Abrus Precatorius-Blattextrakt kehrt Alloxan/Nicotinamid-induzierten Diabetes mellitus bei Ratten durch hormonelle (Insulin, GLP-1 und Glucagon) und enzymatische (-Amylase/-Glucosidase) Modulation um Teil 1

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Hintergrund

Abrus precatorius wird in der Volksmedizin in allen afroasiatischen Regionen der Welt verwendet. Früher wurden blutzuckersenkende und pankreasschützende Wirkungen von Abrus precatorius-Blattextrakt (APLE) experimentell bei STZ/Nicotinamid-induzierten diabetischen Ratten bestätigt; der zugrunde liegende Mechanismus der antidiabetischen Wirkung und des Schutzes der Bauchspeicheldrüse blieb jedoch unbekannt. Zielsetzung. Diese Studie beleuchtete antidiabetische Mechanismen und pankreasprotektive Wirkungen von APLE bei diabetischen Ratten. Materialen und Methoden. APLE wurde durch das Ethanol/Soxhlet-Extraktionsverfahren hergestellt. Gesamtphenole und Flavonoide wurden nach dem anfänglichen phytochemischen Screening kalorimetrisch quantifiziert. Diabetes mellitus (DM) wurde bei erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten (mit einem Gewicht von 120-180 g) beiderlei Geschlechts durch tägliche aufeinanderfolgende Injektion von Nicotinamid (48 mg/kg; ip) festgestelltAlloxan(120 mg/kg; ip) über einen Zeitraum von 7 Tagen. Mit Ausnahme der Kontrollratten, die einen Nüchtern-Blutzucker (FBG) von 4,60 mmol/l aufwiesen, zeigten Ratten einen stabilen FBG (16-21 mmol/l) 7 TagePost-Nicotinamid/AlloxanInjektion wurden als diabetisch eingestuft und wurden zufällig einer der folgenden Gruppen (Modell, APLE (100, 200 bzw. 400 mg/kg; PO) und Metformin (300 mg/kg; PO)) zugeordnet und 18 Tage lang täglich behandelt . Körpergewicht und FBG wurden 18 Tage lang alle 72 Stunden gemessen. Am 18. Tag haben Ratten tief geopfertAnästhesie; Organe (Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse und Milz) wurden isoliert und gewogen. Blut wurde zur Bestimmung von Seruminsulin, Glukagon und (LP-1) unter Verwendung eines rattenspezifischen ELSA-Kits gesammelt. Die Bauchspeicheldrüse wurde verarbeitet, geschnitten und für die histologische Untersuchung H&E-gefärbtenzymatischAktivität von Alpha(a)-Amylase und -Glucosidase wurde bestimmt. Die antioxidativen und Radikalfänger-Eigenschaften von APLE wurden unter Verwendung von Standardmethoden bewertet. Ergebnisse. APLE verringerte das anfängliche FBG dosisabhängig um 68,67 Prozent, 31,07 Prozent und 4,39 Prozent im Vergleich zum Modell (4,34 Prozent) und Metformin (43,63 Prozent). Die Behandlung mit APLE (100 mg/kg) stellte den Gewichtsverlust relativ zum Modell wieder her. APLE erhöhte das Seruminsulin und GLP-1, senkte aber das Serumglucagon relativ zum Modell. APLE erhöhte sowohl die Anzahl als auch die mittlere Querschnittsfläche (x 10 Grad um') der Pankreasinseln im Vergleich zu denen des Modells. APLE erzeugte eine konzentrationsabhängige Hemmung von -Amylase und -Glucosidase relativ zu Acarbose. APLE entfernte konzentrationsabhängig DPPH- und Stickoxid (NO)-Radikale und zeigte im Vergleich zu Standards eine erhöhte eisen(III)-reduzierende Antioxidanskapazität (FRAC). Fazit. Die antidiabetische Wirkung von APLE wird vermittelt durch Modulation von Insulin und GLP-1 invers mit Glucagon, nicht-kompetitive Hemmung von c-Amylase und -Glucosidase, Abfangen freier Radikale und Wiederherstellung von geschädigten/nekro-apoptotischen Pankreaszellen.

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1. Einleitung

Diabetes mellitus (DM) ist eines der metabolischen Syndrome, das durch chronische Hyperglykämie gekennzeichnet ist, die durch einen dysregulierten Glukosestoffwechsel als Folge von Defekten in der Pankreaszellfunktion kulminiert [1]. Pathologisch ist DM ein Produkt von Fehlern im Glukosestoffwechsel aufgrund von Defekten in der Pankreaszellfunktion, die entweder Insulininsuffizienz (Typ 1 DM) oder Insulinresistenz (Typ 2 DM) verursachen. Häufige Symptome von DM sind Polyphagie, Polydipsie, verschwommenes Sehen, chronischer Gewichtsverlust, Gastroparese und Polyurie [2]. Im Laufe der Zeit erhöht eine ungelöste Hyperglykämie das Risiko mikrovaskulärer Komplikationen von DM wie diabetischer Nephropathie, diabetischer Retinopathie und diabetischer Neuropathie [2]. Diese Komplikationen treten aufgrund von starkem oxidativem Stress und Lipid aufPeroxidationdie die Nebenprodukte von Reaktionen zwischen Glukose und biologischen Molekülen sind [3]. Umfangreiche Glykosylierung biologischer Moleküle wie DNA, Proteine ​​und Lipide führt zur Bildung instabiler biochemischer Zwischenprodukte, die als Quellen für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Stickstoffspezies (RNS) dienen. ROS und RNS sind Schlüsseltreiber von oxidativen und peroxidativen Reaktionen in verschiedenen Zellen und Geweben [3].

