Eine mizellare Formulierung von Quercetin verhindert die Nephrotoxizität von Cisplatin

für weitere Informationen:ali.ma@wecistanche.com

Alfredo G. Casanova, Marta Prieto, Clara I. Colino & et al.

Das Antioxidans FlavonoidQuercetinwurde gezeigt, um zu verhindernNephrotoxizitätin Tiermodellen und in einer klinischen Studie und ist damit ein sehr vielversprechender prophylaktischer Kandidat in der Entwicklung.Quercetindie Löslichkeit ist sehr gering, was die klinische Anwendung erschwert. Ziel dieser Arbeit war es, bei Ratten die Bioverfügbarkeit und nephroprotektive Wirksamkeit einer mizellaren Formulierung von verkapseltem Pluronic F127- zu untersuchenQuercetin(P-Quercetin), mit verbesserter Hydrolöslichkeit. Intraperitoneale Verabreichung von P-Quercetinführt zu einer erhöhten Plasmakonzentration und Bioverfügbarkeit vonQuercetinim Vergleich zur äquimolaren Gabe von NaturQuercetin. Außerdem P-Quercetinbehält insgesamt seine nephroprotektiven Eigenschaften und verbessert sogar leicht einige Nierenfunktionsparameter im Vergleich zu natürlichemQuercetin. Insbesondere P-Quercetinverringerte die Erhöhung des Plasmakreatinins (von 3,4 ± 0,5 auf 1,2 ± 0,3 mg/dL) und des Harnstoffs (von 49 0,9 ± 43,8 auf 184,1 ±). 50,1 mg/dL) und die Abnahme der Kreatinin-Clearance (von {{20}},08±0,02 auf 0,58±0,19 ml/min)induziert durch das nephrotoxische Chemotherapeutikum Cisplatin, und es verbesserte den histologischen Nachweis einer tubulären Schädigung. Diese neue Formulierung mit verbesserten kinetischen und biopharmazeutischen Eigenschaften wird die weitere Erforschung von ermöglichenQuercetinals nephroprotektiver Kandidat in niedrigeren Dosierungen und durch Verabreichungswege, die auf seine klinische Anwendung ausgerichtet sind.

Schlüsselwörter:Cisplatin;Nephrotoxizität; Flavonoid;Quercetin; Nierenschutz; Bioverfügbarkeit;Niere;Mizellen; Löslichkeit; Formulierung

Vorbeugung vonNephrotoxizität

Klicken Sie auf Cistanche para que sirve für Nierenerkrankungen

1. Einleitung

ArzneimittelNephrotoxizitätist ein ernsthaftes medizinisches und wirtschaftliches Problem [1,2], da 25 Prozent der 100 am häufigsten verwendeten Medikamente auf Intensivstationen nephrotoxisch sind [3], undNephrotoxizitätist auch eine wichtige Ursache für das Ausscheiden von Kandidaten während des Arzneimittelentdeckungsprozesses 4]. Cisplatin ist ein platinbasiertes Antitumormittel, das häufig zur Behandlung einer Vielzahl solider bösartiger Neubildungen eingesetzt wird [5,6]. Fast 30 Prozent der Patienten zeigen Anzeichen vonNephrotoxizitätwährend der ersten zehn Tage nach der Verabreichung von Cisplatin, was eine wichtige Einschränkung der Dosierung und therapeutischen Wirksamkeit darstellt [5-8]. Akute CisplatinNephrotoxizitätverursacht eine Tubulopathie, die von einer 5--fachen Akkumulation in den Epithelzellen des proximalen Tubulus in Bezug auf seine Plasmakonzentration [9-1l] und in geringerem Maße im distalen Tubulus herrührt [12,13 ].

Die Cisplatin-Tubulopathie ist gekennzeichnet durch elektrolytische Störungen (hauptsächlich Hypomagnesiämie und Hypokaliämie) undakutNiereVerletzung(AKI). AKI ist ein häufiges Syndrom, das durch einen abrupten Rückgang der glomerulären Filtrationsrate (GFR), schwere Azotämie und häufig Oligurie oder Anurie gekennzeichnet ist [7,14]. Darüber hinaus trägt auch eine endotheliale Dysfunktion, die den renalen Gefäßwiderstand erhöht und die Autoregulation beeinträchtigt, zu Cisplatin-induzierter AKI bei[9]. Normalerweise ist AKI ein reversibler Zustand, der dennoch einen relevanten Einfluss auf die Patientenergebnisse hat, einschließlich erhöhter Krankenhaussterblichkeit (über 50 Prozent der Fälle unter den Schwerkranken), verlängerter Krankenhausaufenthalt, zusätzliche Gesundheitskosten und im mittleren und Langzeitszenarien, erhöhtes Entwicklungsrisikochronisches Nierenleidenund der allgemeinen und kardiovaskulären Morbimortalität [7,14]. Auf subzellulärer und molekularer Ebene wird die tubuläre Zytotoxizität von Cisplatin durch mitochondriale Schädigung angetrieben, die die Atmung einschränkt, oxidativen Stress erzeugt und apoptotischen und nekrotischen Zelltod und eine schädliche Entzündungsreaktion induziert [13,15,16]. Oxidativer Stress wird als zentraler Mechanismus der Zytotoxizität von Cisplatin erkannt undNephrotoxizität[12,13,15-17], die aus einer erhöhten Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und einer geschwächten endogenen antioxidativen Enzymbarriere resultieren [5,7,18].

