Pinocembrin verbessert die Herzinsuffizienz nach einem Infarkt durch die Aktivierung des Nrf2/HO-1-Signalwegs Teil 1

Kontaktieren Sie bitteoscar.xiao@wecistanche.comfür mehr Informationen

Abstrakt

Hintergrund:Oxidativer Stress ist ein wichtiger Faktor, der am Fortschreiten der Herzinsuffizienz beteiligt ist. Die aktuelle Studie wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob Pinocembrin in der Lage war, die Herzinsuffizienz nach einem Infarkt (PIHF) und die zugrunde liegenden Mechanismen zu verbessern.

Bitte klicken Sie hier, um mehr zu erfahren

Methoden:Ratten wurden einer Ligatur der linken vorderen absteigenden Arterie unterzogen, um einen Myokardinfarkt zu induzieren, und wurden anschließend für 6 Wochen aufgezogen, um eine chronische Herzinsuffizienz zu erzeugen. Dann wurde Pinocembrin jeden zweiten Tag für 2 Wochen verabreicht. Die Wirkungen wurden durch Echokardiographie, Western Blot, Masson-Färbung, biochemische Untersuchungen, Immunhistochemie und Fluoreszenz bewertet. In vitro kultivierten wir auch H9c2-Kardiomyozyten und kardiale Myofibroblasten, um die Mechanismen weiter zu belegen.

Ergebnisse:Wir fanden heraus, dass PIHF-induzierte Verschlechterungen der Herzfunktion durch die Verabreichung von Pinocembrin signifikant verbessert wurden. Darüber hinaus schwächte die Pinocembrin-Behandlung auch die Kollagenablagerung und erhöhte den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 in der Infarktgrenzzone zusammen mit einer abgeschwächten Apoptose, die mit einer Verbesserung des oxidativen Stresses verbunden war, der durch die Verringerung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im Herzgewebe nachgewiesen wurde und Malondialdehyd (MDA) im Serum und Anstieg der Superoxiddismutase (SOD). Dies wurde von einer Hochregulierung des nuklearen Faktors Erythroid 2-verwandter Faktor 2 (Nrf2)/Hämoxygenase-1(HO-1)-Weg begleitet. In-vitro-Experimenten fanden wir heraus, dass ein spezifischer Nrf2-Inhibitor die von Pinocembrin resultierenden Wirkungen, einschließlich Antioxidans, Anti-Apoptose, Anti-Fibrose und Neovaskularisation, signifikant umkehrte, was weiter darauf hinwies, dass die Verbesserung von PIHF durch Pinocembrin in einem Nrf2/HO lag-1 wegabhängige Weise.

Cistanche kann die Immunität verbessern

Fazit:Pinocembrin verbesserte die aus PIHF resultierenden Herzfunktionen und Umbaumaßnahmen durch ROS-Abfang und Aktivierung des Nrf2/HO-1-Signalwegs, was die Ablagerung und Apoptose von Kollagenfasern weiter abschwächte und die Angiogenese erleichterte.

Schlüsselwörter:Pinocembrin, Herzinsuffizienz, oxidativer Stress, Nrf2/HO-1

Einführung

Herzinsuffizienz (HF), gekennzeichnet durch eine Reihe von klinischen Syndromen im Endstadium, die aus strukturellen und/oder funktionellen Beeinträchtigungen des Herzens resultieren, bleibt eine globale Gesundheitsbelastung mit Myokardinfarkt (MI) als Hauptursache (Ziaeian und Fonarow 2016; Galli and Lombardi 2016; Rengo et al. 2013). Trotz der großen Fortschritte, die bei den Therapien und der Versorgungsqualität bei Herzinsuffizienz erzielt wurden, gibt es eine geschätzte Prävalenz von 37,7 Millionen Menschen jedes Jahr auf der ganzen Welt, zusammen mit einer Sterblichkeit von 50 Prozent fünf Jahre nach der Diagnose von Herzinsuffizienz (Go et al .2014). Das gegenwärtige Dilemma könnte teilweise darauf zurückgeführt werden, dass die Postinfarkt-HF (PIHF) aus einer Vielzahl von pathophysiologischen Mechanismen besteht, auf die sich gegenwärtige therapeutische Verfahren nicht vollständig beziehen können.

