Gehalt an phenolischen Verbindungen und genetische Vielfalt auf Populationsebene im gesamten natürlichen Verbreitungsgebiet der Bärentraube (Arctostaphylos Uva-ursi, Ericaceae) auf der Iberischen Halbinsel

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt:Die Bärentraube (Arctostaphylos uva-ursi) ist eine Heilpflanze, die aufgrund ihres hohen Gehalts traditionell zur Behandlung von Harnwegsinfektionen eingesetzt wirdArbutin(Hydrochinon-D-glucosid), das heute hauptsächlich als natürlicher Hautaufheller in der Kosmetik verwendet wird. Bärentraube wurde auch als Naturprodukt vorgeschlagenAntioxidansAdditiv aufgrund des hohen Gehalts an Phenolverbindungen in den Blättern. Wir haben die Variation von Phenolverbindungen in 42 Wildpopulationen der Bärentrauben untersucht, um aufzuklären, ob intrinsische biologische, klimatische und/oder geografische Faktoren den Phenolgehalt über seine natürliche Verbreitung auf der Iberischen Halbinsel beeinflussen. Bärentraubenblätter wurden im Herbst über einen Zeitraum von drei Jahren (2014–2016) in Populationen über einen Breiten- und Höhengradienten gesammelt. Methanolische Extrakte zeigten eine breite Schwankungsbreite im Gesamtphenolgehalt und unterschiedliche Phenolprofile in Bezug auf dieseArbutin(Gehalte dieses Hauptbestandteils variierten von 87 bis 232 mg/g Trockensubstanz), aber auch Catechin- und Myricetingehalte, die von geografischen und klimatischen Faktoren beeinflusst wurden. Moderate Variationsgrade der Genomgröße – bestimmt durch Durchflusszytometrie – und zweier plastidärer DNA-Regionen wurden auch bei den Populationen festgestellt. Die genetische und zytogenetische Differenzierung von Populationen war schwach, aber signifikant mit der phytochemischen Diversität verbunden. Elite-Bärentraube-Genotypen mit höherenAntioxidansKapazitäten wurden anschließend ermittelt.

Schlüsselwörter: Arbutin; genetische und phytochemische Variabilität; Genomgröße; Haplotypen;natürlichAntioxidantien

Cistanche sind natürliche Antioxidantien

1. Einleitung

Die Synthese pflanzlicher spezialisierter Metaboliten variiert zeitlich (dh Ontogenese, Phänologie und induzierte Abwehr) und räumlich, da sie eine entscheidende Rolle bei der Anpassung der Pflanze an Umweltbedingungen spielt, während auch die genetische Variation für die Chemodiversität verantwortlich ist [1]. Unter diesen Verbindungen haben Phenole eine Vielzahl von Mono- und Polymerstrukturen, die ein breites Spektrum an physiologischen Funktionen erfüllen [2]. Die Biosynthese von spezialisierten Metaboliten wird stark von Umweltfaktoren wie Temperatur, Niederschlag oder Sonneneinstrahlung beeinflusst, die wiederum oft Breiten-, Längen- oder Höhengradienten unterliegen. Insbesondere die Akkumulation von Phenolverbindungen ist eine allgemeine Reaktion auf erhöhte UV-B-Strahlung (280–315 nm). Bei Pflanzen, die in der Mittelmeerregion während des Sommers und in großen Höhen wachsen, wurde über spezifische Zusammensetzungsvariationen berichtet, wo ein höheres Vorkommen von UV-B auftritt und Zimtsäuren und Flavonoide die höchsten UV-Absorptionsraten zeigten [3].

Arbutin(Hydrochinon-D-glucosid) ist eine einfache Phenolverbindung mit begrenztem Vorkommen in den Blättern einiger Arten, die zu Gattungen wie Arbutus, Arctostaphylos, Pyrus oder Vaccinium gehören. Die wichtigste natürliche Quelle für Arbutin, die Bärentraube (Arctostaphylos uva-ursi ( L.) Spreng.) wird seit Jahrhunderten zur Behandlung von Harnwegsinfektionen und anderen Nierenerkrankungen eingesetzt [4], und auch heute noch werden pflanzliche Formulierungen hergestellt [5]. In den letzten Jahren hat sich das Anwendungsspektrum vonArbutinhat sich vor allem als natürlicher Hautaufheller in der kosmetischen Industrie [6] und in klinischen Therapien verbreitetAntioxidans, antibiotische, entzündungshemmende und Antitumoreigenschaften [7]. Folglich besteht ein zunehmendes Interesse daran, zusätzliche natürliche Quellen von zu findenArbutin, sowie biotechnologische Prozesse, die die chemische Synthese ersetzen können [8,9]. In diesem Zusammenhang hat die In-vitro-Produktion von Arbutin mit Datura inoxia-Zellkulturen den Pilotmaßstab erreicht [10].

Zusätzlich zuArbutin, andere phenolische Verbindungen tragen zu den aktiven Eigenschaften von A. uva-ursi bei, wie Flavonoide und Tannine [11,12], von denen Catechin bzw. Corilagin die relevantesten in den Blättern sind [13]. In der Lebensmittelindustrie ersetzen natürliche Verbindungen wie Pflanzenphenole synthetischeAntioxidansKonservierungsmittel [14]. A. uva-ursi wurde als Zusatzstoff insbesondere in Fleischprodukten [15–19], aber auch in aktiven Verpackungen [20] verwendet. Schließlich wurde kürzlich das Potenzial von A. uva-ursi als Quelle für Gerbstoffe für die Lederindustrie vorgeschlagen [21].

Die „Bärentraubeblätter“-Monographie der Europäischen Arzneimittelagentur [5] schlug mindestens 7 Prozent vorArbutinGehalt in getrockneten Blättern als Voraussetzung für Kräuterzubereitungen. Studien, die in den letzten Jahrzehnten durchgeführt wurden, beschrieben Arbutingehalte in Bärentraubenblättern, die von 0 Prozent bis 18 Prozent schwankten, erklärt durch analytische Verfahren, natürliche Variabilität, Wachstumsbedingungen und Erntedatum [4]. Der Arbutingehalt wird normalerweise durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestimmt [4,12,22–24], und frühere Studien haben höhere Werte nachgewiesenArbutinGehalte in im Herbst gesammelten Bärentraubenpflanzen höher als in den im Frühjahr gesammelten [4]. Verschiedene Bärentrauben-Chemotypen wurden beschrieben, die mit der geografischen Verbreitung und der innerartlichen Differenzierung in Unterarten von A. uva-ursi zusammenhängen. Die auffälligste phytochemische Variation, über die berichtet wird, ist das Fehlen von Arbutin in A. uva-ursi subsp. stipitata Packer und Denford, aber auch auf Unterschiede im Methylarbutin-, Ellagsäure- oder Myricetingehalt hingewiesen. Quercetin kommt auch in Bärentraubenblättern vor, in denen sowohl Aglykone als auch ihre 3-O-Glykoside die am häufigsten vorkommenden Flavonoide sind [4]. Die meisten dieser Studien wurden jedoch vor mehreren Jahrzehnten durchgeführt, und heutzutage wird die intraspezifische Variation in der Bärentraube als kontinuierlich angesehen. Die 14 beschriebenen Unterarten, darunter eine aus Spanien (A. uva-ursi subsp. crassifolius (Braun-Blanq.) Rivas Mart. ex Torre, Alcaraz und MB Crespo), sind derzeit nicht akzeptierte Namen und synonym mit A. uva-ursi [ 25]. Neue Untersuchungen sind daher erforderlich, um unser Wissen über die Verbindungen zu verbessern, die tatsächlich im Rohmaterial vorhanden sind, das an verschiedenen Orten für industrielle Zwecke geerntet wird, da beschrieben wurde, dass das chemische Profil von A. uva-ursi-Blättern eine Vielzahl von Phenolen, Tanninen, und Flavonoide in neueren Studien, die durchgeführt wurden, um Unterschiede auf interspezifischer Ebene zu untersuchen [23,26,27].