Wirksame prophylaktische Maßnahmen für CisplatinNephrotoxizitätstellen einen unerfüllten klinischen Bedarf zur Verbesserung seines pharmakotoxikologischen Profils und zur Maximierung seines Nutzens dar. Bestehende Präventionsstrategien, einschließlich intensiver Flüssigkeitszufuhr, haben nur einen begrenzten Schutz gezeigt [6,19]. Neue Strategien, die auf der gleichzeitigen Verabreichung von nephroprotektiven Mitteln basieren, befinden sich in der Entwicklung. Kandidaten für nephroprotektive Mittel sind Magnesiumformulierungen |6,9 und vor allem eine Vielzahl von Antioxidantien [6,20,21]. Flavonoide sind eine Familie von nephroprotektiven polyphenolischen Produkten, die aus Gemüse, Früchten, Nüssen und Wein gewonnen werden und starke antioxidative Eigenschaften haben [22].Quercetinist ein bekanntes Flavonoid, das viele positive Wirkungen ausübt [23,24], einschließlich Abfangen reaktiver Sauerstoffspezies, Unterdrückung der Thrombozytenaktivierung, Endothelschutz, Modulation von Entzündungen, Hemmung der Apoptose, Tumorunterdrückung und Nephroprotektion. Mitverabreichung vonQuercetinneben einer Cisplatin-Therapie in einem Tiertumormodell eine Nephroprotektion, ohne die Antitumorwirkung zu beeinträchtigen |25,26]. Tatsächlich identifiziert eine aktualisierte Meta-AnalyseQuercetinals vielversprechender Kandidat als Neuroprotektor für die weitere klinische Entwicklung [21]. Konsequenterweise berichtete eine kürzlich durchgeführte klinische Studie über eine schützende Wirkung vonQuercetinauf kontrastmittelinduzierte Nephropathie (CIN) [27].

Eine starke Einschränkung der möglichen Anwendung vonQuercetin(allgemein von Flavonoiden geteilt) ist seine geringe Hydrolöslichkeit, die sich aus seiner chemischen Struktur und seinen Bestandteilen ergibt, die seine Absorption im Dünndarm und damit seine Bioverfügbarkeit und Wirksamkeit verringern [23,24,28]. Interessanterweise ist lipophobe Glukose-QuercetinKonjugate (Glucoside) sind wesentlich besser bioverfügbar als die lipophilen Aglykone, da letztere im Darmlumen weniger löslich sind [24]. In der Tat,QuercetinGlucoside aus Zwiebeln zeigen die höchste Absorptionsrate und das Nahrungsfett erhöht sichQuercetinAglykonabsorption im Dünndarm [29]. Die sehr geringe Wasserlöslichkeit vonQuercetinbehindert nicht nur seine klinische Verwendung durch praktische Verabreichungswege (dh oral, intravaskulär), sondern schränkt auch die vorklinische Forschung ein. Nichtsdestotrotz können in Tiermodellen alternative Verabreichungswege (dh intraperitoneal) mit Arzneimittelsuspensionen für Proof-of-Concept-Zwecke verwendet werden [25,26].

QuercetinFormulierungen mit neuen Trägermaterialien mit verbesserter Hydrolöslichkeit wurden entwickelt, deren biomedizinische Eigenschaften getestet werden müssen. Pluronic-Poloxamere sind eine Klasse von Trägermaterialien, die aufgrund ihrer Fähigkeit, in wässrigen Umgebungen Micellen zu bilden, die Absorption von wasserunlöslichen Verbindungen beherbergen und verstärken [30]. Hier stellten wir die Hypothese auf, dass eine mizellare Formulierung vonQuercetinverkapselt mit Pluronic F127, das zuvor beschrieben wurde [31], würde die nephroprotektiven Eigenschaften von natürlichem beibehaltenQuercetinund gleichzeitig verbesserte biopharmazeutische Eigenschaften für die Handhabung, Formulierung und Verabreichung bieten.