Anhäufende Studien haben gezeigt, dass oxidativer Stress (OS) überwiegend am pathologischen Verlauf von PIHF beteiligt ist (Dubois-Deruy et al.2020; Ma et al. 2019; Bubb et al.2017; Habtemariam 2019).OS, hauptsächlich präsentiert von an Es wurde nachgewiesen, dass eine übermäßige Ansammlung von freien Radikalen/reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die Hydroxylradikale, Superoxid, Stickstoffmonoxid usw. enthalten (Dubois-Deruy et al. 2020; Habtemariam 2019), eine oxidative Modifikation oder Schädigung von Lipiden hervorrufen kann , Proteine ​​und DNA, mit Organellenstörungen, Entzündungen, Apoptose in Myozyten und interstitieller Fibrose (Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; Hermida et al. 2018). Aufgrund der vielfältigen nachteiligen Wirkungen von ROS wurden Antioxidantien in den PIHF-Therapien in Betracht gezogen, deren Mechanismen aus direkter ROS-Abfangung und/oder Stimulierung der antioxidativen Abwehr bestehen, die Glutathion, Superoxiddismutase (SOD), Katalase usw. enthalten. Habtemar-iam 2019). Bedauerlich war jedoch, dass die Anwendung einiger Antioxidantien, weder Vitamin E (Lee et al. 2005) noch Resveratrol (Made et al. 2015; Olesen et al. 2014), in der Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen nicht auf die Zufriedenheit stießen, nachgewiesen durch ein Versagen bei der Verbesserung der Herzfunktionen. Daher werden in der PIHF-Therapie wirksamere Antioxidantien benötigt.

Pinocembrin (Pino) ​​(die chemische Struktur ist in Abb. 1A dargestellt) ist eine natürliche Flavonoidverbindung, die zusätzlich aus Honig, Propolis und mehreren anderen Pflanzen extrahiert werden konnte (Lan et al.2015; Rasul et al.2013). künstliche Synthese (Costa und Leitao 2011), die entzündungshemmende, antibakterielle, Anti- und Antikrebswirkungen ausübt (Rasul et al.2013; Ye et al.2019), zusammen mit der betonten antioxidativen Wirkung (Kim et al.2020; Sangweni et al .2020). Wie zuvor gezeigt, sind die phenolische Struktur von Pino, die für die direkte ROS-Eliminierung verantwortlich ist, sowie phenolische und nicht-phenolische Strukturen, die die antioxidative Abwehr verstärken (Habtemariam 2019), für die antioxidative Wirkung von Pino verantwortlich, wodurch Pino in einem breiten Spektrum untersucht und angewendet wurde Vielzahl von Krankheiten, wie neurodegenerative Erkrankungen, Arteriosklerose, Doxorubicin-induzierte Kardiomyozytentoxizität (Sangweni et al. 2020; Sang et al.2012; Liu et al.2014). Angesichts der Tatsache, dass mehrere Antioxidantien für Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz ungültig oder nicht ausreichend sind, um in die klinische Anwendung überführt zu werden, bleibt jedoch unklar, ob die antioxidative Wirkung von Pino in der Therapie von PIHF erfüllt werden könnte. Diese Forschung wurde daher durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Verabreichung von Pino heilsame Wirkungen auf PIHE ausüben könnte, was verspricht, eine neue oder, wenn nicht dominante, aber zumindest unterstützende Behandlung zu sein.

Methoden und Materialien

Tiermodell und Versuchsprotokoll

56 männliche Sprague-Dawley-Ratten, gekauft vom Tierversuchszentrum der China Three Gorges University,

wurden in der Tierverwaltung des Krankenhauses Nr. 3 von Wuhan aufgezogen. Alle Experimente wurden offiziell genehmigt und im Hubei Key Laboratory of Cardiology durchgeführt, in Übereinstimmung mit dem Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, herausgegeben von den US National Institutes of Health (NIH Publication No.82-23, überarbeitet 1996).

