ablagerungen kolokalisiert.

C1--Inhibitor stört die PTX3-Bindung an Endothelzellen

In unserer früheren Arbeit [23] haben wir gezeigt, dass die Verabreichung von C1--Inhibitoren zu einer signifikanten Verringerung der Komplementablagerung führte, mit einer verringerten Rekrutierung von infiltrierenden Entzündungszellen und tubulointerstitiellen Schäden. Daher untersuchten wir das Niveau der PTX3-Expression in mit rhC1-INH behandelten Tieren. Wir fanden heraus, dass die Infusion von C1--Inhibitor die PTX3-Ablagerungen in peritubulären Kapillaren und auf interstitieller Ebene nach 15 Minuten nach der Reperfusion reduzierte (Abbildung 4A).

Um die Hypothese zu untermauern, dass die Verringerung von PTX3-Ablagerungen bei mit rhC1-INH behandelten Tieren mit der Hemmung von Endothelschäden verbunden war, führten wir darüber hinaus In-vitro-Experimente durch und bewerteten die Bindung von rhC1-INH und PTX3 kultivierte EC unter normalen Bedingungen oder in Gegenwart von zellulärem Stress (Abbildung 4B). Die FACS-Analyse zeigte, dass EC unter normalen Bedingungen nicht sowohl rhC1-INH als auch PTX3 bindet. In Übereinstimmung mit unserer früheren Studie [26] beobachteten wir eine erhöhte zelluläre Bindung von rhC1-INH bei H2O2--stimulierter EC im Vergleich zu Grundbedingungen. Darüber hinaus könnte PTX3 in Abwesenheit von rhC1-INH aktivierte EC binden. Interessanterweise beobachteten wir, als H2O2-aktiviertes EC mit PTX3 und rhC1-INH inkubiert wurde, dass C1INH in der Lage war, EC zu schützen, nachdem es die PTX3-Bindung blockiert hatte.

DISKUSSION

In dieser Studie haben wir die PTX3-Ablagerung in der frühen Phase der renalen I/R-Verletzung und ihren möglichen Beitrag zur Entwicklung von EndMT nachgewiesen. Interessanterweise haben wir herausgefunden, dass die PTX3--vermittelte Komplementaktivierung hauptsächlich auf vaskulärer Ebene stattfindet und mit C1q und MBL kolokalisiert, den Erkennungsmolekülen der klassischen und Lektinwege der Komplementkaskade.

Eine I/R-Verletzung löst eine ausgeprägte Entzündungsreaktion aus, die durch Komplementaktivierung, sauerstofffreie Radikale und proinflammatorische Zytokinproduktion gekennzeichnet ist, was zur Aktivierung des vaskulären Endothels und der peripheren Leukozyten führt [29, 30]. Während einer I/R-Verletzung führt die Komplementaktivierung zur Ablagerung von Komplementkomponenten auf der Oberflächenmembran von beschädigten und dysfunktionalen EC, mit der gleichzeitigen Erzeugung von Anaphylatoxinen und der Verstärkung des Entzündungsprozesses [31]. Während einer Entzündung steigt PTX3 schnell an und könnte eine zentrale Rolle bei der Modulation der endothelialen Reaktion spielen. Tatsächlich wurde PTX3 als potenzieller Biomarker für vaskuläre endotheliale Dysfunktion bei mehreren Krankheiten, einschließlich chronischer, angezeigtNiereKrankheit, Präeklampsie und mehrere Gefäßerkrankungen [7, 16, 17, 32]. Wir haben auch gezeigt, dass PTX3 an anderen vaskulären Komplikationen wie dem Versagen einer arteriovenösen Fistel bei Hämodialysepatienten beteiligt ist [33]. Diese Beobachtungen legen nahe, dass PTX3 eine Brücke zwischen Entzündungsreaktion und endothelialer Dysfunktion darstellen könnte [34]. In Übereinstimmung mit diesen Studien beobachteten wir bereits 15 Minuten nach der Reperfusion PTX3-Ablagerungen auf Endothelebene (Abbildung 2A, 2B). Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass PTX3 in der frühen Phase der I/R-Verletzung mit dem Myofibroblasten-Marker FSP-1 (Abbildung 2I, 2J) kolokalisiert, aber nicht mit Alpha-SMA, einem Marker, der von aktivierten Myofibroblasten exprimiert wird (Abbildung 2C, 2D). Zusammengenommen könnten diese Daten darauf hindeuten, dass die endotheliale Dysfunktion und der EndMT-Prozess [35], die bei I/R-Tieren [26] beobachtet wurden, zuerst bei EC auftraten, die PTX3 exprimierten.