VerhindernNephrotoxizität:Quercetin

2. Ergebnisse

Mit der neuen mizellaren Formulierung von wurden eine Bioverfügbarkeits- und eine Nephroprotektionsstudie durchgeführtQuercetineingekapselt mit Pluronic F127[31 und unserer traditionellen natürlichen FormulierungQuercetin|25,26|(siehe unten Materialien und Methoden). Während letzteres eine Suspension war, die ein Tensid enthielt, war ersteres eine Kochsalzlösung ohne zusätzliche Zusätze. Unsere traditionelle Formulierung von NaturQuercetinwar nur für Versuchszwecke geeignet, fiel aus, wenn es still gelassen wurde, und war schwieriger zu handhaben und zu injizieren. Im Gegensatz dazu verhielt sich die mizellare Formulierung wie eine Lösung und zeigte keine Nachteile bei der Verwendung.

2.1.Bioverfügbarkeitsstudie

Als Methode zur vergleichenden Bioverfügbarkeit wurde die Evolution vonQuercetin(Q) Die Plasmakonzentration wurde nach einer einzelnen intraperitonealen Bolusgabe von natürlichem und P-Quercetin(PQ). Abbildung 1 zeigt den MittelwertQuercetinPlasmaspiegelkurven, die nach Verabreichung einer Dosis von erhalten wurdenQuercetinoder P-Quercetin. Die in den Gruppen Q und PQ beobachteten maximalen Arzneimittelkonzentrationen (Cmax) betrugen 1,14 ± 1,28 ug/ml bzw. 8,90 ± 4,62 ug/ml, dh ein 7,8--facher Anstieg für P-Quercetin, was darauf hinweist, dass die mizellare Formulierung die Arzneimittelabsorption erhöhte.

Abbildung 1. Entwicklung der Plasmakonzentration von Quercetin nach intraperitonealer Verabreichung eines einzelnen Bolus von äquimolarem P-Quercetin und natürlichem Quercetin.

Die Werte werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) (n=5 pro Gruppe) ausgedrückt. *p<0.05;><0.01;><0.001 vs.qgroup.="">Quercetin(50mg/kg, ip.);PQ:100mg/kgi.pP-Quercetin(mit 50 mg/kgQuercetin).

Tabelle 1. Pharmakokinetische Parameter nach intraperitonealer Verabreichung von P-Quercetin und natürlichem Quercetin (n=5 pro Gruppe).

F: Quercetin(50mg/kg, ip; PQ: P-Quercetin(100 mg/kg, ip). AUCo24: Fläche unter der Teilkurve; AUCo: Fläche unter der Gesamtkurve; MRT: mittlere Verweilzeit; t1/2: Eliminationshalbwertszeit; X: terminale Phasensteigung.

Tabelle 1 zeigt die modellunabhängigen pharmakokinetischen Parameter vonQuercetinbei Ratten nach Verabreichung einer einzelnen Bolusdosis von NaturalQuercetinoder P-Quercetin. Die Zeit bis zur Cmax wurde von 15 min (für natürlicheQuercetin) bis 1 h (für P Quercetin). Diese Verzögerung kann der anhaltenden Freisetzung von zugeschrieben werdenQuercetinaus der mizellaren Formulierung. Die Gesamtexposition von Ratten gegenüber dem Flavonoid war signifikant höher für P-Quercetin, wie die größere Fläche unter der Kurve (AUC) zeigt, was zu einer um 302,5 Prozent höheren Bioverfügbarkeit führt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die höhere Löslichkeit der mizellaren Formulierung ihre Absorption verstärkt.

2.2. Nephroprotektive Wirksamkeitsstudie 2.2.1. Physiologischer Zustand

Wie durch die Entwicklung des Körpergewichts belegt (Abbildung 2a), verschlechterte sich der allgemeine Gesundheitszustand nach der Behandlung mit Cisplatin im Vergleich zu den Kontrolltieren. Weder natürlichQuercetinnoch P-Quercetindie Wirkung von Cisplatin signifikant verändert. Allerdings beidesQuercetinBehandlungen verhinderten fast vollständig die Zunahme derNiere/Körpergewicht-Verhältnis, das durch Cisplatin induziert wird (Abbildung 2b), ein Parameter, von dem bekannt ist, dass er mit dem Ausmaß des Verschleißes korreliertNephrotoxizität[32].

Abbildung 2. Entwicklung des allgemeinen Gesundheitszustands. (a) Prozentuale Veränderung des Körpergewichts während des Experiments; (b) Nieren-/Körpergewichtsverhältnis am 9. Tag.

Die Werte werden als Mittelwert ± SEM (n=3-5 pro Gruppe) ausgedrückt. *p<><0.01;><0.001vs.controlgroup.><0.05;><0.01 vs.="" cp="" group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,="" i.p.)on="" day="">

CP plus Q:Quercetin(50 mg/kg, ip) für 9 Tage und Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) an Tag 3; CP plus PQ:P-Quercetin(100 mg/kg, ip) für 9 Tage und Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) am 3. Tag.