Die Ratten erhielten zunächst eine Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD) oder eine Scheinoperation. Kurz gesagt, Ratten wurden mit 3 % Pentobarbital (2 ml/kg; Sigma-Aldridge, St. Louis, USA, intraperitoneal) anästhesiert, gefolgt von trachealer Intubation und Atemunterstützung (Tidalvolumen: 5-10 ml, Rate: 70 Mal/Minute). Anschließend wurde eine Herzexposition durchgeführt und die LAD wurde durch 7-0 Monofilament-Nylonnähte ligiert. Das Auftreten der Blässe der Apexcordis oder der ST-Strecken-Hebung auf der I-Ableitung des Elektrokardiogramms zeigte die Induktion eines MI an. Die Scheinoperation wurde mit Ausnahme der LAD-Ligation identischen Verfahren unterzogen. Penicillin (200,000 IE) wurde eine Woche nach der Operation einmal täglich intramuskulär injiziert.

Afterward, the rats were carefully raised for 6 weeks to produce PIHF. Rats were then randomly split into 4 groups:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 mg/kg, purity>98 Prozent ; Sigma-Aldridge) oder das gleiche Volumen Kochsalzlösung wurde 2 Wochen lang jeden zweiten Tag intravenös durch die Schwanzvene injiziert. Die Dosierung bezog sich auf eine frühere Studie (Lan et al.2017). Das Protokoll wurde in Abb. 1B dargestellt.

Die positiven Kontrollratten der Kontrolle enthielten 3 Gruppen: Schein plus Kochsalzlösung (Scheingruppe); LAD-Ligation plus Kochsalzlösung (HF-Gruppe); LAD-Ligation plus Enalapril (HF plus ACEI-Gruppe). Die Ratten wurden den entsprechenden Operationen unterzogen, außer dass die Ratten der HF plus ACEI-Gruppe oral mit 20 mg/kg Enalapril gefüttert wurden.

Echokardiographische Messungen

Die Herzfunktionen wurden durch transthorakale Echokardiographie unter Verwendung eines Ultraschallbildgebungssystems (Vevo 2100, Visual Sonics Inc., Toronto, Kanada) bewertet, wie zuvor in unserer Gruppe berichtet (Fo et al.2020). Die linksventrikuläre Innendimension im enddiastolischen Stadium (LVIDd) und im endsystolischen Stadium (LVIDs), das linksventrikuläre endsystolische und enddiastolische Volumen (LVESV und LVEDV) wurden durch zweidimensionale M-Modus-Echokardiogramme für mindestens 3 aufgezeichnet aufeinanderfolgende Zyklen für jede Ratte. Anschließend wurden die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) und die fraktionale Verkürzung (FS), die die systolische Funktion widerspiegelten, berechnet.

Probenvorbereitung

Nach Verabreichung von Pino und Echokardiographietests wurden die Ratten erneut anästhesiert. Mehr als 2 ml venöses Blut wurden aus der Schwanzvene in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthaltende Vakuum-Blutentnahmeröhrchen mit nachfolgender Zentrifugation bei einer Geschwindigkeit von 3000 U/min für 15 Minuten und bei einer Temperatur von 4 Grad C aufgefangen, gefolgt von Isolierung Serumüberstand und Konservierung bei -80 "C. Dann wurden die Herzen schnell entnommen. Ein Teil der Infarktgrenzzone jedes Herzens wurde abgeschnitten und in flüssigem Stickstoff für die Western-Blot-Analyse eingefroren, wobei das andere Herzgewebe in 4 fixiert wurde Prozent Paraformaldehyd für mehr als 24 h.

Masson-Färbung

Wir führten eine Masson-Färbung durch, um die Kollagenablagerung in der Grenzzone des Infarkts nachzuweisen. Paraformaldehyd-fixierte Ventrikel wurden in Paraffin eingebettet und dann in 5--μm-Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden anschließend mit Masson-Trichrom gefärbt, wobei das Kollagen blau, das Myokard rosa und der Kern schwarz gefärbt war. Der Kollagenablagerungsanteil wurde mit der Image J-Software (NIH, Bethesda, MD) bei 200-facher Vergrößerung berechnet.