Epidemiologisch wird berichtet, dass DM weltweit über 387 Millionen Menschen betrifft [4]. Diese vorläufige Schätzung wird voraussichtlich bis zum Jahr 2035 auf 592 Millionen steigen [5]. Ursprünglich wurde angenommen, dass DM im Erwachsenenalter auftritt, aber jetzt wird gezeigt, dass DM unabhängig vom Alter ist, was deutlich die enorme Bedrohung zeigt von DM an die globale Gesundheit.

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Herkömmlicherweise beinhaltet die Behandlung von DM (Typ 1 und 2) die Verwendung von Antidiabetika, die als Nicht-Insulin (einschließlich der Biguanide (z. B. Metformin), Sulfonylharnstoffe (z. B. Glyburid), SGLT-2-Inhibitoren (z. B. Dapagliflozin), Gallensäurekomplexbildner (z. B. Colesevelam), Amylin-Mimetikum (z. B. Pramlintid), Dopamin-2-Agonist (z. B. Bromocriptin), DPP-4-Inhibitoren (z. B. Sitagliptin), GLP{{5 }}RAs (z. B. Exenatid), Thiazolidindion (z. B. Rosiglitazon) und -Glucosidase-Inhibitoren (z. B. Acarbose und Voglibose)) und Insulin (z. B. Humaninsulin und Analoga) Therapien [6]. Die konventionellen antidiabetischen Therapien haben sich als wirksam erwiesen, obwohl die Anwendung einiger von ihnen kostspielig ist und mit schwerwiegenden Nebenwirkungen verbunden sein kann[7]. Kosten, Nebenwirkungen und die allgemeine Überzeugung, dass herkömmliche Medikamente synthetisch und im Vergleich zu pflanzlichen Arzneimitteln, die als "natürlich" und relativ sicher gelten, unsicher sind, haben zum erneuten Interesse an der Verwendung von Kräutern und Kräutern beigetragen Produkte für die Behandlung und das Management menschlicher Krankheiten, einschließlich DM[8,9]. Dieses Paradigma ist in ärmeren tropischen Ländern der Welt weit verbreitet, wo sich die meisten Menschen auf Kräutermedizin verlassen, um ihre primäre Gesundheitsversorgung zu decken [8]. Auch könnte dies wahrscheinlich die übliche Behauptung bestätigen, dass die Verwendung von Kräutern älter als die moderne Medizin ist und dass Naturprodukte weiterhin als Vorlagen für die pharmazeutische Synthese neuer Medikamente[10], einschließlich Antidiabetika, dienen. Wichtig ist, dass diese Kräuter und von Kräutern abgeleitete Therapien als ergänzende Therapie in einer Weise eingesetzt werden, die die Glaubenssysteme und das ethnobotanische Erbe der meisten lokalen Gemeinschaften in den afroasiatischen Regionen der Welt widerspiegelt. Zum Beispiel haben viele Heilpflanzen mit ethnobotanischem Anspruch zur Behandlung von Diabetes mellitus wie Chrysobalanus orbicularis[11], Spondias mombin und Mangifera indica[12], Sesamum indicum [13] und Bryophyllum pinnatum [14] alle -Amylase und nachgewiesen -Glucosidase-hemmende Wirkungen, die als lebenswichtig für die glykämische Kontrolle angesehen werden. Als Reaktion auf dieses erneute Interesse an der Verwendung von Kräutern und aus Kräutern gewonnenen Produkten als ergänzende oder alternative Therapie hat die Weltgesundheitsorganisation (WHO) zusammen mit anderen Interessengruppen die Einbeziehung einheimischer Heilsysteme, insbesondere der Kräutermedizin, empfohlen Gesundheitssysteme ärmerer Länder [15]. Diese Empfehlung hat die Notwendigkeit erforderlich gemacht, gesundheitsbezogene Angaben zu Heilkräutern zu überprüfen, die üblicherweise von der lokalen Bevölkerung zur Behandlung menschlicher Krankheiten verwendet werden[16,17]. Interessanterweise ist Abrus pre-catorius, gemeinhin als „Jequirity-Erbse“ bezeichnet, ein Heilkraut, das in der Volksmedizin vieler Kulturen in afroasiatischen Regionen der Welt ausgiebig zur Behandlung menschlicher Krankheiten verwendet wird[18-20]. Mehrere Berichte haben die traditionelle Verwendung von Abrus precatorius-Blättern bei der Behandlung und Behandlung von Diabetes mellitus hervorgehoben[21-23]. Bemerkenswert ist, dass Extrakte aus Blättern von Abrus precatorius eine Wirksamkeit gegen Diabetes mellitus [1] und Brustkrebs [24] gezeigt haben, zwei menschliche Krankheiten, die erheblich zur globalen Krankheitslast beigetragen haben [25]. Viele Studien haben die ethnopharmakologische Verwendung und andere medizinische Behauptungen von Abrus precatorius gerechtfertigt, indem sie experimentell seine biologischen Eigenschaften nachgewiesen haben, einschließlich Radikalfänger [26], Reno-Schutz [27], Neuro-Schutz [28], immunmodulatorisch[19], entzündungshemmend [29], Antilipotoxizität [30] und Thrombozytenaggregationshemmung [31], um nur einige Beispiele zu nennen.