2.2.2. Beurteilung der Nierenfunktion und des Nierengewebes

Nach internationalen Kriterien wird AKI anhand von Erhöhungen der Plasmakreatininkonzentration (Crp)[33-35], einem Surrogatmarker der glomerulären Filtrationsrate (GFR), definiert und diagnostiziert. Auch andere Parameter, wie die Harnstoffkonzentration im Plasma, werden häufig als Azotämie-Indikatoren ausgewertet [36-38]. Erhöhungen von Crp und Plasmaharnstoff sind Anzeichen einer reduzierten GFR und AKI. In unserer Studie wurde die Nierenfunktion durch Cisplatin stark beeinträchtigt, und dieser Effekt wurde teilweise durch verbessertQuercetin. P-Quercetinzeigte eine etwas kühnere Aktivität als natürlichQuercetin, wie durch mildere Schäden und ein verbessertes Erholungsprofil angezeigt (Abbildung 3). Ratten in der Cisplatin (CP)-Gruppe unterzogen sich einer offensichtlichen AKI, da sie einen fortschreitenden und signifikanten Anstieg ihrer Plasma-Kreatinin- und Harnstoffspiegel im Vergleich zu denen der Kontrollen erlebten (Abbildung 3a, b). Diese Parameter nahmen auch in den Gruppen CP plus Q und CP plus PQ zu, jedoch in deutlich geringerem Ausmaß. Die Unterschiede zwischen den CP plus Q- und CP plus PQ-Gruppen waren statistisch nicht signifikant, jedoch wurden mit P- behandelte RattenQuercetinzeigten etwas niedrigere Kreatinin- und Harnstoffspiegel als die mit natürlichen behandeltenQuercetin. Die Kreatinin-Clearance (ClCr) ist eine Standardmethode zur GFR-Messung ]39,40]. In Übereinstimmung mit den Cr-Daten induzierte Cisplatin einen starken Drop-in, der teilweise durch abgemildert wurdeQuercetin(Abbildung 3c). In diesem Fall wurde jedoch ein merklicher Unterschied zwischen P-Quercetin und natürlichem Quercetin festgestellt, wobei ersteres wesentlich wirksamer bei der Verbesserung und Beschleunigung der Genesung war. Bemerkenswerterweise verhalten sich Clcr und Crpl umgekehrt proportional, was nur im stationären Zustand ersichtlich ist. Während AKI ändert sich die Nierenfunktion jedoch kontinuierlich und schnell, was zu einer leichten Entkopplung dieser Beziehung führt.

Abbildung 3. Entwicklung der Nierenparameter.

(a) Plasma-Kreatinin-Konzentration; (b) Plasma-Harnstoff-Konzentration; (c) Kreatinin-Clearance; (d) Proteinurie; und (e)KIM-1 Urinausscheidung.

Die Werte werden als Mittelwert ± SEM (n=3-5 pro Gruppe) ausgedrückt. *p<><><0.001 vs=""><0.05;><0.01vs.cp group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,i.p.)on="" day="">

CP plus Q:Quercetin(50 mg/kg, ip) für 9 Tage und Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) an Tag 3;CP plus PQ:P-Quercetin(100 mg/kg, ip.) für 9 Tage und Cisplatin (6,5 mg/kg, ip.) am 3. Tag. KIM-1:NiereVerletzungMolekül1.

Proteinurie wird auch häufig im Zusammenhang mit Nierenpathologien gemessen. Je nach zugrundeliegendem Schädigungsmuster kann die Proteinurie glomerulären Ursprungs (dh erhöhte Durchlässigkeit der glomerulären Filtrationsbarriere) oder wie im Fall von Cisplatin seinNephrotoxizität[13], kann es durch eine defekte tubuläre Reabsorption aufgrund einer tubulären Verletzung entstehen. Ein nicht signifikanter Anstieg der Proteinurie wurde in den CP- und CP-Q-Gruppen (obwohl in letzterer weniger ausgeprägt) am 7. Tag festgestellt, der sich am 9. Tag wieder normalisierte.NiereVerletzungMolekül 1; KIM-1)[41,42] wurde durch Cisplatin deutlich erhöht, und dieser Anstieg wurde durch beide Formen abgeschwächtQuercetin, obwohl P-Quercetinwar wieder etwas effektiver.