Genetische (einschließlich zytogenetische) Diversität auf Populationsebene fördert die Anpassung an unterschiedliche Umweltbedingungen [28]. Die Auswirkungen der Polyploidisierung auf die Produktion von spezialisierten Metaboliten in Arznei- und Aromapflanzen wurden kürzlich überprüft [29]. In diesem Zusammenhang ist die Genomgröße ein häufig verwendeter Parameter bei der Bewertung der Pflanzenvariabilität, da die intraspezifische Variation häufig nachgewiesen wird ([30] und darin enthaltene Referenzen), mit vielen anderen biologischen Merkmalen korreliert und eine relevante Rolle in Evolutionsprozessen spielt [31–35 ]. Studien, die sich mit dem Zusammenhang zwischen nukleärer DNA-Menge (dh Genomgröße) und phytochemischer Diversität befassen, sind jedoch sehr selten [36,37]. Die Beziehung zwischen phytochemischer und genetischer Diversität wurde unter Verwendung von Kern-, aber insbesondere Plastid-DNA-Markern [38], insbesondere bei medizinischen [39] und kultivierten [40] Pflanzenarten, bewertet.

Die Bärentraube ist im zirkumborealen Gebiet weit verbreitet, aber die meisten gesammelten Wildpopulationen in Europa befinden sich in den östlichen Ländern, Österreich, der Schweiz, Italien und Spanien Höhen von 550 bis 2350 m ü. Es ist im Norden häufiger, da Populationen in niedrigeren Breiten weniger häufig sind und normalerweise weniger Individuen haben. Die bestehenden Studien zur Variabilität des Arbutingehalts in Spanien beziehen sich auf Werte, die von 8 Prozent in nordöstlichen Populationen [41] und 19 Prozent in spanischem Pflanzenmaterial reichen, die in einer in Deutschland durchgeführten Studie ausgewertet wurden [42]. Unsere Studie zielt darauf ab, Faktoren wie die Genomgröße und die genetische Vielfalt aufzuklären und die phytochemischen Unterschiede in der natürlichen Verbreitung der Bärentraube in Spanien zu erklären. Unsere Ergebnisse könnten zur Auswahl von Pflanzenmaterial für die Pharma-, Kosmetik- und Lebensmittelindustrie beitragen.

hautaufhellende Lebensmittel:CISATNCHE

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1. Chemische Diversitätsanalyse

Bärentraubenblätter, die von insgesamt 249 Pflanzen entnommen wurden, die an 42 spanischen Standorten und über einen Zeitraum von drei Jahren, 2014–2016 (Abbildung 1, Tabelle S1), angebaut wurden, zeigten unterschiedliche Trockengewichtsprozentsätze (dr wt), die von 46,7 (LO) bis 55,1 Prozent (CP), mit einem Durchschnitt von 50,1 ± 2,7 Prozent (Daten nicht gezeigt). Methanolische Extrakte, die aus 2014 und 2015 gesammelten Proben hergestellt wurden, wurden für die Bestimmungen des Gesamtphenol- und Arbutingehalts verwendet. Wir beobachteten eine breite Palette kontinuierlicher Variationen für beide Parameter mit signifikanten Unterschieden (p < 0,001)="" zwischen="" den="" pflanzen.="" blattextrakte="" von="" 80="" pflanzen,="" die="" im="" herbst="" 2014="" beprobt="" wurden="" (abbildung="" 2a),="" zeigten="" gesamtphenolgehalte="" im="" bereich="" von="" 103,3="" ±="" 4,8="" mg="" gae/g="" dr="" wt="" (probe="" li-4)="" bis="" 206,4="" ±="" 6,5="" mg="" gae/g="" dr="" wt="" (sr="" -2),="">ArbutinGehalt schwankte von 92,0 ± 3,0 mg/g dr wt (AN-6) bis 194,2 ± 5,6 mg/g dr wt (SE-8). Die Analyse von Extrakten, die aus Blättern hergestellt wurden, die in 2015 von 94 Pflanzen gesammelt wurden (Abbildung 2b), zeigte ebenfalls eine große phytochemische Variation, von 110,5 ± 3,6 mg GAE/g dr wt(PI-4) bis 200,9 ± 9,8 mg GAE/g dr wt (LO-4) im Gesamtphenolgehalt, während der Arbutingehalt zwischen 87,1 ± 0,4 mg/g dr wt (ET-2) und 211,5 ± 5,9 mg/g dr wt (LI -2). Darüber hinaus sind unabhängig vom Erfassungsjahr signifikante Unterschiede in den Gesamtphenolen uArbutinGehalte wurden unter Bärentraubenpflanzen festgestellt, die für die meisten Populationen am gleichen Standort wuchsen (Daten nicht gezeigt). Die Arbutinspiegel korrelierten signifikant mit dem Gesamtphenolgehalt in Bärentraubenblattextrakten, da wir signifikante Pearson-Koeffizienten von {{0}} schätzten. 0,332 (p=0 0,003) für 2014 und 0,289 für 2015-Daten (p=0 0,005). Der Arbutingehalt der 48 Pflanzen, die in beiden Jahren beprobt wurden, variierte nicht signifikant (p=0,380).