Die Verbindung zwischen PTX3 und Entzündungszellen ist weithin anerkannt. In diesem Artikel konzentrierten wir uns speziell auf die inhärenten Wirkungen von PTX3 bei der interstitiellen Infiltration von Leukozyten, die eine Hauptquelle von PTX3 sind [36]. Insbesondere fanden wir Makrophagen und dendritische Zellen nach 15 Minuten nach der Reperfusion, die höhere PTX3-Spiegel exprimierten (Abbildung 2E bis 2H). Diese Daten stimmen mit den zunehmenden Beweisen überein, die eine relevante Rolle der angeborenen Immunität bei der Vermittlung früher Schäden bei I/R-Verletzungen nahelegen [23]. Die frühe Aktivierung des Komplements im Nierengewebe nach einer I/R-Verletzung führt zur Bildung mehrerer Entzündungsmediatoren, die die Rekrutierung von Immunzellen erhöhen [21, 23, 37, 38]. Jüngste Studien haben PTX3 als eine der Hauptkomponenten des Netzwerks identifiziert, das die durch eine I/R-Verletzung ausgelöste Entzündungsreaktion orchestriert [39]. In verschiedenen experimentellen Modellen von I/R-Verletzungen kann PTX3 zwei entgegengesetzte Rollen auf spezifische Gewebe ausüben [40, 41]. Eine frühe Produktion von PTX3 ist mit Nierenschäden verbunden, da es eine frühe Expression von endothelialen Adhäsionsmolekülen und Chemokinen induziert, die die lokale maladaptive Entzündungsreaktion beschleunigen.

Im Gegenteil, die verlängerte lokale Produktion von PTX3 verhindert übermäßige Organentzündungen und Funktionsstörungen [41].

PTX3 ist ein Komplement-Kaskadenmodulator [9, 42]; dies stimmt mit den pleiotropen Eigenschaften von PTX3 überein, die auf eine doppelte Rolle von PTX3 als Modulator oder Verstärker der angeborenen Immunantwort hindeuten [39]. Anfänglich aktiviert PTX3 das Komplement, indem es C1q und MBL bindet [43]; jedoch muss eine frühe verstärkte Entzündung auf das Zielgebiet begrenzt werden. Daher könnte PTX3 durch die Rekrutierung von Faktor H oder die Hemmung der Angiogenese auch die Entzündungsreaktion reduzieren und die Aktivierung des Komplements komplementieren, um das Nierenparenchym vor entzündlichen Schäden zu bewahren [43]. Obwohl die Komplementaktivierung in I/R bei Nagetieren hauptsächlich auf tubulärer Ebene lokalisiert ist [44], ist das Endothel während der Reperfusionsphase das primäre Ziel verschiedener entzündungsfördernder Mittel, einschließlich Komplementmediatoren [2]. Wir haben zuvor gezeigt, dass im Schweinemodell der I/R-Verletzung sowie bei DGF-Patienten die Aktivierung des Komplementsystems in der frühen Phase auf peritubulären Kapillaren, innerhalb des Interstitiums und auf dem glomerulären Endothel erfolgt [23]. Unsere Daten zeigten eine klare Kolokalisierung von C5b-9-Ablagerungen auf PTX3 plus EC nach 15 min nach Reperfusion (Abbildung 3A, 3B). Daher scheint das Nierenendothel der vorherrschende Ort der PTX3--vermittelten Komplementaktivierung in der frühen Phase der I/R-Verletzung sowohl im präklinischen als auch im klinischen Umfeld zu sein.