Die histologische Untersuchung des Nierengewebes stimmte mit den biochemischen Befunden überein. Proben von Ratten, die mit Cisplatin behandelt wurden, zeigten eine massive tubuläre Nekrose im oberen Streifen der äußeren Medulla, begleitet von einer gewissen kortikalen Affektion, undQuercetinreduzierte kortikale Verletzung (Abbildungen 4 und 5). Ratten, die nur das nephrotoxische Mittel erhielten, entwickelten eine tubuläre Dilatation und Obstruktion (ersichtlich als angesammeltes hyalines Material) und tubuläre Nekrose mit Deepithelisierung und Zellablösung. BeideQuercetinBehandlungen verringerten in ähnlicher Weise den durch Cisplatin induzierten kortikalen Schaden, hatten jedoch keine Wirkung auf den medullären Schaden (Abbildungen 4 und 5).

Abbildung 4. Repräsentative Bilder von mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Nierenproben.

Schwarze Pfeile: tubuläre Nekrose und Zellablösung; blaue Pfeile: tubuläre Dilatationen; grüne Pfeile: intratubuläre Ablagerungen von hyalinem Material. CP:Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) an Tag 3;

CP plus Q:Quercetin(50 mg/kg, ip) für 9 Tage und Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) an Tag 3; CP plus PQ: P-Quercetin(100 mg/kg, ip) für 9 Tage und Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) am 3. Tag.

Abbildung 5. Quantifizierung der Nierenschädigung.

Die Werte werden als Mittelwert ± SEM (n =5 Bilder × 3 Ratten pro Gruppe) ausgedrückt. * p<><0.001 vs.=""><0.05 vs.cp="">

CP: Cisplatin (6,5 mg/kg, ip.) an Tag 3; CP plus Q:Quercetin(50 mg/kg, ip für 9 Tage und Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) an Tag 3; CP plus PQ: P-Quercetin(100 mg/kg, ip) für 9 Tage und Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) am Tag 3. AU: willkürliche Einheiten.

3. Diskussion

Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine mizellare Formulierung vonQuercetinmit Pluronic F127 (P-Quercetin) mit verbesserten biopharmazeutischen Eigenschaften erhöhte die Bioverfügbarkeit dieses antioxidativen Flavonoids und behielt (oder verbesserte sogar leicht) seine insgesamt nephroprotektiven Eigenschaften im Vergleich zu natürlichenQuercetin.

Quercetinwurde als vielversprechender Kandidat zum Schutz vor Nierenschäden postuliert, die durch eine Reihe von Medikamenten und Toxinen verursacht werden, darunter Cisplatin [25,26], Methotrexat [43,44], Ciprofloxacin [45], NaF [46], HgCl [47] und Cadmium [48]. Obwohl diese Studien präklinische Wirksamkeit zeigten,Quercetinwurde aufgrund von Formulierungshindernissen und geringer Bioverfügbarkeit nicht in ähnlichen klinischen Szenarien getestet, mit Ausnahme einer klinischen Studie, in derQuercetinbot einen gewissen Schutz vor CIN [27]. Beide Einschränkungen sind Folgen der sehr schlechten Wasserlöslichkeit (nur 0,01 mg/mL, bei 25 Grad [49]) vonQuercetin, und seiner geringen Stabilität (die durch Temperatur, pH-Wert, Hydroxylierung, enzymatische Aktivität und Metallionen beeinflusst wird)[28,29,50]. Oral verabreichtQuercetinist während der Magenpassage aufgrund des sehr niedrigen Magen-pH-Werts (dh 1,5) einem starken Abbau ausgesetzt [50]. Im Dünndarm, chemisch geschützt durch einen höheren pH-Wert (7,5), der RestQuercetinwird nur minimal resorbiert. Um seine Bioverfügbarkeit und biologische Wirksamkeit zu erhöhen, wurden daher neue Formulierungen von Quercetin mit dem Ziel entwickelt, seine Hydrolöslichkeit zu verbessern und seine aktiven Einheiten vor Abbau zu schützen, einschließlich Liposomen, Nanopartikel, Nanoemulsionen und Mizellen [28].