Trotz der gefundenen Variabilität innerhalb der Populationen und unabhängig vom Erntejahr zeigte die Varianzanalyse, dass der Arbutingehalt von Bärentraubenblattextrakten ebenfalls abhängig war (p < {{0}}.00="" 1)="" populationsstandort="" (abbildung="" 3a,b),="" wie="" für="" den="" gesamtphenolgehalt="" von="" bärentraubenblättern,="" analysiert="" in="" 2015="" (p="">< 0.001,="" abbildung="" 3b).="" im="" gegensatz="" dazu="" wurden="" bei="" den="" 10="" im="" jahr="" 2014="" beprobten="" populationen,="" die="" sich="" auf="" einem="" relativ="" kleinen="" gebiet="" befanden,="" aber="" über="" einen="" weiten="" höhenbereich="" verteilt="" waren,="" keine="" signifikanten="" unterschiede="" im="" gesamtgehalt="" an="" phenolen="" beobachtet="" (p="0.080)," von="" 424="" (ba="" bevölkerung)="" bis="" 1410="" m="" ü.m.="" (pa-bevölkerung).="" diese="" höhenvariation="" war="" mit="" unterschieden="" in="" den="" klimatischen="" bedingungen="" verbunden="" (tabelle="" s1),="" da="" orte="" in="" höheren="" lagen="" durch="" niedrigere="" mittlere="" temperaturen="" (korrelationskoeffizient="" nach="" pearson,="" r="−0,666," p="">< 0,001)="" und="" höhere="" jährliche="" niederschläge="" (="" r="0.485," p="">< 0,001),="" was="" wiederum="" zu="" niedrigeren="" globalstrahlungswerten="" führte="" (r="−0,390," p="">< 0,001).="" darüber="" hinaus="" schätzten="" wir="" aus="" diesem="" datensatz="" eine="" geringe,="" aber="" signifikante="" positive="" korrelation="" zwischen="" dem="" jährlichen="" niederschlag="" und="" dem="" gesamtphenolgehalt="" von="" bärentraubenpflanzen="" (spearman-koeffizient="" rho="0.256," p="0.022)," während="" aus="" dem="" datensatz="" von="" 2015="" als="" wir="" populationen="" in="" einem="" größeren="" gebiet="" beprobten,="" stellten="" wir="" eine="" signifikante="" positive="" korrelation="" zwischen="" jährlichem="" niederschlag="" und="" arbutingehalt="" fest="" (rho="0.246," p="0.017)." diese="" signifikante="" korrelation="" weist="" darauf="" hin,="" dass="" bärentraubenpflanzen,="" die="" an="" nördlichen="" standorten="" und="" in="" relativ="" höheren="" lagen="" wachsen,="" häufig="" höher="">ArbutinInhalt (rho=0.217, p=0.035 bzw. rho=0.269, p=0.009). Wie erwähnt, korrelierten diese höheren Arbutingehalte signifikant mit höheren Gesamtphenolgehalten von Bärentraubenblättern, die ähnlich waren (im Durchschnitt 154,4 ± 19,6 mg GAE/g Trockensubstanz) wie diejenigen, die in wässrigen Extrakten anderer verwendeter Pflanzenarten gefunden wurdenAntioxidansZusatzstoffe in der Lebensmittelindustrie [43], wie Rosmarin (185,0 mg GAE/g Dr. Gew.), Tee (149,3 mg GAE/g Dr. Gew.) oder Guave (154,4 mg GAE/g Dr. Gew.). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Referenzen überein und wurden in einer von Wrona et al. durchgeführten Studie bestätigt. [20] unter Verwendung einiger der 2015 gesammelten spanischen Bärentraubenblattproben, für die höherAntioxidansKapazität war mit höher verbundenArbutinInhalt. Zu diesem Zweck konnten auch Elite-Bärentrauben-Genotypen identifiziert werden, wie die Individuen 1, 4, 7 und 8 aus der LO-Population, die in den zwei Studienjahren im Durchschnitt 183,3 ± 16,4 mg GAE/g dr wt ansammelten.

Um klimatische und geografische Faktoren, die die Muster der Phenolvariation beeinflussen, weiter aufzuklären, haben wir im Herbst 2016: 140 Bärentraubenpflanzen, die an 29 Standorten wachsen, eine umfassendere Probensammlung durchgeführt und fünf Phenolverbindungen quantifiziert (Abbildung S1a), die durch Koelution mit Standards in einem Acetonitril/Wasser-Gradienten identifiziert wurden (Abbildung S1b). Die Analyse zeigte große Bereiche kontinuierlicher Schwankungen für Arbutin-, Kaffeesäure-, Catechin-, Myricetin- und Quercetin-Glucosidgehalte mit signifikanten Unterschieden zwischen Pflanzen, die auch im Allgemeinen innerhalb von Populationen beobachtet wurden (Daten nicht gezeigt). Für die wichtigsten phenolischen Bestandteile fanden wir, dass der Arbutingehalt im Bereich von 91,1 ± 5,0 (LB{{10}}) bis 232,4 ± 2,8 mg/g dr wt (PT{{15 }}), während die Catechin-Gehalte im Bereich von 4,1 ± 0,1 (AF{{20}}) bis 45,5 ± 1,4 mg/g dr wt (LB-5) lagen. In Bezug auf die beiden anderen bestimmten Flavonoide wurde Myricetin in einigen Pflanzen aus mehreren Populationen nicht nachgewiesen, während es 21,2 ± 1,2 mg/g dr wt in PO{{3{0}} erreichte, und Quercetin-Glucosid variierte von 3,8 ± 0,1 (CO -3) bis 22,8 ± 0,8 mg/g dr wt (BT-3). In Bärentraubenblattextrakten wurden niedrigere Gehalte an Kaffeesäure festgestellt, die von 1,8 ± 0,0 (IZ-1) bis 7,1 ± 0,3 mg Pflanzen /g Dr. Gew. (SI-4) variierten.