Die Wechselwirkung von Pentraxinen mit C1q und ihre Rolle bei der Aktivierung des klassischen Komplementwegs sind gut beschrieben [45–47]. Im Rahmen der angeborenen Immunantwort kann PTX3 verschiedene Komplementkomponenten binden und die Komplementaktivierung modulieren [43, 48]. PTX3 aktiviert Komplement durch C1q-Bindung [49]. Unsere Ergebnisse im Tiermodell zeigten deutlich, dass PTX3 die Aktivierung des klassischen Signalwegs durch Wechselwirkung mit C1q vermitteln könnte (Abbildung 3E, 3F). Darüber hinaus moduliert PTX3 auch den Lektinweg des Komplements, wie in 3C , 3D gezeigt. MBL bindet PTX3 über seine kollagenähnliche Domäne [45] und MBL/PTX3-Komplexe rekrutieren C1q und lösen C3- und C4-Ablagerung auf Zielzelloberflächen aus.

Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf die zentrale Rolle von PTX3 bei der Vermittlung hinNiereSchäden bei I/R-Verletzungen, was wichtige Auswirkungen auf Komplement-gerichtete Therapien bei renalen I/R-Verletzungen haben könnte.

In unserer vorherigen Studie [26] untersuchten wir die Beteiligung des Komplements an der Vermittlung der EC-Aktivierung, indem wir eine rekombinante Form von C1-INH, einem potenten Inhibitor von Proteasen des klassischen und Lektin-Komplement-Wegs (C1r, C1 s, und MASP2). In demselben Tiermodell zeigten wir (Abbildung 4A), dass die therapeutische Hemmung beider Wege durch rhC1INH die PTX3-Ablagerungen auf peritubulären Kapillaren und auf interstitieller Ebene nach 15 Minuten nach der Reperfusion reduzierte. Diese Daten, die durch In-vitro-Ergebnisse zu EC (Abbildung 4B) bestätigt wurden, führten uns zu der Hypothese, dass rhC1INH beschädigte EC schützen könnte, wenn es die PTX3-Bindung blockiert. In der Literatur gibt es Hinweise auf die Bindung von C1-INH an endotheliale Adhäsionsmoleküle, die auf aktiviertem Endothel exprimiert werden, Selektine genannt, insbesondere P- und E-Selektine [50, 51]. Diese Bindung an EC kann die Endothel-Leukozyten-Interaktion während einer Entzündung stören und stellt einen weiteren wichtigen entzündungshemmenden Mechanismus dar [50, 51]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass rh-C1INH aktiviertes EC binden kann und die lokale Regulation der Komplementaktivierung und des Entzündungsprozesses vermittelt. In unseren früheren Studien haben wir die Beteiligung des Komplements an I/R-Verletzungen und anderen immunvermittelten Nierenerkrankungen gezeigt [38, 52–54]. Die Mechanismen der Komplementaktivierung in diesem Tiermodell könnten wichtige Auswirkungen auf die Interpretation von Daten haben, die im menschlichen Umfeld erwartet werden. Um erfolgreich therapeutische Interventionen zu entwickeln, die auf die Komplementaktivierung abzielen [36, 54], ist es wichtig, die Validität von Schweinedaten in Bezug auf das, was unter klinischen Umständen auftritt, festzustellen. Da diese Forschung auf Beobachtungsstudien beschränkt ist, sind weitere Experimente erforderlich, um die miteinander verbundenen Mechanismen zwischen PTX3 und Komplement zu beschreiben, die neue therapeutische Strategien aufzeigen könnten. Ausgehend von den obigen Ergebnissen stützen unsere Daten die Hypothese, dass PTX3 mehrere Aspekte der Komplement-vermittelten I/R-Verletzung regulieren könnte und dadurch ein potenzielles therapeutisches Ziel darstellt.