Zuvor wurden glukosesenkende und pankreasprotektive Wirkungen von APLE experimentell an STZ/Nicotinamid-induzierten diabetischen Ratten nachgewiesen, um seine Verwendung als antidiabetische Volksmedizin durch die lokale Bevölkerung in der westlichen Region von Ghana zu bestätigen [1]. Der Mechanismus, der den blutzuckersenkenden und pankreasprotektiven Wirkungen von APLE zugrunde liegt, blieb jedoch nur unzureichend aufgeklärt. Derzeit Mechanismen, die den glukosesenkenden und pankreasschützenden Wirkungen von APLE zugrunde liegen, wie Modulation von Insulin, Glukagon und GLP-1, Hemmung der enzymatischen Aktivität von -Amylase und -Glucosidase, Abfangen freier Radikale und Wiederherstellung von Pankreaszellschädigung und Nekro-Apoptose wurden in vivo und in vitro nachgewiesen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Drogen und Chemikalien. Alloxan-Monohydrat (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, USA), Nicotinamid (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, USA), Acarbose (LGM Pharma, USA), Metformin (Bristol Laboratorys Ltd.) , Gallussäure (Merck KGaA, USA), Rutin (Acros Organics, USA), Ascorbinsäure (Carl Roth, Deutschland), Quercetin (Alfa Aesar, UK), p-Nitrophenylglucopyranosid (pNPG) (BBI Biotech, China), Rat In der Studie wurden ein Insulin-ELISA-Kit, ein Ratten-Glukagon-ELISA-Kit und ein Ratten-GLP-1-ELSA-Kit (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co. Ltd., China) verwendet. Alle anderen in der Studie verwendeten Lösungsmittel und Chemikalien waren analysenrein.

2.2. Sammlung, Identifizierung und Authentifizierung von Abrus precatorius-Blättern. Frische Blätter von A. precatorius wurden von unbewirtschaftetem Ackerland bei Sefwi Asawinso'A' (Bezirk Bibiani-Ahwiaso-Bekwai, Western Region, Ghana) gesammelt. Die Blätter wurden von einem qualifizierten Botaniker der Herbariumseinheit der School of Biological Sciences der University of Cape Coast identifiziert und authentifiziert, wo ein Belegexemplar (CC3366) hinterlegt wurde, wie bereits berichtet [1].

2.3. Herstellung von Abrus precatorius-Blattextrakt (APLE). APLE wurde nach einem früheren Verfahren hergestellt [1]. Kurz gesagt, im Schatten getrocknete Blätter von A. precatorius wurden mechanisch zu feinem Pulver gemahlen. Die pulverisierten Blätter wurden vor der Verwendung in luftdichten Plastikbehältern gelagert. Eine Menge von 120 g der pulverisierten Blätter wurde in 700 ml Ethanol für 48 Stunden eingeweicht und mit Käsetuch bedeckt. Die Mischung wurde mindestens dreimal täglich gerührt. Am zweiten Tag wurde die Mischung durch ein Filterpapier filtriert, das in einen Büchner-Trichter eingesetzt war. Das Filtrat wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers, der auf einem Wasserbad montiert war, einer Trennung unterzogen. Nach Gewinnung von Ethanol unter Verwendung des Rotationsverdampfers wurde die resultierende dunkelgrüne sirupartige Flüssigkeit mehrere Wochen in einem Exsikkator getrocknet, wobei ein dunkelgrüner fester Extrakt zurückblieb. Der Extrakt wurde markiert und vor der Verwendung in einem Exsikkator gelagert. APLE wurde kontinuierlich angesetzt, um genügend Mengen für alle Experimente zu erhalten.