Trotz der zwischen Individuen beobachteten Variation wurden auch signifikante Unterschiede zwischen Populationen für diese fünf Verbindungen geschätzt (Kruskal-Wallis-Tests, p < {{0}}.001="" und="" p="0)." 009="" für="" kaffeesäuregehalt).="" höhere="" arbutingehalte="" wurden="" im="" durchschnitt="" in="" pflanzen="" aus="" natürlichen="" ab-,="" gu-,="" ln-="" und="" lo-populationen="" festgestellt="" (abbildung="" 4a),="" die="" sich="" signifikant="" (nach="" bonferroni-korrektur)="" von="" den="" niedrigen="" gehalten="" unterschieden,="" die="" in="" pflanzen="" aus="" der="" lb-population="" gefunden="" wurden="" (186,7="" ±="" 22,3,="" 193,9="" ±="" 12,1,="" 169,5="" ±="" 10,0="" bzw.="" 169,2="" ±="" 5,2="" mg/g="" dr="" wt="" vor="" bis="" 111,8="" ±="" 16,0="" mg/g="" dr="" wt).="">ArbutinGehalte von Pflanzen, die ebenfalls in 2015 beprobt worden waren, schwankten zwischen den Jahren nicht signifikant (p=0.821). Die Population LB zeigte wiederum einen höheren mittleren Catechinspiegel (Abbildung 4b), der sich signifikant von den niedrigen mittleren Gehalten dieses Flavonoids unterschied, die in den Populationen AF und LC nachgewiesen wurden (32,8 ± 9,8 gegenüber 5,7 ± 1,9 und 5,3 ± {{2{{62}). }}}.5 mg/g dr wt). Mittlere Myricetin- und Quercetin-Glucosidgehalte sind in Abbildung 4c dargestellt, mit signifikanten Unterschieden zwischen den Populationen AB, CG, LB und PO, mit höheren Myricetingehalten (15,1 ± 4,0, 14,6 ± 5,7, 10 0,7 ± 2,8 bzw. 17,2 ± 3,9 mg/g dr wt) im Vergleich zu den niedrigen Konzentrationen, die sich bei durchschnittlichen Pflanzen der Populationen CO und OD ansammelten (1,2 ± 1,5 bzw. 2,4 ± 3,6 mg/g dr wt) und bedeutet auch, dass die in den Populationen AA, BT, CP, IZ und LB bestimmten Quercetin-Glucosid-Gehalte (15,2 ± 3,7, 15,9 ± 4,6, 11,8 ± 2,3, 15,7 ± 3,4 bzw. 13,1 ± 4,6 mg/g dr wt) signifikant unterschiedlich waren davon in der Population CO (4,0 ± 0,1 mg/g dr wt). Im Gegensatz dazu schwankte der mittlere Kaffeesäuregehalt von 2,1 ± 0,2 mg/g dr wt in den Populationen AB, CE, PT und SA bis zu 3,5 ± 1,2 mg/g dr wt in der Population AF oder 3,4 ± 2,2 mg/g dr wt in Bevölkerung SI; daher wurden keine signifikanten Unterschiede aufgrund von Schwankungen innerhalb der Population beobachtet (durchschnittlicher Gehalt 2,7 ± 0,8 mg/g Trockenmasse). Diese Ergebnisse ergänzen die von Wrona et al. beobachteten Schwankungen bei phenolischen Metaboliten. [20], für acht der 2015 beprobten Bärentraubenstandorte, die mit der UPLC®-ESI-Q-TOF mit MSE-Technologie analysiert wurden.

Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Analyse, die mit Bärentraubenproben aus den Jahren 2014 und 2015 durchgeführt wurde,ArbutinGehalte, die in 2{{10}}16 Proben bestimmt wurden, zeigten eine geringe, aber signifikante positive Korrelation mit Strahlung (rho=0.256, p=0.002) und maximalen Durchschnittstemperaturen (rho{ {5}}.183, p=0.030) und waren daher umgekehrt korreliert mit den jährlichen Niederschlagswerten (rho=−0.265, p=0.002). Diese Unterschiede waren auch mit Höhenunterschieden verbunden (rho=−0,192, p=0,023), aber diese negative Korrelation wurde durch das erwähnte Tief erklärtArbutinInhalt von Pflanzen aus der LB-Population, die sich auf 1720m befinden. Ein ähnliches Variationsmuster wurde für den Myricetingehalt beobachtet, da höhere Konzentrationen dieser Verbindung signifikant mit Bärentraubenpflanzen assoziiert waren, die an Standorten mit höheren Strahlungsniveaus wuchsen (rho=0.226, p=0.{{1{{ 12}}}}07). Das entgegengesetzte Muster zu dem von Arbutin wurde für Catechin beobachtet, da eine positive Korrelation zwischen diesem Flavonoid und dem jährlichen Niederschlag geschätzt wurde (rho=0.398,p < 0.0{{23="" }}1),="" und="" dementsprechend="" wurden="" negative="" korrelationen="" mit="" strahlung="" und="" mit="" maximaler="" mittlerer="" temperatur="" festgestellt="" (rho="−0.307," p="">< 0,001="" und="" rho="−0,470," p="">< 0,001,="" beziehungsweise).="" diese="" variation="" der="" klimatischen="" faktoren="" erklärte,="" dass="" sowohl="" die="" höhe="" als="" auch="" der="" breitengrad="" den="" catechingehalt="" von="" bärentraubenblättern="" beeinflussten="" (rho="0.410" bzw.="" 0,490,="" p="">< 0,001).="" eine="" hauptkomponentenanalyse,="" die="" mit="" phytochemischen,="" klimatischen="" und="" geografischen="" daten="" durchgeführt="" wurde,="" die="" den="" 29="" im="" jahr="" 2016="" beprobten="" orten="" entsprechen,="" bei="" denen="" die="" beiden="" ersten="" komponenten="" 60="" prozent="" der="" beobachteten="" variation="" erklärten,="" bestätigte="" diese="" ergebnisse="" (abbildung="" 5).="" wir="" haben="" keine="" signifikante="" korrelation="" zwischen="" dem="" kaffeesäure-="" oder="" quercetin-glucosidgehalt="" von="" bärentraubenpflanzen="" und="" klimatischen="" oder="" geografischen="" faktoren="" festgestellt,="" obwohl="" wir="" leichte,="" aber="" signifikante="" korrelationen="" zwischen="" myricetin-="" und="" quercetin-glucosidgehalt="" schätzten="" (rho="0.184," p="" {{31}="" }.030)="" und="" zwischen="" myricetin-="" und="" kaffeesäuregehalt="" (rho="−0.176," p="0.037)" von="">

Die beobachteten kontrastierenden klimatischen Variationsmuster inArbutinGehalt von Bärentraubenpflanzen legen nahe, dass, obwohl die Biosynthese dieses Metaboliten wahrscheinlich unter Bedingungen höherer Strahlung und Temperatur erhöht wird, Wasserknappheit wahrscheinlich ein limitierender Faktor für A. uva-ursi im Mittelmeerraum und in südlichen Regionen ist. Del Valleet al. [44] berichteten über ein Breitenmuster der Flavonoidakkumulation von Silene littorea (Caryophyllaceae) in Spanien, wo höhere Flavonoidgehalte in südlichen Populationen festgestellt wurden, da der Breitengrad negativ mit UV-B-Strahlung und Temperatur und positiv mit Niederschlag korrelierte. Die Globalstrahlung zeigt einen deutlichen Breitengradienten mit einer höheren Inzidenz im Süden und Osten der Iberischen Halbinsel, und es gibt auch einen signifikanten orografischen Effekt, da die Persistenz der Wolken die Inzidenz dieser Strahlung in größeren Höhen moduliert. Eine UV-Strahlungskarte von Spanien [45] bezeichnete hohe Korrelation (r > 0.9) zwischen UV-B- und Globalstrahlungsdaten. Laut dieser Referenz zeigten Bärentraubenpopulationen einen höheren MittelwertArbutinDie Inhalte in unserer Studie befinden sich hauptsächlich in Gebieten mit UV-B-Strahlungswerten von 2403–2451 J/m2.