MATERIALEN UND METHODEN

Schweinemodell mit renaler I/R-Verletzung

Das Tiermodell der renalen I/R-Verletzung wurde wie zuvor beschrieben entwickelt [23]. Nach Genehmigung durch die Ethikkommission des Gesundheitsministeriums wurden 4- Monate alte weibliche große weiße Schweine (n=8, n=4 für die Gruppe, 20 kg) der Untersuchung unterzogen experimenteller offener chirurgischer Eingriff unter Vollnarkose. Die Tiere fasteten 24 Stunden vor der Narkoseeinleitung. Das Elektrokardiogramm, die Herzfrequenz, die Hämoglobin-Sauerstoffsättigung, die Atemgaszusammensetzung, die Atemfrequenz, das Tidalvolumen, der Atemwegsdruck, der systolische arterielle Blutdruck und der zentralvenöse Druck wurden kontinuierlich überwacht und automatisch aufgezeichnet (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinki, Finnland). . Die linke Nierenarterie und -vene wurden isoliert und eine Gefäßschleife wurde mit einer rechtwinkligen Klemme um die Nierenarterie herum positioniert. Vor der Ischämie (T0) wurde eine Nierenbiopsie durchgeführt. Dann wurde die ischämische Phase durch Ziehen an der Gefäßschlaufe induziert (30 min). Mehrere Biopsien wurden dann 15, 30 und 60 min nach der Reperfusion durchgeführt; Die Tiere wurden 24 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff getötet. Ein Teil jeder Biopsieprobe wurde sofort in einem Medium mit optimaler Schnitttemperatur (Tissuetek, Pittsburgh, PA) schockgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Ein weiterer Teil wurde in gepuffertem Formalin (4 Prozent) für 12 Stunden fixiert und unter Verwendung von Standardverfahren in Paraffin eingebettet.

Mikroskopische Studie

Paraffin-eingebettete Nierenproben aus Nierenbiopsien wurden für herkömmliche histologische Färbungen (H&E, Periodsäure-Schiff) verwendet. Die Bilder wurden mit dem Gerät Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies, Vista, CA, USA) erfasst. Tubulus-interstitielle und glomeruläre Läsionen wurden unter Verwendung einer qualitativen Analyse durch zwei Beobachter (CD, MR) bewertet, die den Ursprung nicht kannten

Antikörper

Die in dieser Studie verwendeten primären Antikörper erkannten die folgenden Antigene: PTX3 (MNB4: direkt gegen die N-terminale Domäne von PTX3, Exira Life Sciences In., Larsen, Schweiz); CD163 (Monozyten/Makrophagen, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (dendritische Zellen, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (fibroblastenspezifisches Protein 1, Abcam, Cambridge, UK); alpha-glattes Muskelaktin (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, USA); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Vereinigtes Königreich); MBL (3E7: direkt gegen die MBL-Kohlenhydraterkennungsdomäne, Hycult Biotechnology, Uden, Niederlande) und C9-Neoantigen (aE11, Hycult Biotechnology). Die Kreuzreaktivität wurde validiert, indem die spezifischen Antikörper vor ihrer Verwendung mit humanen Peptiden, die zu ihrer Züchtung verwendet wurden, vorinkubiert wurden. Die Vorinkubation beseitigte die spezifische Färbung auf Schweinegewebe.

Gewebeimmunfluoreszenz und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

Die Charakterisierung und Lokalisierung des PTX3-Signals wurde an gefrorenem Gewebe untersucht, das in OCT-Medium (Tissue-Tek) enthalten war. Die Objektträger wurden mit 5 % Kaninchenserum 1 Stunde lang bei 37 Grad C inkubiert. Die Objektträger wurden dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit spezifischen Antikörpern inkubiert. Nach drei Waschvorgängen in PBS wurden die Objektträger dann mit den geeigneten sekundären Antikörpern (Alexa Flour 488 und 555, Molecular Probes, Eugene, OR) inkubiert. Alle Schnitte wurden mit TO-PRO-3 (Molecular Probes) gegengefärbt. Negativkontrollen wurden mit irrelevanten Antikörpern hergestellt. Die Schnitte wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Deutschland) analysiert. Die Anzahl der infiltrierenden Zellen wurde in mindestens 10 Feldern hoher Leistung (x630)/Schnitt von zwei unabhängigen Beobachtern gemessen, die gegenüber dem Ursprung der Objektträger geblendet waren. Die endgültigen Zählungen waren der Mittelwert der beiden Maße. In keinem Fall war die Interobserver-Variabilität höher als 20 Prozent.