2.4. Phytochemisches Screening von APLE. APLE wurde wie zuvor berichtet [1] auf das Vorhandensein von Phytoverbindungen gescreent. 2.5.Bestimmung des Gesamtphenolgehalts (TPC) in APLE. Der Gesamtphenolgehalt in APLE wurde unter Verwendung des Folin-Ciocalteu-Reagenzverfahrens wie zuvor beschrieben [32] mit geringfügigen Modifikationen bestimmt. Eine verdünnte Konzentration von APLE (250 μl von 1 mg/ml) wurde mit 750 μl Folin Ciocalteu-Reagenz (1 in 10 Verdünnungen mit Wasser) und 750 μl 7-prozentigem Na, CO gemischt. Die Mischungen wurden dann mit destilliertem Wasser auf 5 ml aufgefüllt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden zur Farbentwicklung. Die Absorption wurde dann bei 765 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (UV-vis, T70 PG Instruments) gemessen. Nach Erstellung einer Standard-Gallussäurekurve (0-300 ug/ml) wurde TPC in APLE aus der Gallussäure-Eichkurve extrapoliert und in Gallussäureäquivalent (GAE) ausgedrückt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

2.6. Bestimmung des Gesamtflavonoidgehalts (TFC) in APLE. Der Gesamtflavonoidgehalt in APLE wurde nach einer zuvor beschriebenen Methode [33] mit einigen Modifikationen gemessen. Kurz gesagt, 500 μl Abrus precatorius-Pflanzenextrakt (1 mg/ml), hergestellt in 50-prozentigem Ethanol, wurden mit 500 μl 10-prozentigem Aluminiumchlorid (AlCl, 0,6 H, O) und 1500 μl 10-prozentigem Natriumacetat (NAC, H, O) gemischt ,.3H,O). Das Reaktionsgemisch wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Extinktion wurde bei 415 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (UV-vis, T70 PG Instruments) gemessen. Nach Erstellung der Standard-Rutin-Kalibrierkurve (0-250 ug/ml) wurde TFC in APLE aus der Rutin-Kalibrierkurve extrapoliert und in Rutin-Äquivalent (RE) ausgedrückt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

2.7. Ethische Genehmigung. Alle Protokolle mit Tieren wurden ursprünglich vom Institutional Review Board on Animal Experimentation (FPPS/PCOL/006/2019) der Kwame Nkrumah University of Science and Technology (KNUST) überprüft und genehmigt. Außerdem wurden Experimente mit Ratten gemäß den Richtlinien der Europäischen Union (2010/63/EU) über die Verwendung und Pflege von Tieren in wissenschaftlichen Versuchen durchgeführt. Das Leiden der Tiere und die Anzahl der Tiere wurden so weit wie möglich reduziert, um die Anforderungen der 3R-Empfehlungen (Refinement, Replacement, and Reduction) zu erfüllen [34].

2.8. Erwerb und Pflege von Versuchstieren. Gesunde 7-8- Wochen alte erwachsene Sprague-Dawley-Ratten beiderlei Geschlechts (mit einem Gewicht zwischen 120 und 180 g) wurden vom Noguchi Medical Research Institute (NMRI) der Universität von Ghana gekauft. Die Ratten wurden später in das Tierhaus der Abteilung für biomedizinische Wissenschaften der Universität von Cape Coast, Cape Coast, Ghana, transportiert. Die Ratten wurden in rostfreien Käfigen (34 cm × 47 cm × 18 cm) mit trockenen Holzspänen als Einstreu gehalten, mit normalem Nagetierfutter (GAFCO, TEMA) gefüttert und hatten uneingeschränkten Zugang zu Wasser. Die Ratten wurden unter Umgebungsbedingungen von Temperatur, Feuchtigkeit und normalem Dunkel/Hell-Zyklus gehalten. Diese Bedingungen wurden jedoch variiert, um den spezifischen Anforderungen einiger Experimente zu entsprechen. Man ließ die Ratten sich unter diesen Umgebungs- und Laborbedingungen über zwei Wochen lang gewöhnen, bevor sie in Experimenten verwendet wurden.

2.9. Nachweis von Alloxan/Nicotinamid-induziertem Diabetes mellitus bei Ratten. Experimenteller Diabetes mellitus wurde bei über Nacht nüchternen normoglykämischen erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten nach einer zuvor beschriebenen Methode [1, 35] mit einigen Modifikationen festgestellt. Kurz gesagt wurde Ratten nacheinander Nikotinamid (48 mg/kg; IP), gelöst in normaler Salzlösung, injiziert und auf Eis gehalten; dann, 15 Minuten später, wurde Alloxan (120 mg/kg; ip) in 100 mM Citratpufferlösung (pH 4,5) rekonstituiert und Ratten täglich für 7 Tage verabreicht. Anschließend wurde den Ratten 7 Tage lang täglich eine 5-prozentige Glucoselösung (5 ml/kg; PO) verabreicht. Um das Auftreten einer Hyperglykämie bei Ratten zu bestätigen, wurde Blut von über Nacht nüchtern gehaltenen Ratten 3-7 Tage nach Alloxan/Nicotinamid entnommen und 5-prozentige Glukosebehandlungen unter Verwendung der Schwanzspitzenamputationsmethode. Die Schwänze der Ratten wurden zuerst mit steriler Watte saubergewischt, die in 10 Prozent Ethanol getaucht war. Nüchtern-Blutzucker (FBG) wurde unter Verwendung von URIT G26 Glukometer (URIT Medical Electronic Co., Ltd.) gemessen.