Unsere mizellare Formulierung mit Pluronic F127 erhöhtQuercetinLöslichkeit um das Zehnfache und hat in In-vitro-Studien ein besseres Auflösungsverhalten in simulierten Magen- und Darmsäften gezeigt, da es eine deutliche Verringerung der Partikelgröße und eine homogenere Dispersion erreichtQuercetinin der PolymermatrixI3l. Diese Formulierung liefert eine deutlich erhöhte Menge anQuercetinin den Blutkreislauf, was zu einer 3--fachen Bioverfügbarkeit führt, die sich seltsamerweise nur in einer geringfügig höheren nephroprotektiven Wirkung niederschlägt. In Übereinstimmung damit haben wir keine zusätzliche nephroprotektive Wirkung beobachtet, wenn wir eine höhere Dosis (dh 100 mg/kg) von natürlichem verwendet habenQuercetinin früheren Experimenten (unsere unveröffentlichten Beobachtungen)[25,26]. In diesen Studien war unsere Interpretation, dass wahrscheinlich höhere Dosen von ipQuercetin(i.e., >50 mg/kg) führte aufgrund der reduzierten Löslichkeit nicht zu einer erhöhten Bioverfügbarkeit, was zu keiner signifikant erhöhten Nettoresorption führte. Dies fiel mit gelben Ablagerungen von nicht absorbiertem Material zusammenQuercetinbei der Tötung in der Peritonealhöhle gefunden werden. Darüber hinaus zeigen unsere vorliegenden Ergebnisse, dass selbst höhere Quercetin-Plasmakonzentrationen (wie sie beispielsweise mit P-Quercetin erzielt werden) nur eine geringfügig höhere Wirkung haben. DaQuercetinObwohl die Verteilung in vereinfachter Form durch ein Zwei-Kompartiment-Modell erster Ordnung erklärt wurde [51], scheint der Zugang zu Zielzellen aus dem Hauptkompartiment (dh dem Blutkreislauf) nicht die Einschränkung zu sein. Daher bleibt der Grund, warum die maximale nephroprotektive Wirkung fast mit den niedrigeren Plasmakonzentrationen erreicht wird, die durch natürliches Quercetin erzielt werden, schwer fassbar.

Dies hat praktische Implikationen für die weitere Entwicklung vonQuercetinals prophylaktischer Nephroprotektor. Erstens eröffnen diese Ergebnisse die Möglichkeit zu untersuchen, ob niedrigere Dosierungsschemata ähnlich wirksam sind, da ein reichlicher Überschuss an Bioverfügbarkeit von P-Quercetinkann geopfert werden, ohne an therapeutischer Wirkung zu verlieren, maximiert aber das Sicherheitsprofil. Zweitens eröffnet sich nun die Möglichkeit einer oralen Verabreichung, die jedoch auf die neue Formulierung getestet werden muss. Die Absorption aus der Peritonealhöhle vermeidet die Barrieren, denen man auf oralem Weg begegnet. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass die höhere Löslichkeit im Darmlumen zu einer erhöhten und abgebundenen Menge führen könnteQuercetinBioverfügbarkeit innerhalb des therapeutischen Fensters. Drittens könnte der intravenöse Weg jetzt eine realistische Alternative mit minimierter Toxizität sein, wodurch Absorptionsbarrieren vermieden würden. Bisher wurden experimentelle injizierbare Formulierungen vonQuercetinverwendeten Dimethylsulfoxid (DMSO) als Lösungsmittel [51].

Es ist bekannt, dass Cisplatin in den proximalen und distalen Tubuli akkumuliert und diese schädigt und je nach Konzentration Apoptose und Nekrose der Tubulusepithelzellen induziert [16]. Das proximale S3-Segment ist am stärksten betroffen, obwohl auch S1 und S2 durch höhere Dosen zunehmend geschädigt werden. In Übereinstimmung mit seinen bekannten antiapoptotischen Eigenschaften auf Tubuluszellen [52,53],Quercetinreduzierte kortikale tubuläre Deepithelisierung. Die identische Wirkung, die bei beiden Formulierungen beobachtet wird, verstärkt die Idee, dass dieQuercetinVerteilungskinetik auf dieNierensind in unserer Studie gesättigt. Außerdem innerhalb derNieren, Quercetinzeigt ein anderes Verhalten entlang des Nephrons. In der Tat,Quercetinhatte keine Wirkung auf die äußere Medulla, wo sich das S3-Segment der proximalen Tubuli befindet.Quercetinscheint sich in den S1-, S2- oder distalen Tubuli anzusammeln, die sich in der Nähe des Cortex befinden. Weil unbekannt ist, wie (d. h. welche Transporter oder Diffusionswege) und von wo (d. h. von der luminalen oder basolateralen Seite)Quercetintubulären Zellen zugreift, ist weitere Forschung notwendig, um diese unterschiedlichen Effekte zu erklären.

Die mäßige Erhaltung des kortikalen Gewebes kann die Wirkung nur teilweise erklärenQuercetinauf die Nierenfunktion (dh GFR). Ein zusätzlicher Schutz kann sich aus den vaskulären Wirkungen von ergebenQuercetin. Die Endothelfunktion ist an der Regulierung des renalen Blutflusses (RBF) und der GFR beteiligt, indem sie den kontraktilen Tonus der afferenten und efferenten Arteriolen moduliert [54-57]. Cisplatin induziert eine endotheliale Dysfunktion, und es wird angenommen, dass dies wesentlich zum Abfall der GFR beiträgt, zusammen mit der renalen afferenten Vasokonstriktion, die durch die tubuloglomerulären Rückkopplungsmechanismen (aktiviert durch tubuläre Schäden) und durch entzündliche Zytokine induziert wird [13,58]. Tatsächlich ist die Umkehrung der endothelialen Dysfunktion eine weithin anerkannte Wirkung vonQuercetin(und von Flavonoiden im Allgemeinen)[59-61l, was erklären könnte, warumQuercetinverbessert RBF (und damit GFR), wie zuvor berichtet [25]. Darüber hinaus könnten diese endothelial-vaskulären Effekte auch dazu beitragen, die etwas höhere Wirksamkeit von P-Quercetinbei der Verbesserung der Nierenfunktion und der Wiederherstellung der Nierenfunktion. Es ist wahrscheinlich nicht unvernünftig zu spekulieren, dass eine höhere Bioverfügbarkeit eine stärkere Wirkung auf die Endothelschicht in direktem Kontakt mit dem Blut haben könnte.