Immunhistochemische Analyse

Eine immunhistochemische Analyse wurde durchgeführt, um die Dichte des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2 (VEGFR2) zu bewerten, dessen Hochregulierung die Angiogenese förderte, was heilsam und wichtig für die Abschwächung des Umbaus war (Rengo et al. 2013). Die ventrikulären Schnitte wurden wie diejenigen hergestellt, die bei der Masson-Färbung durchgeführt wurden, gefolgt von einer Entparaffinierung und Rehydratisierung. Dann erhielten die Schnitte eine hitzevermittelte Antigengewinnung und wurden mit 3 Prozent H, O behandelt, um endogene Peroxidase zu blockieren, wobei eine Inkubation von 1 ug/ml VEGFR2-Antikörper (Abcam, ab9530) für 12 h bei 4 Grad durchgeführt wurde. Danach wurden die Schnitte mit Meerrettichperoxidase (HRP)-markiertem Sekundärantikörper (1:200, Service, G1213) für 50 Minuten bei 37 Grad inkubiert. Zusätzlich wurde 3,3'-Diaminobenzidin verwendet, um eine positive Färbung zu entwickeln, die war gelbbraun dargestellt. Schließlich wurde die durchschnittliche optische Dichte von VEGFR2 analysiert und mit der Software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA) berechnet.

Terminal-Desoxynukleotidyl-Transferase-vermittelter Nick-End-Labeling (TUNEL)-Assay

Apoptose wurde anschließend durch den TUNEL-Assay nachgewiesen. Zuvor hergestellte Paraffinmassen, die Ventrikelgewebe einbetten, wurden für den TUNEL-Assay in andere Scheiben geschnitten, gefolgt von einer TUNEL-Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers des kommerziellen Assay-Kits (Roche, Schweiz; 11684817910). Kurz gesagt wurden die ventrikulären Schnitte TUNEL-Reagenz ausgesetzt, wobei TdT und dUTP mit einem Verhältnis von 1:9 gemischt wurden, für 1 h bei Raumtemperatur, nach Inkubation von Proteinase K und Aufbrechen der Zellmembran. Schließlich wurden die Fluoreszenzbilder bei einer Wellenlänge von 530 nm beobachtet, die durch eine Emissionswellenlänge von 450 nm (400-fache Vergrößerung) getriggert wurde. Die Apoptoserate von ventrikulären Geweben in jeder Gruppe wurde von Image Software analysiert und berechnet.

westlicher Fleck

Wir implementieren Western Blot, um die zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären, durch die Pino PIHF verbesserte. Die Verfahren der Proteinprobenextraktion und -vorbereitung ähnelten denen, über die zuvor in unserer Studie berichtet wurde (Chen et al.2020a). Die Membranen wurden mit Antikörpern gegen den Kernfaktor Erythroid 2-verwandter Faktor 2 (Nrf2), Hämoxygenase {{ 4}}(HO-1;1:2000, Abcam, ab189491),p53(1:1000,cell signaling technology,2524S), BCL-2 (1:1000, cell signaling technology,2870P) ,bax (1:1000, Abcam, ab32503), gespaltene Caspase-3(1:1000, cell signaling technology, 9664 T), Collagen I(1:1000, Affinity, AF7001), Glycerinaldehyd-3- Phosphatdehydrogenase (GAPDH, Service, GB12002), mit anschließender Visualisierung durch HRP-markierte sekundäre Antikörper (Service, G1213 und G1214) und Chemilumineszenz-Nachweisreagenzien. Die Blot-Bilder wurden schließlich mit der Image J-Software analysiert und quantifiziert.

H9c2-Kardiomyozytenkultur und -entsorgung in vitro Die aus Rattenherzen stammenden H9c2-Kardiomyozyten, die von der American Type Culture Collection (CRL-1446) bezogen wurden, wurden kultiviert, um die von Pino ausgeübten Wirkungen in vitro weiter zu verifizieren. H9c2-Kardiomyozyten wurden in e Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F12-Medium, das 10 Prozent fötales Rinderserum enthielt (Sijiqing, Hangzhou, China), bei einer Temperatur von 37 Grad und einer Atmosphäre aus 95 Prozent Luft und 5 Prozent CO kultiviert. Die Zellen wurden auf 6-Well-Platten ausgesät, nachdem sie auf 90 Prozent gewachsen waren, zusätzlich wurde ein Serummedium, das 25 uM Isoprenalin (ISO) enthielt, anschließend durch normales Medium in 3 Wells ersetzt, um die Zellen 48 Stunden lang zu inkubieren, um den HF-Zustand seitdem nachzuahmen Herzinsuffizienz ist auch durch eine Überaktivierung des sympathischen Tonus gekennzeichnet und die Stimulation des -adrenergen Rezeptors erzeugt ROS (Velusamy et al.2020). Dann wurden die Zellen in 6 Gruppen aufgeteilt: (i) Kontrollgruppe; (ii) Kontrollmedium mit 25 μM Pino für 4 h (Kontrolle plus Pino-Gruppe); (i) Kontrollmedium co-inkubiert mit 25 μM Pino und 5 μM ML385 für 4 h (Nrf2-Inhibitor; MCE, New Jersey, USA) (Kontrolle plus Pino plus ML385-Gruppe); (iv) ISO-Gruppe; v. ISO-Medium mit 4- h Inkubation mit 25 μM Pino (ISO plus Pino-Gruppe); vi. ISO plus 25 μM Pino plus 5 μM ML385-Gruppe. Die Konzentration und Inkubationszeit von Medikamenten beziehen sich auf frühere Studien oder die Anweisungen (Jin et al.2015; Oliveira et al.2017).