2.10.Experimental Design. A curative rather than prophylactic treatment approach was adopted in this study, where after the establishment of experimental diabetes mellitus in rats, diabetic rats were subjected to various treatments. Figure 1 shows an outline of experiments carried out in this study. Rats having consistent FBG(11.1 mmol/L or >250 mg/dL) nach mehreren Messungen wurden als an Diabetes mellitus (Hyperglykämie) erkrankt[1,35]. Ratten mit bestätigtem Diabetes wurden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen eingeteilt. Kontrollratten wurden Alloxan nicht ausgesetzt; stattdessen erhielten sie normale Kochsalzlösung. Alle Gruppen wurden für einen Zeitraum von 18 Tagen wie unten gezeigt behandelt:

Kontrolle: normale Kochsalzlösung (5 ml/Ratte/Tag; po) plus Nagetierfutter plus Wasser

Modell: Nicotinamid (48 mg/kg ip) plus Alloxan (120 mg/kg; ip) plus Nagerfutter plus Wasser

Metformin: Nicotinamid (48 mg/kg; ip) plus Alloxan (120 mg/kg; ip) plus Metformin (300 mg/kg; po) plus Nagetierfutter plus Wasser

APLE (100 mg/kg): Nicotinamid (48 mg/kg; ip) plus Alloxan (120 mg/kg; ip) plus APLE (100 mg/kg; po) plus Nagerfutter plus Wasser

APLE (200 mg/kg): Nicotinamid (48 mg/kg; ip) plus Alloxan (120 mg/kg; ip) plus APLE (200 mg/kg; po) plus Nagerfutter plus Wasser

APLE (400 mg/kg): Nicotinamid (48 mg/kg; ip) plus Aloxan (120 mg/kg; ip) plus APLE (400 mg/kg po) plus Nagerfutter plus Wasser

2.11. Messung des Körpergewichts.Das Körpergewicht der Ratten wurde vor Beginn aller Tierversuche gemessen. Anschließend wurde das Körpergewicht der Ratten in allen Gruppen alle 3 Tage über 18 Tage gemessen. Die Dosen wurden alle 3 Tage angepasst, um Änderungen des Körpergewichts widerzuspiegeln. Schließlich wurde das Körpergewicht der Ratten in allen Gruppen vor ihrer Tötung gemessen.

2.12. Blutentnahme, Vorbereitung von Seren und Isolierung von Organen.Nach dem Wiegen der Ratten am Tag 18 wurden die Ratten unter tiefer Chloroformanästhesie getötet. Blutproben wurden durch Herzpunktion gesammelt und dann in beschriftete leere Vacutainer-Röhrchen gegeben. Repräsentative Blutproben für jede Gruppe wurden bei 3000 U/min (Eppendorf-Zentrifuge 5702,4 Grad) für 5 Minuten zentrifugiert. Um Seren zu erhalten, wurde der Überstand in entsprechend gekennzeichneten Probenröhrchen gesammelt. Leber, Niere, Milz und Bauchspeicheldrüse wurden geerntet, frisch gewogen und in 10 % Formalin fixiert.

2.13.Messung von Seruminsulin, Glucagon und GLP-1.Seruminsulin-, Glucagon- und GLP-1-Spiegel wurden jeweils unter Verwendung von Ratten-Insulin-ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co. Ltd., China), Ratten-Glukagon-ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co. Ltd.) gemessen. , China) und Ratten-GLP-1-ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd., China) streng nach den Anweisungen des Herstellers.

2.14.Bestimmung der mittleren Fläche der Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse.Nach der histologischen Verarbeitung der repräsentativen Bauchspeicheldrüse wurden die resultierenden Mikrofotografien für die jeweiligen Gruppen mit der Amscope MD35-Okularkamera wie zuvor beschrieben gescannt [1]. Jede Mikrofotografie wurde auf Adobe Photoshop CS6 hochgeladen und anschließend mit einem stereologischen Raster überlagert. Die Anzahl der Überschneidungen, die über dem Stroma der Pankreasinseln liegen, wurde gezählt. Die Querschnittsfläche der Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse des repräsentativen Pankreas wurde unter Verwendung der Cavalieri-Methode und Punktzählung bestimmt [36]. Die Querschnittsfläche wurde nach folgender Formel bestimmt:

wo

A repräsentiert die Querschnittsfläche der Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse

XP stellt die Gesamtzahl der Überschneidungen dar, die über dem Stroma der Pankreasinseln liegen

a/p repräsentiert die Fläche pro Punkt des stereologischen Gitters M repräsentiert die lineare Vergrößerung.