Unsere Ergebnisse für die Catechin-Variation in der Bärentraube zeigten ein geografisches Muster (Abbildung 5) und stimmen mit Studien überein, die an anderen Pflanzenarten aus nördlichen Ländern Europas durchgeführt wurden. Höhere Gehalte an spezialisierten Metaboliten, wie Flavonoiden und Anthocyanen, wurden in Pflanzen berichtet, die in höheren Breiten wachsen, wahrscheinlich aufgrund längerer Tageslichtperioden und niedrigerer Nachttemperaturen [46]. Dabei nahm der Gehalt an löslichen Phenolen in den Nadeln von Juniperus communis mit Breitengrad und Höhe in finnischen Populationen zu [47], und auch 10–19 Prozent höhere Phenolgehalte wurden in höheren Breitengraden in Früchten von drei Ribes spp. gefunden. Sorten, die an zwei finnischen Orten analysiert wurden [48]. Diese Autoren brachten einen niedrigeren Phenolgehalt mit höheren Strahlungs- und Temperaturwerten in Verbindung. Der Flavonoidgehalt in Früchten von zwei Arten von Vaccinium (ebenfalls aus der Familie Ericaceae) zeigte einen geografischen Gradienten mit höheren Mengen an Offflavonoiden in nördlichen Breiten [49,50].

In Bezug auf die Höhenvariation wurden höhere Konzentrationen von Flavonoiden in Populationen anderer Ericaceae-Arten, Calluna vulgaris, bestimmt, die in höheren Lagen wachsen [51]. Höhengradienten beeinflussten auch den spezialisierten Stoffwechsel spanischer Populationen von Arnica montana [52] und Quercus robur [53]. Die letztere Arbeit verwies auf einen signifikanten positiven Zusammenhang zwischen der Konzentration der gesamten Blattphenole und der Höhe, da der Gradient nur von Flavonoiden abhängt, was darauf hindeutet, dass diese Verbindungen trieben die Beziehung für Gesamtphenole voran. Diese Ergebnisse stimmen mit unseren Schätzungen für das Catechin-Gehaltsmuster überein. Schließlich war ein Niederschlagsgradient mit signifikanten Unterschieden in der Polyphenolzusammensetzung in einem afrikanischen Heilstrauch (Myrothamnus flabellifolia) verbunden, für den metabolische Unterschiede mit der genetischen Struktur von Populationen übereinstimmten [54].

CISTANCHE KANN ANTI-AGING

2.2. Genomgröße und Sequenzdatenanalyse

Die Genomgröße 2C-Werte von Bärentraubenpflanzen lagen im Bereich von 2,50 bis 3,15 pg (Tabelle 1). Zwischen den Populationen wurden geringfügige Unterschiede in der Kern-DNA-Menge gefunden (Kruskal-Wallis χ2=87.639, df=36,p=3.39 × 10−6). Der Dunn-Test mit Bonferroni-Korrektur ergab statistisch signifikante Unterschiede zwischen: AL- und SI-Populationen (Z=−3,972, p=0,024), LE und SI (Z=−4,196, p {{ 21}}.009) und SE und SI (Z=–4.236, p=0.008). Die Population von Pontils (PO) ist die Typuslokalität von A. uva-ursi var. crassifolius, die später als A. uva-ursi subsp. crassifolius, der derzeit taxonomisch nicht berücksichtigt wird (siehe Einleitung), hat einen mittleren Wert (2,88 pg) innerhalb des Bereichs von Werten, die in anderen Populationen der Art erhalten wurden. Dies ist die erste umfassende Populationsstudie über die nukleäre DNA-Menge in der Art und der gesamten Gattung, da die einzigen verfügbaren Informationen bis heute von einer Balkanpopulation desselben Taxons stammen [55]. Der dort angegebene 2C-Wert liegt mit 2,49 pg knapp an der unteren Grenze der Variationsbreite des hier untersuchten Datensatzes. Es wurde keine Korrelation zwischen den Werten der Genomgröße und der Populationshöhe gefunden. Die DNA-Menge von Personen zeigte eine schwache positive signifikante Korrelation mit derArbutinInhalt, wenn Daten von 158 Bärentraubenpflanzen verglichen wurden (rho=0.187, p=0.018), während keine andere signifikante Korrelation zwischen Genomgröße und anderen Variablen gefunden wurde. Dieses Ergebnis stimmt mit den berichteten Steigerungen der Produktion von spezialisierten Metaboliten überein, die im Allgemeinen in medizinischen und aromatischen Pflanzen nach der Polyploidisierung beobachtet werden [29].

Neu produzierte Sequenzen für rpl{{0}}trnL- und psbE-petN-intergenische Spacer wurden in zwei Matrizen (enthaltend 566 bzw. 874 bp) ausgerichtet, die in einer einzigen Matrix von 1440 bp verkettet wurden. Mäßig Variationsgrade in diesen Plastidenregionen wurden nachgewiesen (sechs Nukleotidsubstitutionen und vier Indels). Es wurden zehn verschiedene Haplotypen mit einer Haplotyp-Gesamtdiversität (Hd) von 0.468 (Tabelle 1) gefunden. Die meisten Populationen (21) enthielten nur einen Haplotyp, während fünf von ihnen eine gewisse Diversität zwischen Individuen aufwiesen. Der am häufigsten vorkommende Haplotyp 1 zeigte die höchste Häufigkeit (71,4 Prozent), gefolgt von Haplotyp 2 (15,2 Prozent), während der Rest von ihnen viel niedrigere Häufigkeiten aufwies (0,04–0,01 Prozent). Die geografische Verteilung der Haplotypen ist in Abbildung 6 dargestellt. Haplotyp 1 wurde in 32 Populationen gefunden – er wurde in 18 von ihnen fixiert – verteilt über alle beprobten Regionen mit Ausnahme der südlichsten Orte. Haplotyp 2 wurde in zehn Populationen gefunden und war der ausschließliche Haplotyp in den beiden südlichsten Populationen (HU und LV) sowie in PR. Haplotyp 4 stammte von drei Populationen aus den Pyrenäen, während Haplotyp 8 in zwei Populationen von der östlichen iberischen Halbinsel vorkam. Hinsichtlich der im Sparsamkeitsnetzwerk (Abbildung 6) gezeigten evolutionären Beziehungen sind die meisten Haplotypen durch einen oder zwei Mutationsschritte verbunden. Haplotyp 1 nimmt eine zentrale Position ein, mit der sieben Haplotypen verbunden sind.