Zellkultur- und Durchflusszytometrie-Analyse

Humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC, EC) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC-LGC Standards, Sesto San Giovanni, Italien) bezogen. EC wurde in ihrem empfohlenen Medium EndoGro (Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland) gezüchtet. EC wurde mit einer Dichte von 1{{10}},000 Zellen/cm2 ausplattiert und mit H2O2-Behandlung (3 Prozent, 1 Stunde) stimuliert. Dann wurden basale und stimulierte EC zweimal mit PBS gewaschen und wurden mit PBS-EDTA 2 mM und Trypsin 0,001 × entfernt. Dann wurden die Zellen in PBS resuspendiert und jeweils mit PTX3 (rekombinantes humanes PTX3, Sigma-Aldrich, Merck, Deutschland) (1 ug/ml) oder/und mit rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2,5 ug/ml) inkubiert /ml) für 60 min. Nach dreimaligem Waschen mit PBS 1X wurden die Zellen in Durchflusszytometrie (FACS)-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2, 0,2 % Rinderserumalbumin und 0,02 % Natriumazid) resuspendiert und mit FCR-Blockierungsreagenz (Miltenyi Biotec) für inkubiert 10 min bei Raumtemperatur. Nach dem Blockieren wurden ECs mit Kaninchen-Anti-Mensch-C1-INH (bereitgestellt von Prof. M. Daha, Universität Leiden, 1//100-Verdünnung) oder/und mit Ratten-Anti-PTX3 (MNB4, Exira Life Sciences In., 1/20 Verdünnung) bei Raumtemperatur für 30 min gewaschen und mit dem FACS-Puffer gewaschen. Dann wurden die Zellen mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-PE (Molecular Probes, 1/100-Verdünnung) oder/mit Anti-Ratten-IgG-FITC (Molecular Probes, 1/100-Verdünnung) bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert und dreimal gewaschen. Die Zellen wurden mit FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) und Kaluza-Software analysiert. Der positive Bereich wurde unter Verwendung eines Isotyp-abgeglichenen mAb bestimmt, und insgesamt wurden 104 Ereignisse für jede Probe erfasst. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.

statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt und je nach Bedarf unter Verwendung einer Varianzanalyse oder eines gepaarten Student-t-Tests verglichen. Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn die p-Werte kleiner als 0 waren.05. Die Daten wurden unter Verwendung des Softwarepakets Statview (Version 5.0) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA) analysiert. Diagramme wurden mit GraphPad Prism Software 5 angezeigt.

Abkürzungen

I/R: Ischämie/Reperfusion; EC: Endothelzellen; PTX3: Pentraxin 3; FSP-1: Fibroblasten-spezifisches Protein 1; N-Cadherin: neuronales Cadherin; Alpha-SMA: Alpha-Aktin der glatten Muskulatur.

AUTORENBEITRÄGE

CD koordinierte die Studie, war an der Immunmarkierung und konfokalen Mikroskopie von Nierenschnitten beteiligt und verfasste das Manuskript. AS und RF waren am Design der Studie beteiligt, trugen zur Datenanalyse bei, führten In-vitro-Experimente durch und überarbeiteten das Manuskript kritisch. MR und GSN führten eine histopathologische Bildanalyse durch. LL, FS, AMC führten das Tiermodell der Ischämie-Reperfusionsverletzung durch und halfen bei der Überarbeitung des Manuskripts. GL, PD und MB führten alle chirurgischen Eingriffe am Schweinemodell durch und halfen bei der Überarbeitung des Manuskripts. MRD, P.vdP., C.vK. und FS überarbeiteten das Manuskript.

PP, ER, GG, GS und LG haben das Manuskript kritisch überarbeitet. GC stellte neue Analysewerkzeuge bereit, konzipierte und überwachte die Forschung. CD, AS und RF trugen gleichermaßen zu dieser Studie bei. Alle Autoren haben zum Artikel beigetragen und die eingereichte Version genehmigt.

DANKSAGUNGEN

Wir danken Claudia Curci von der Abteilung Renal, Dialysis and Transplantation, Department of Emergency and Organ Transplantation, the

Der Universität Bari für die hervorragende technische Unterstützung.

INTERESSENSKONFLIKTE

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

FINANZIERUNG

Diese Studie wurde unterstützt von der Universität Bari „Aldo Moro“, dem italienischen Gesundheitsministerium (GR 2016- 02362239 „Ein auf Transkriptomik basierender Ansatz zur Identifizierung prädiktiver Faktoren und therapeutischer Ziele für verzögerte Transplantatfunktion inNiereTransplantatempfänger", Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD erhielt ein Stipendium für dieses Projekt) und Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 "Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori" - AIM-1810057-Aktivität 2, die AS gewährt wurde

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