Einige der nach der Verabreichung von beobachteten WirkungenQuercetinkönnte durch seine Metaboliten ausgeübt werden.Quercetinwird in der Darmschleimhaut und der Leber durch Glucuronidierung, Sulfatierung und Methylierungsreaktionen metabolisiert [62], wobei die häufigsten Metaboliten Glucuronid-Metaboliten im Blutstrom sind [63]. Speziell,Quercetin-3-bO-Glucuronid (Q3GA), ein wichtiger Plasmametabolit, hat nachweislich entzündungshemmende und vaskuläre Wirkungen, sowohl direkt als auch nach Metabolisierung zurück in die Aglykonform [64]. Weitere Forschung ist notwendig, um die spezifischen Metaboliten, die für die Neuroprotektion verantwortlich sind, und ihre unterschiedliche Produktion und Transformation von verschiedenen Verabreichungsorten zu ihren endgültigen Zielen zu verstehen.

Zusammenfassend zeigt diese erste Studie das therapeutische Potenzial von P-Quercetinals verbesserte Formulierung mit verbesserten biopharmazeutischen und pharmakokinetischen Eigenschaften, nützlich für die weitere Entwicklung und prospektive klinische Anwendung in der Prophylaxe vonNephrotoxizität.

Vorteile von Quercetin auf Nephrotoxizität

4. Materialien und Methoden

Alle Chemikalien und Reagenzien wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen, sofern nicht anders angegeben.

4.1.Herstellung der mizellaren Formulierung (P-Quercetin) und das NatürlicheQuercetinFormulierung

QuercetinHydrat (Mindestreinheit von 95 Prozent) wurde von Acros Organics (Madrid, Spanien) erworben und das Ethylenoxid-Propylenoxid-Blockcopolymer Pluronic F127 (durchschnittliches Molekulargewicht 12,6 kDa, Hydrophilie-Lipophilie-Gleichgewicht 22) wurde von BASF (Ludwigshafen am Rhein, Deutschland). Für die mizellare Formulierung wurde zur Herstellung die überkritische Antilösungsmittel-Präzipitationstechnik verwendetQuercetin/Pluronic F127 Partikel (P-Quercetin) wie zuvor beschrieben [31]. Das resultierende Pluronic-QuercetinFormulierung hatte eine relative Zusammensetzung von 50 Prozent /50 Prozent w/w Pluronic F127/Quercetin. Für das NatürlicheQuercetinFormulierung,Quercetinwurde in 0,16 Prozent Tween 20 in Kochsalzlösung suspendiert, wie zuvor beschrieben [25,26].

4.2. Tiere und Bioethik

Alle Verfahren wurden vom Bioethikausschuss der Universität von Salamanca und der Regionalregierung von Kastilien und Leon, Ministerium für Landwirtschaft und Viehzucht (Code: 0000037, 27. Juli 2015) genehmigt. Die Tiere wurden gemäß den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/UE des Rates der Europäischen Gemeinschaft und der aktuellen spanischen Gesetzgebung zur Verwendung und Pflege von Versuchstieren (RD53/2013, 1. Februar 2013) behandelt. Männliche Wistar-Ratten (200-250 g) wurden unter kontrollierten Umgebungsbedingungen im Tierhaus der Universität von Salamanca mit freiem Zugang zu Wasser und Standardfutter gehalten.