Ein Mantel-Test zwischen den pDNA-genetischen und chemischen paarweisen Abstandsmatrizen zeigte eine schwache, aber signifikante Korrelation (r=0.301; p=0.048) zwischen der genetischen Differenzierung und der Konzentration der fünf chemischen Komponenten, die für die gemessen wurden Datensatz 2016. Der Mantel-Test zeigte keine signifikante Korrelation zwischen genetischer und geografischer Distanz zwischen den 25 Populationen, die 2016 beprobt wurden (r=0.103, p=0.207) oder zwischen den chemischen und geografischen paarweisen Distanzen zwischen diesen 25 Populationen (r=0.191, p=0.050). Die hier berichtete phytochemische Variabilität für Bärentrauben-Wildpopulationen in ganz Spanien wird daher durch ein moderates Maß an pDNA-Haplotyp-Variation ergänzt, wobei es sich um die in Bärentraubenpopulationen gefundene genetische Nord-Süd-Differenzierung handelt, die mit phylogeografischen Mustern anderer Pflanzen vergleichbar ist (z. B. [56–58]. All diese Homogenität wird in Pflanzen mit geringer Reproduktionsfähigkeit erwartet [59], wie A. uva-ursi, die schlechte Keimungsraten und hohe Sterblichkeitsraten junger Sämlinge aufweist [4] Nichtsdestotrotz korreliert die bescheidene genetische Differenzierung durch pDNA mit biochemischen paarweise Abstände geschätzt aus Profilen von fünf phenolischen Abbildung 6. Geografische Verteilung von pDNA-Haplotypen auf iberischen Populationen von Arctostaphylos uva-ursi.Populationscodes entsprechen denen in Tabelle S1, und Tortendiagramme stellen den Prozentsatz der Individuen dar, die jeden Haplotyp in jeder Population zeigen Rechteck, das statistische Sparsamkeitsnetzwerk, das die evolutionären Beziehungen des te zeigt n Plastiden-Haplotypen, die in Populationen von A. uva-ursi gefunden wurden, sind dargestellt. Jeder Streifen entlang der Linien, die die Haplotypen verbinden, zeigt einen Mutationsschritt in den in dieser Studie sequenzierten pDNA-Regionen an }}.048) zwischen der genetischen Differenzierung und der Konzentration der fünf chemischen Komponenten, die für den Datensatz 2016 gemessen wurden. Der Mantel-Test ergab keine signifikante Korrelation zwischen genetischer und geografischer Distanz zwischen den 25 Populationen, die 2016 untersucht wurden (r=0.103, p=0.207) oder zwischen den chemischen und geografischen paarweisen Distanzen zwischen diesen 25 Populationen ( r=0.191, p=0.050). Die hier berichtete phytochemische Variabilität für Bärentrauben-Wildpopulationen in ganz Spanien wird daher durch moderate Ebenen der pDNA-Haplotypvariation ergänzt, wobei es sich um die genetische Nord-Süd-Differenzierung in Bärentraubenpopulationen handelt, die mit phylogeografischen Mustern vergleichbar ist, die in anderen Pflanzen gefunden werden (z. B. [56–58]). All diese Homogenität wird in Pflanzen mit einer geringen Reproduktionsfähigkeit erwartet [59], wie A. uva-ursi, die schlechte Keimungsraten und hohe Sterblichkeitsraten junger Sämlinge aufweist [4] Dennoch korrelierte die bescheidene genetische Differenzierung, die durch pDNA gezeigt wurde, mit biochemischen paarweisen Abständen, die aus Profilen geschätzt wurden von fünf phenolischen Verbindungen. Dieses Muster der genetischen und phytochemischen Variation (die, wie erwähnt, nicht mit geografischen Entfernungen in Verbindung gebracht wurde) sowie die schwache, aber signifikante Korrelation zwischen Genomgröße und Arbutingehalt können darauf hindeuten, dass die natürliche genomische Variabilität den Ertrag an phenolischen Verbindungen beeinflusst A. uva-ursi, hypervariable molekulare m Forscher in einer umfassenderen Populationsstichprobe sind notwendig, um diese phylogeographischen Muster und die Assoziation zwischen genetischer und biochemischer Variabilität zu bestätigen.

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3. Materialien und Methoden

3.1. Pflanzenmaterial

Für die phytochemische Analyse wurden im Herbst 2014, 2015 und 2016 insgesamt 249 Bärentraubenpflanzen, die in 42 Populationen wachsen, beprobt, was repräsentativ für die natürliche Verbreitung dieser Pflanzenart auf der Iberischen Halbinsel ist (Abbildung 1 und Tabelle S1). Zuerst sammelten wir im Herbst 2014 Endtriebe von 80 Pflanzen in zehn spanischen Populationen (AG, AN, BA, LI, LO, PE, PÁ, SR, SC und SE) in einem relativ kleinen Gebiet (ungefähr 80 × 50 km). in Nordspanien, aber in einem weiten Höhenbereich (424–1410 m ü.M.). Zweitens haben wir im Herbst 2015 48 Pflanzen von sechs dieser Populationen (AG, LI, LO, PA, SE und SR) und 46 Bärentraubenpflanzen von sechs Populationen in niedrigeren Breiten (AL, CH, ET, HU, LV) gesammelt , und PI). Für jede Population beprobten wir acht Pflanzen, die mindestens 5 m voneinander entfernt waren, außer in HU, wo wir nur sechs Individuen fanden. Drittens wurden im Herbst 2016 insgesamt 140 Pflanzen an 29 verschiedenen Orten (jeweils 1–6 Individuen) beprobt, darunter 26 neue spanische Fundorte (IZ, CE, BT, MO, AA, GU, SI, AF, SA, PT, AB, CG, OD, PS, LB, CO, LE, MA, CP, PO, MZ, AV, LC, AY, LN und ZU). Unsere Probenahme umfasst einen Höhenbereich von 534 bis 1750 m. Insgesamt repräsentieren die 42 Populationen ein breites Spektrum an klimatischen Bedingungen (Tabelle S1): Die maximale mittlere Temperatur zeigte eine 2--fache Variation (13–26 ◦C) und der jährliche Niederschlag schwankte zwischen 399 (ZU) und 1589 mm (PT). Die Globalstrahlung lag zwischen 4,2 und 5,1 kWh/m2d. Sechs bis zehn Endtriebe (15–20 cm lang) wurden für jede Pflanze gesammelt, um 6–15 g gesunde Blätter zu erhalten, die anschließend ausgeschnitten und bei 60 °C getrocknet wurden, um ein konstantes Gewicht zu erhalten (3–4 Tage). Nach der Trockengewichtsbestimmung wurden die Blätter manuell in einem Mörser homogenisiert und bis zur Analyse bei 4 °C gelagert. Dieses Pflanzenmaterial wurde für Gesamtphenole und HPLC-Bestimmungen eingesetzt.

Blattmaterialien für durchflusszytometrische Bewertungen wurden von frischen Blättern von 178 Individuen erhalten, die zu insgesamt 37 Populationen gehören (Tabelle 1). Proben wurden von 33 der oben genannten Populationen und von vier neuen Populationen (BE, JO und PR in Spanien und EN in Andorra) erhalten, wo im Frühjahr 2017 Blätter gesammelt wurden, und wurden daher nicht in die phytochemische Analyse aufgenommen (Abbildung 1 und Tabelle S1). Von einem bis zu sechs Individuen pro Population wurden doppelt gemessen. Blattmaterialien für die DNA-Extraktion wurden in Kieselgel getrocknet und bei Raumtemperatur gelagert. DNA-Diversitätsanalysen wurden an insgesamt 105 Pflanzen von 35 Standorten durchgeführt (Tabelle 1).