2.15. Extraktion von -Amylase aus dem Pankreas von Meerschweinchen.Nach 20 Stunden Hunger wurde ein Meerschweinchen unter tiefer Anästhesie getötet und die Bauchspeicheldrüse chirurgisch entfernt. Die Bauchspeicheldrüse wurde frei von Fett und anderem Gewebe geschnitten und sofort in Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) gewaschen. Nach dem Wiegen des Pankreas wurde es in einem Gefrierschrank bei 4 Grad aufbewahrt. Die gefrorene Bauchspeicheldrüse wurde dann mit eiskaltem, 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4) unter Verwendung eines Homogenisators (WiseTis HG-15D-Homogenisator) homogenisiert (1 g der Bauchspeicheldrüse: 5 ml Puffer) und dann zentrifugiert bei 4400 U/min für 30 Minuten bei 4 Grad. Der Überstand wurde in getrennte Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert und in einem Gefrierschrank bei -20 Grad gelagert. Um das extrahierte Enzym (-Amylase) zu bestätigen, wurde eine im Handel erhältliche -Amylase mit dem extrahierten Enzym (-Amylase) unter Verwendung von Stärke und Iod verglichen. Das schwache oder Verschwinden der blau-schwarzen Färbung, die als Hinweis auf die Amylase-Aktivität angesehen wird, wurde mit einem Kontrollaufbau (kein Enzym plus Stärke plus Jod) verglichen, wo eine tiefe blau-schwarze Färbung vorlag.

2.16. Wirkung von APLE auf die enzymatische Aktivität von Amylase.Die Hemmung der enzymatischen Aktivität von alpha ( )-Amylase wurde mit einigen Modifikationen nach einem früheren Verfahren [37] getestet. Kurz gesagt wurde APLE (125 ul) oder Acarbose in steigenden Konzentrationen (100-1500 ug/ml) zu einem Satz markierter Reagenzgläser gegeben, die 125 ul -Amylaselösung in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,9) enthielten. Das APLE- oder Acarbose/Amylase-Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 25 Grad vorinkubiert. Anschließend wurden 125 &mgr;l 1-prozentige Stärke (hergestellt in 20 mM Phosphatpuffer, pH =6,9) in ausgewählten Zeitintervallen zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde jeweils 10 Minuten bei 25 Grad inkubiert. Die Beendigung jeder Reaktion erfolgte in Zeitintervallen durch Zugabe von 250 ul 3,5--Dinitrosalicylsäure(DNSA)-Reagens und weiteres Erhitzen in einem Wasserbad bei 100 Grad C für 5 Minuten, dann Abkühlenlassen auf Raumtemperatur. Jede Reaktion wurde mit destilliertem Wasser auf 2,5 ml aufgefüllt und die Extinktion wurde bei 540 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (UV-vis, T70 PG Instruments) gemessen. Ein Kontrollaufbau wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens hergestellt, außer dass -Amylase mit destilliertem Wasser anstelle von APLE vorinkubiert wurde. Die Alpha( )-Amylase-Inhibitoraktivität wurde wie folgt berechnet:

2.17. Modus der Hemmung der enzymatischen Aktivität von -Amylase durch APLE.Die Art der Hemmung der enzymatischen Aktivität von -Amylase durch APLE wurde nach einem früheren Verfahren [38] mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, 125 μl APLE (5 mg/ml) wurden zuerst mit 125 μl -Amylaselösung in 2 0 mM Phosphat bei 25 Grad für 10 Minuten in einem Satz beschrifteter Reagenzgläser vorinkubiert. Anschließend wurden den Reaktionsmischungen 125 ul Stärkelösung in verschiedenen Konzentrationen (0,3-5 mg/ml) zugesetzt

die Reaktion starten. Das Reaktionsgemisch wurde dann 10 Minuten lang bei 25 Grad inkubiert, bevor 250 ul 3,5--Dinitrosalicylsäure (DNSA)-Reagens hinzugefügt wurden, um die Reaktion zu stoppen. Die gebildete Produktmenge wurde durch Messen der Extinktion bei einer Wellenlänge von 540 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (UV-Vis, T70 PG Instruments) bestimmt. Das Verfahren wurde zur Kontrolle wiederholt, die durch Vorinkubation von &bgr;-Amylase mit einem Puffer anstelle von APLE hergestellt wurde. Der Lineweaver-Burk-Plot aus dem Michaeles-Menten-Plot wurde unter Verwendung von Graph-Pad Prism Version 8 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA) für die Schätzung von Km und Vmax erstellt. Die Art der Hemmung der enzymatischen Aktivität von -Amylase durch APLE wurde aus den geschätzten Km und Vmax abgeleitet.

2.18. Extraktion von -Glucosidase aus dem Dünndarm von Meerschweinchen.Die Extraktion von -Glucosidase aus dem Darm von Meerschweinchen wurde nach einem früheren Verfahren [39] mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt wurden die Meerschweinchen zuerst für 20 Stunden hungern gelassen und dann unter tiefer Anästhesie getötet. Der unmittelbar über dem Blinddarm und unmittelbar unter dem Zwölffingerdarm gelegene Dünndarm wurde chirurgisch entfernt und gründlich in eiskaltem 0,02 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,9) gespült, bevor er in frische Pufferlösung getaucht wurde. Bei einem Verhältnis von 1 g Darm-ne:5 ml Puffer wurde der isolierte Darm bei 4400 U/min für 10 Minuten bei 2 Minuten Unterbrechungen auf Eis homogenisiert (WiseTis HG-15D-Homogenisator, Deutschland). Das Homogenat wurde 30 Minuten bei 4 Grad zentrifugiert (Eppendorf 5430R Zentrifuge) und der Überstand wurde vorsichtig geerntet. Aliquots wurden in 2-ml-Kryoröhrchen gegeben und zur sofortigen Verwendung in Experimenten bei -20 Grad gehalten. Um das extrahierte Enzym (-Glucosidase) zu bestätigen, wurde eine im Handel erhältliche -Glucosidase mit dem extrahierten Enzym (a-Glucosidase) verglichen, indem 50 μL 3 mM p-Nitrophenylglucopyranosid (pNPG) mit 25 μL im Handel erhältlicher -Glucosidase oder 25 inkubiert wurden μL des extrahierten Enzyms (a-Glucosidase) bei 25 Grad. Die Beobachtung eines gelben p-Nitrophenol-Produkts nach jeweils 5 Minuten wurde als Bestätigung der Aktivität von -Glucosidase gewertet.