Herz-Myofibroblasten-Kultur und Proliferationsassay von neugeborenen Ratten

Kardiale Myofibroblasten (CMFs) von neugeborenen Ratten wurden kultiviert, um die Wirkungen von Pino auf die Kollagensekretion zu untersuchen. Die CMFs wurden unter Verwendung von neugeborenen Ratten im Alter von 3 Tagen unter Bezugnahme auf zuvor demonstrierte Methoden (Cui et al. 2021) getrennt. Die isolierten und zerkleinerten Herzen wurden mit 0,125 % Trypsin verdaut, gefolgt von einem Cocktail, der 0,25 % Trypsin und 0,08 % Collagenase enthielt, mehrere Male, mit anschließender Zentrifugation und Transplantation in eine Petrischale, um sie zu sammeln Zellen aus dem Überstand. Dann wurde das Medium durch ein Serummedium ähnlich dem ersetzt, das für die H9c2-Kardiomyozytenkultur nach 90-minütiger Adhäsion verwendet wurde. Die CMFs erhielten identische Entsorgungen wie diejenigen auf H9c2-Kardiomyozyten. Wir haben auch einen Zellzählungskit-8(CCK-8)-Assay (Dojindo, Japan) implementiert, um die Proliferation von CMFs nachzuweisen, wenn in jedem Well eine Dichte von 1,5 × 10 Grad erreicht wird, indem ein Mikroplatten-Lesegerät bei ausgenutzt wird eine Wellenlänge von 450 nm, wobei ein höherer Wert eine gesteigerte Proliferationsaktivität anzeigte.

ROS-Erkennung

Die Fähigkeit von Pino, ROS zu fangen, wurde durch die fluoreszierende Sonde Dihydroethidium (DHE; Beyotime, Shanghai, China) gemessen. DHL, das in DMSO gelöst war, wurde für Gefrierschnitte auf 5 &mgr;M verdünnt oder gemäß den Anweisungen dem auf die gleiche Konzentration zu verdünnenden Serummedium zugesetzt. Die mit Paraformaldehyd fixierten Herzen wurden eingefroren und anschließend in 4- μm-Schnitte geschnitten. Die Schnitte oder H9c2-Kardiomyozyten wurden mit DHE-Lösung für 30 Minuten bei einer Temperatur von 37 Grad co-inkubiert und anschließend durch ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop (IX70; Olympus, Tokio, Japan) abgebildet. Kurz gesagt, der Kern, der mit DNA und RNA gefüllt war, war aufgrund einer Affinität zwischen Nukleinsäure und DHE deutlich rot gefärbt. Darüber hinaus zeigte eine stärkere Fluoreszenzintensität eine stärkere Akkumulation von ROS an.

Biochemische Untersuchungen

Es wurden biochemische Untersuchungen durchgeführt, um die Veränderungen von Serum-BNP, SOD und Malondialdehyd (MDA) im Serum und im Zellüberstand zu untersuchen, die auf den HF-Phänotyp bzw. die Oxidationsmittelabwehr hindeuteten. Die Konzentration wurde unter Verwendung entsprechender biochemischer Assay-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Jiancheng, Nanjing, China) gemessen.

Dieser Artikel ist aus Chen et al. Mol Med (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7