Pflanzenbelege der 46 untersuchten Bärentraubenpopulationen sind hinterlegt im Herbarium BC, des Institut Botànic de Barcelona, ​​im Herbarium BCN, des Centre de Documentació de BiodiversitatVegetal, Universitat de Barcelona oder im Herbarium JACA, des Instituto Pirenaico de Ecología ( CSI).

3.2. Herstellung von Blattextrakten und Gesamtphenolbestimmung

Drei Wiederholungen von Bärentraubenblattextrakten wurden unter Verwendung von 50 mg getrockneter Probe und 10 ml 80-prozentigem Methanol hergestellt. Die Röhrchen wurden 30 min in einem Ultraschallbad inkubiert, und dann wurden die Extrakte filtriert (0,45 mm) und bis zur Analyse bei 4 ◦C gelagert. Der Gesamtphenolgehalt wurde in den Extrakten bestimmt, die aus Proben hergestellt wurden, die 2014 und 2015 gesammelt wurden. Wir folgten einer Folin-Ciocalteum-Methode [60,61] mit leichten Modifikationen: zu 0,1 ml Extrakt, 0,4 ml Methanol (80 Prozent), 0,5 ml Folin– Ciocalteu-Reagenz und 8 ml ultrareines Wasser wurden zugegeben. Nach 5 min im Ultraschallbad wurde 1 ml Na2CO 3 20 Prozent (w/v) zugegeben. Die Proben wurden 30 min lang im Dunkeln belassen, bevor die Extinktion bei 760 nm mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (CARY 50 BIO, Varian, Agilent Technologies) gemessen wurde. Die Ergebnisse wurden in Gallussäureäquivalenten (GAE) ausgedrückt; das heißt, mg Gallussäure/g dr wt, unter Verwendung einer Gallussäure-Standardkurve (40–340 µg/g).

3.3. Bestimmung von Arbutin und anderen Phenolmetaboliten

Der Phenolgehalt von Methanolextrakten aus Bärentraubenblättern wurde durch RP-HPLC unter Verwendung eines HPLC-UV/Vis-Systems (LaChrom Merck Hitachi L-7400) mit einem Kinetex 5 µm-EVO C18 (250 mm × 4,6 mm) quantifiziert )-Säule und Extinktion bei 280 nm bestimmt. Extrakte aus Proben, die 2014 und 2015 gesammelt wurden, wurden 1:10 (v/v) verdünnt und mit einer mobilen Phase aus Methanol und Acetonitril injiziert. Das Gradientenprogramm bestand aus 0–5 min, 25 Prozent Methanol; 5–6 min, 100 Prozent ; 6–10 min, 100 Prozent und 10–20 min, wieder 25 Prozent Methanol. Die Flussrate war 1 ml/min und das Injektionsvolumen war 20 &mgr;l. Unter diesen Bedingungen beträgt die Aufbewahrungszeit vonArbutinbetrug 2,6 min, wodurch wir die Konzentration dieser Verbindung unter Verwendung einer Kalibrierungskurve bestimmen konnten, die mit 6 Verdünnungen eines Standards von 4 0 bis 340 µg/g mit einem Korrelationskoeffizienten von r=0 erstellt wurde. 9997. Extrakte aus 2016 gesammelten Proben wurden mit einer mobilen Phase aus Methanol und Wasser mit dem folgenden Gradientenprogramm analysiert: 0–5 min, 10 Prozent Methanol; 5–6 Minuten, 20 Prozent ; 6–10 min, 20 Prozent ; 10–11 min, 30 Prozent ; 11–15 Minuten, 30 Prozent; 15–16 Minuten, 40 Prozent; 16–20 min, 40 Prozent ; 20–21 min, 50 Prozent ; 21–25 min, 50 Prozent ; 25–26 min, 60 Prozent ; 26–30 Minuten, 60 Prozent; 30–31 Minuten, 10 Prozent; und 31–36 min, wiederum 10 Prozent Methanol. Unter diesen Bedingungen haben wir festgestelltArbutin undandere 4 phenolische Verbindungen: Kaffeesäure, Catechin, Myricetin und Quercetin-3-O-Glucopyranosid unter Verwendung der entsprechenden Kalibrierungskurven, die mit 5 Verdünnungen von Standards erstellt wurden (25–500 µg/mL) , die Korrelationskoeffizienten von {{10}},9992 für Catechin (Retentionszeit 12,0 min), 0,9924 für Kaffeesäure (Retentionszeit 13,4 min), 0,9981 für Quercetin zeigten{{16} }O-Glucosid (Retentionszeit 23,4 min) und 0,9997 für Myricetin (Retentionszeit 25,1 min).

Methanol und Acetonitril waren in HPLC-Qualität und wurden von Panreac (Barcelona, ​​Spanien) bezogen. Standards (Reinheit größer als oder gleich 98 Prozent).Arbutin, Kaffeesäure und Gallussäure sowie das Folin-Ciocalteu-Reagenz wurden von Sigma-Aldrich (Barcelona, ​​Spanien) bezogen. Catechin- und Quercetin-3--O-Glucopyranosid-Standards wurden von Extrasynthese (Genay Cedex, Frankreich) gekauft, während Myricetin von Alfa Aesar (Karlsruhe, Deutschland) gekauft wurde.

Die Ergebnisse der chemischen Bestimmungen wurden unter Verwendung der Software SPSS v. 25 und R 3.5.2 analysiert. Nach dem Testen der Daten auf Normalität und Homoskedastizität führten wir die Varianzanalyse verschiedener Datensätze und Mittelwerttrennungstests (Tukey und Tamhane) oder nichtparametrische Tests durch als Kruskal-Wallis- und Dunn-Mehrfachvergleichstest mit Bonferroni-Korrektur. Wir schätzten auch Korrelationskoeffizienten (Pearson oder Spearman, je nachdem, ob die Daten einer Normalverteilung folgten) zwischen Variablen, einschließlich der Genomgröße.

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3.4. Schätzungen der Genomgröße und DNA-Sequenzierung

Die Genomgröße von Bärentraubenpflanzen wurde durch Durchflusszytometrie an den Centres Científicsi Tecnològics, Universitat de Barcelona (CCiTUB) nach den in Pellicer et al. [62]. Petunia hybrida Vilm. Als interner Standard wurde 'PxPc6' (2C=2.85 pg) verwendet. Keime des Standards wurden von der Plateforme de Cytométrie d'Imagerie-Gif, CNRS-I2BC (Gif-sur-Yvette, Frankreich) bereitgestellt. Kern-DNA-Gehalte (2C) wurden durch Multiplizieren des bekannten DNA-Gehalts des Standards mit dem Quotienten aus berechnet Peakpositionen (Modus) der Zielspezies und des Standards im Histogramm der Fluoreszenzintensitäten unter der Annahme einer linearen Korrelation zwischen den Fluoreszenzsignalen der gefärbten Zellkerne der unbekannten Probe, dem bekannten internen Standard und der DNA-Menge [63].