2.19. Wirkung von APLE auf die enzymatische Aktivität von Glucosidase.Die hemmenden Wirkungen von APLE und Acarbose (einem Standard-Glucosidase-Hemmer) wurden nach einer früheren Methode [40] mit einigen Modifikationen bewertet. Kurz gesagt, Phosphatpuffer (20 mM; pH =6,9) wurde verwendet, um p-Nitrophenylglucopyranose (pNPG) (Substrat für -Glucosidase) herzustellen. In separaten Experimenten wurde a-Glucosidase (50 μL) mit steigenden Konzentrationen von APLE (jeweils 25 μL), Acarbose oder Puffer für jeweils 10 Minuten vorinkubiert. Danach wurden 25 &mgr;l 3 mM p-Nitrophenylglucopyranosid zu entweder APLE/&agr;-Glucosidase- oder Acarbose/&agr;-Glucosidase-vorinkubiertem Gemisch zugegeben, um eine Reaktion zu starten. Das Reaktionsgemisch wurde jeweils 20 Minuten bei 25 Grad inkubiert. Nach 20-minütiger Inkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,1 M Na,CO, (1 ml) gestoppt. Eine Kontrolle wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens hergestellt, außer dass β-Glucosidase mit einem Puffer anstelle von APLE oder Acarbose vorinkubiert wurde. Das Reaktionsprodukt (ein gelb gefärbtes p-Nitrophenol) nach Beendigung der Reaktion wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers (UV-Vis, T70 PG Instruments) bei 405 nm zur Bestimmung der a-Glucosidase-Aktivität gemessen. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt. Die Versuche wurden jeweils dreimal wiederholt. Der Prozentsatz (Prozent) der Hemmung der -Glucosidase-Aktivität wurde unter Verwendung der Formel abgeschätzt:

2.20. Modus der -Glucosidase-Hemmung durch APLE.Die Art der Hemmung der enzymatischen Aktivität von -Glucosidase durch APLE wurde gemäß einem früheren Verfahren [41] mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, in einem Satz Reagenzgläser wurden genau 25 μl von 5 mg/ml APLE mit -Glucosidase-Lösung (5 0 μl) bei 25 Grad für 1 0 Minuten vorinkubiert. Im zweiten Satz Röhrchen wurde a-Glucosidase mit 50 μl 20 mM Phosphatpuffer (pH =6,9) vorinkubiert. Dann wurden 25 ul p-Nitrophenylglucopyranosid (PNP) in unterschiedlichen Konzentrationen (0,3-3,0 mg/ml) zu beiden Sätzen von Reagenzgläsern gegeben, um die Reaktion zu starten. Die Reaktionsmischungen wurden dann 20 Minuten lang bei 25 Grad inkubiert, wonach Na, CO, （1000 μl） zugegeben wurde, um die Reaktion zu beenden. Die freigesetzte Produktmenge wurde spektrophotometrisch unter Verwendung einer p-Nitrophenol-Standardkurve gemessen und in Reaktionsgeschwindigkeiten (v) umgewandelt. Es wurde ein doppelt reziprokes Diagramm (1/v gegen 1/S) aufgetragen, wobei S die Substratkonzentration ist. Die Art der Hemmung der -Glucosidase-Aktivität durch APLE wurde durch Analyse des Line-Weaver-Burk-Plots bestimmt.

2.21. Bewertung der Radikalfängeraktivität von 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazy(DPPH).Die DPPH-Radikalfängeraktivität wurde gemäß einem früheren Verfahren [42] mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt wurde ein 2-ml-Reaktionsgemisch hergestellt, indem DPPH (1,0 ml von 0,135 mM), hergestellt in Methanol, und 1,0 ml unterschiedlicher Konzentrationen von APLE (40,80,120,160 und 200 ug/ml) oder Ascorbinsäure. Das Reaktionsgemisch wurde kräftig geschüttelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen gelassen. Die Extinktion wurde bei 517 nm gegen eine Blindprobe gemessen (UV-vis, T70 PG Instruments). Alle Tests wurden dreifach durchgeführt. Als Kontrolle diente eine gleiche Menge Methanol und DPPH-Lösung. Die radikalfangende Aktivität von DPPH wurde unter Verwendung der Formel abgeschätzt:

2.22. Stickoxid (NO) Radikalfänger-Assay.Die Aktivität zum Abfangen von NO-Radikalen von APLE und Standards wurde unter Verwendung der Griess-Illosvory-Reaktion wie zuvor beschrieben [43] mit einigen wenigen Modifikationen abgeschätzt. Kurz gesagt verwendete das Griess-Ilosvory-Reagens 0,1 Prozent (w/v) Naphthylethylendiamindihydrochlorid anstelle von 5 Prozent 1--Naphthylamin. Unterschiedliche Konzentrationen

({{{{10}}}}ug/ml) von sowohl APLE als auch Standards (Gallussäure und Ascorbinsäure), hergestellt und auf 167 ul aufgefüllt, wurden in beschriftete Reagenzgläser gegeben und dann 667 ul davon 10 mM Natriumnitroprussid wurde zugegeben. Dann wurde Natriumphosphatpuffer (167 &mgr;l, pH 7,4) zugegeben und das Gemisch wurde 150 Minuten lang bei 25 Grad inkubiert. Danach wurden 2000 &mgr;l Sulfanilsäure-Reagenz (0,33 % in 20 % Eisessig) zugegeben und 5 Minuten stehen gelassen, um die Reaktion der Diazotierung zu vervollständigen. Schließlich wurden weitere 2000 &mgr;l 0,1 % Naphthylethylendiamindihydrochlorid zugegeben, gemischt und dann 30 Minuten bei 25 Grad stehengelassen. Die Nitritkonzentration wurde bei 546 nm gemessen (UV-vis, T70 PG Instruments) und mit der Kontrollnitratlösung berechnet, die keinen APPLE/oder Standards enthielt, aber alle anderen Komponenten des Reaktionsgemischs aufwies. Als Blindlösung wurde Natriumphosphatpuffer verwendet. Der Prozentsatz (Prozent) der NO-Abfangfähigkeit von APLE und Standards wurde unter Verwendung der Formel berechnet:

wobei Ac die Extinktion der Kontrolle und At die Extinktion des Tests (APLE/Standard) ist.

2.23.Ferric Reducing Antioxidant Capacity (FRAC) Assay.FRAC wurde nach der vorherigen Methode [44] mit wenigen Modifikationen getestet. Kurz gesagt umfasste die Reaktion 25 0 ul APLE/Standardlösung in unterschiedlichen Konzentrationen (12,5-200 ug/ml), 625 ul Natriumphosphatpuffer (0,2 M bei pH 6,6 ) und 625 ul 1-prozentiges Kaliumeisen(III)-cyanid, [K,Fe(CN)] in verschiedene Reagenzgläser. Diese wurden 20 Minuten lang bei 50 Grad inkubiert, um die Reaktion zu vervollständigen. Dann wurden 625 ul einer 10-prozentigen Trichloressigsäure (TCA)-Lösung zu den Reagenzgläsern gegeben. Das Gesamtgemisch wurde 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert, wonach 1800 ul Überstand entnommen und mit 1800 ul destilliertem Wasser gemischt wurden. Danach wurden 360 μl einer 0,1-prozentigen Eisenchloridlösung (FeCl) hinzugefügt und gründlich gemischt. Die Extinktion der Lösung wurde bei 700 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (UV-Vis, T70 PG Instruments) gegen den Reaktionsleerwert gemessen. Eine typische Blindlösung, die dieselbe Lösungsmischung ohne APLE/oder Quercetin enthielt, wurde unter ähnlichen Bedingungen inkubiert. Eine erhöhte Extinktion des Reaktionsgemisches zeigt eine erhöhte Reduktionskapazität an. Der Versuch wurde bei jeder Konzentration dreimal wiederholt. FRAC wurde als Quercetin-Äquivalent (QE) gemessen.

2.24. Abschätzung von ICs und ECs0 Zur Bestimmung von IC und ECsoof APLE in Bezug auf seine antioxidative, Radikalfänger- und hemmende Wirkung auf die enzymatische Aktivität von -Amylase und -Glucosidase wurde eine Reihe steigender Konzentrationen von APLE gegen die jeweiligen getestet Aktivitäten. Nach Umrechnung der Konzentrationen auf Logout wurde auf der horizontalen Achse die prozentuale maximale Aktivität (Antioxidans, Radikalfänger und Hemmwirkung auf die enzymatische Aktivität von -Amylase und a-Glucosidase) auf der vertikalen Achse aufgetragen. Die Konzentration von APLE, die 50 Prozent der maximalen Aktivitäten (Antioxidans,

das Abfangen freier Radikale und die inhibitorische Wirkung auf die enzymatische Aktivität von -Amylase und a-Glucosidase) wurde grafisch unter Verwendung der statistischen Software GraphPad Prism, Version 8, bestimmt.

2.25. Statistische Analyse.Die erhaltenen Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von Graph Pad Prism Version 8 für Windows (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Mittelwertvergleiche zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Mehrfachvergleichstests nach Tukey, durchgeführt. P Kleiner oder gleich 0,05 wurde in allen Analysen als statistisch signifikant angesehen.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Hindawi BioMed Research International Volume 2021, Artikel-ID 9920826, 17 Seiten https://doi.org/10.1155/2021/9920826