Ungefähr 20 mg von Silica-getrocknetem Blattgewebe wurden für die DNA-Extraktion unter Verwendung eines CTAB-Protokolls [64] mit geringfügigen Modifikationen verwendet. Die Qualität der Gesamt-DNA wurde mit einem NanoDrop 1000-Spektrophotometer (ThermoScientific, Wilmington, DE, USA) überprüft. Die plastidären intergenischen Regionen rpl32-trnLand psbE-petN sowie die nukleare ribosomale DNA-Region ITS wurden amplifiziert und für drei Individuen pro Population sequenziert. Sequenzen von ITS zeigten keine Variabilität innerhalb der 105 analysierten Individuen, mit Ausnahme einiger Positionen, die intragenomische Nukleotidpolymorphismen zeigten. Daher wurde diese nukleare ribosomale DNA-Region von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Andere Plastiden-DNA-Regionen (dh ndhF; ndhF-rpl32; psbA-trnH; psbD-trnT; rps16; und trnL-trnF) wurden ebenfalls getestet, aber sie wurden aufgrund geringer Variabilität oder Sequenzierungsproblemen verworfen. Das Amplifikationsverfahren wurde wie in Vitales et al. [65]. Die direkte Sequenzierung der amplifizierten DNA-Segmente wurde mit Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (PE Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) an der Unitatde Genòmica, CCiTUB, auf einem ABI PRISM 3700 DNA-Analysegerät (PE Biosystems) durchgeführt. Die rpl32-trnL- und psbE-petN-Sequenzen wurden mit BioEdit Version 7.1.3.0 [66] zusammengesetzt, mit ClustalW MultipleAlignment v1.4 [67] ausgerichtet und manuell angepasst. GenBank-Zugangsnummern sind in Tabelle S2 angegeben.

3.5. Genomgröße und genetische Analyse

Ein nicht-parametrischer Kruskal-Wallis-Test wurde durchgeführt, um nach statistisch signifikanten Unterschieden bei den 2C-Werten zwischen den Populationen zu suchen. Die Dunn-Mehrfachvergleichstests wurden ebenfalls durchgeführt, um festzustellen, welche Populationen signifikante Unterschiede zwischen ihnen aufwiesen. Die Bonferroni-Korrektur wurde angewendet, um den Typ-I-Fehler (falsch positiv) zu minimieren.

Genetische Diversitätsparameter (polymorphe Stellen, sparsame Informationsstellen, die Anzahl der Haplotypen und die gesamte Haplotyp-Diversität) wurden unter Verwendung von DnaSP v6 [68] geschätzt. Plastiden-Haplotypen wurden in einem kombinierten Datensatz bestimmt, der sowohl die rpl32-trnL- als auch die psbE-petN-Region umfasste. Indels wurden mit FastGap v.1.2 [69] kodiert und als Einzelmutationsereignisse behandelt. Die evolutionären Beziehungen zwischen Haplotypen wurden basierend auf einem Sparsamkeitsnetzwerk abgeleitet, das unter Verwendung von TCS [70] konstruiert wurde, wie es in PopArt implementiert ist [71]. Die maximale Anzahl von Unterschieden, die aus einzelnen Substitutionen zwischen Haplotypen resultieren, wurde mit 95-Prozent-Konfidenzgrenzen berechnet.

Um die Beziehung zwischen genetischen und chemischen Daten zu analysieren, wurde ein Mantel-Test durchgeführt. Zuerst schätzten wir den phänotypischen Abstand zwischen 25 Populationen anhand von Daten von Bärentraubenpflanzen, die 2016 gesammelt wurden und die auf fünf phenolische Komponenten (d. hArbutin, Catechin, Kaffeesäure, Quercetin und Myricetin). Wir haben R Commander verwendet, um diese Daten zu standardisieren [72] und anschließend den aus der standardisierten Matrix abgeleiteten chemischen Abstand mit der Funktion „Dist“ auf R basierend auf euklidischen Abständen zu berechnen. Zweitens wurde eine genetische paarweise Distanzmatrix einer Nei-Population zwischen den 25 Populationen unter Verwendung von DnaSP v6 berechnet. Schließlich haben wir die paarweisen geografischen Distanzen zwischen diesen Populationen mit dem Paket "geodist" in R berechnet. Paarweise Korrelationen zwischen Distanzmatrizen wurden mit einem Mantel-Test mit 10,000 Permutationen mit der im R-Paket "vegan" verfügbaren Funktionsmantel berechnet [ 73].

4. Schlussfolgerung

Alle analysierten Bärentraubenpflanzen zeigtenArbutinGehalte höher als 7 Prozent; daher ist dieses Pflanzenmaterial für Kräuterzubereitungen geeignet. Unsere Analyse ergab höhere Arbutingehalte als die von Parejo et al. [40], der vier Populationen in den nordöstlichen Pyrenäen auf 1580–2030 m analysierte und geringe Unterschiede im Arbutingehalt zwischen den Populationen feststellte. Außerdem liegen die meisten der hier ermittelten Werte im Bereich des für den Anbau in Polen ausgewählten Pflanzenmaterials [74] und stimmen mit dem Hoch übereinArbutinGehalt spanischer Bärentraubenblattproben, berichtet von Sonnenschein und Tegtmeier [42] bei der Auswahl von Pflanzen für den Anbau in Deutschland. Elite-Genotypen von A. uva-ursi konnten vegetativ vermehrt werden, aber die meisten der erhaltenen Klone scheiterten während der Etablierung im Feld, was die Ausbeutung dieser Ressourcen einschränkte. Wir haben auch die bestehenden Variationen im Gehalt von drei Flavonoiden (Catechin, Myricetin und Quercetinglucosid) sowie von Kaffeesäure unter spanischen Bärentraubenpopulationen beschrieben und wie klimatische Faktoren (hauptsächlich globale Strahlung und Niederschlag), die mit Breiten- und Höhengraden korrelieren Farbverläufe, beeinflussen diese Variation. Gleichzeitig war die genetische und zytogenetische Differenzierung von Populationen trotz der geringen Haplotyp- und Genomgrößenvariabilität, die bei Iberischem A. uva-ursi bestimmt wurde, schwach, aber signifikant mit der phytochemischen Diversität verbunden. Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse, dass die Wirkung sowohl genetischer als auch abiotischer Faktoren berücksichtigt werden muss, um die intraspezifische phytochemische Variabilität zu erklären, die in Pflanzen aus Wildpopulationen gefunden wird.

CISTANCHE-EFFEKTE

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