4.3. Bioverfügbarkeitsstudie

Die Ratten wurden in zwei experimentelle Gruppen eingeteilt: O (n=5), in denen die Tiere eine Einzeldosis von erhieltenQuercetin(50 mg/kg); und PQ(n=5), bei dem die Tiere eine einzelne ip-äquimolare Dosis von P-Quercetin(100 mg/kg (d. h. mit 50 mg/kgQuercetin). Anschließend wurden Blutproben in mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) beschichteten Röhrchen aus einem kleinen Einschnitt in der Schwanzspitze zu den folgenden Zeiten entnommen:0.25,0.5,1,2,8, 12 und 24 Uhr. Das Plasma wurde durch Zentrifugation gewonnen und mit 10 μL 10 mM Ascorbinsäure （um zu vermeidenQuercetinAbbau) wurde zu 100 μl Plasma gegeben und bis zu seiner Analyse bei -80 Grad eingefroren.QuercetinDie Konzentrationen wurden durch ein Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie(HPLC)-Verfahren mit UV-Detektion bestimmt. Es wurde eine C18-Säule von Prosper mit einer Partikelgröße von 3 um verwendet, mit einer mobilen Phase, die aus 28 Prozent Acetonitril und 72 Prozent einer 0,2-prozentigen Orthophosphorsäure-Wasserlösung bei einer Flussrate von 1 ml/min bestand. Die Detektionswellenlänge betrug 371 nm. Vor der Injektion in das Chromatographiegerät wurden die Proben einem Glucuronidierungsprozess zur Quantifizierung der Gesamtmenge unterzogenQuercetin. Dazu wurden 100 μL Plasma mit 1000 Units -Glucuronidase aus Helix pomatia in 0,1 M Acetatpuffer (pH 5) versetzt und 1h bei 37 Grad inkubiert . Dann wurde ein Extraktionsprozess mit 100 &mgr;l einer 0,5M80∶20 Acetonitril/Essigsäure-Mischung (dreimal) durchgeführt. Sobald der Überstand in einem Stickstoffstrom verdampft war, wurde der Trockenrückstand in den 40 &mgr;l der mobilen Phase wieder aufgelöst und 20 &mgr;l wurden in das HPLC-System injiziert.

4.4. Nephroprotektionsstudie

Die Ratten wurden in die folgenden Versuchsgruppen eingeteilt (Abbildung 6): Kontrolltiere (n=3) erhielten Vehikel (NaCl0,9 Prozent) intraperitoneal (ip) für 9 Tage; CP(n=5)-Tiere erhielten eine einzelne nephrotoxische Dosis von Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) am Tag 3 des Experiments; CP plus Q(n=5)-Tiere erhielten eine tägliche Dosis vonQuercetin(50 mg/kg, ip) für 9 Tage und eine Einzeldosis Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) an Tag 3; und CP plus PQ (n=5)Tiere erhielten eine tägliche Dosis P-Quercetin(100 mg/kg, ip (d. h. mit 50 mg/kgQuercetin)) für 9 Tage und eine Dosis Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) am 3. Tag.

Abbildung 6. Schema des Nephrotoxizitätsmodells.

CP: Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) an Tag 3; CP plus Q:Quercetin(50 mg/kg, ip) für 9 Tage und Cisplatin (6,5 mg/kg, ip) an Tag 3; CP plus PQ:P-Quercetin(100 mg/kg, ip.) für 9 Tage und Cisplatin (6,5 mg/kg, ip.) am 3. Tag.

Blutproben (15 0 μl) wurden an den Tagen 0, 3, 5, 7 und 9 in heparinisierten Kapillaren aus einem kleinen Einschnitt in der Schwanzspitze entnommen. Das Plasma wurde durch Zentrifugation (11,000 U/min für 3 min) abgetrennt und bei -80C gehalten. An den Tagen 7 und 9 wurde 24-Stunden-Urin in Stoffwechselkäfigen gesammelt, durch Zentrifugation (2000 × g für 9 Minuten) geklärt und bei -80 Grad gelagert. Am Ende des Experiments (Tag 9) wurden die Ratten anästhesiert und ihreNierenwurden seziert, gewogen und für histologische Untersuchungen in 3,7 % Paraformaldehyd fixiert.

Plasma- und Urin-Kreatinin wurden unter Verwendung eines kommerziellen Kits basierend auf der Jaffe-Methode [65] (QuantiChrom Creatinine Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) gemessen. Plasmaharnstoff wurde mit einem kommerziellen Kit basierend auf der Jung-Methode bestimmt [66] (Quan-tiChrom Urea Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). Die Kreatinin-Clearance (Clcr) wurde nach folgender Formel berechnet: Clcr=Crur × UF/ Crp); wobei Crur der Urinkonzentration von Kreatinin, UF dem Urinfluss und Crp der Plasmakonzentration von Kreatinin entspricht. Proteinurie wurde mit dem Bradford-Assay gemessen [67]. KIM-1 wurde mit der Ratte quantifiziertNiereVerletzungMolekül 1(KIM-1)ELISA-Kit (Cusabio, Houston, TX, USA). nach den Anweisungen des Herstellers.

Für histologische Untersuchungen wurden Nierenproben in Paraffin eingebettet und Gewebeschnitte von 5 um mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die Fotografien wurden unter einem Olympus BX51-Mikroskop aufgenommen, das mit einer Olympus DP70-Farbdigitalkamera (Olympus, Madrid, Spanien) verbunden war. Die Schadensquantifizierung wurde wie zuvor beschrieben blind durchgeführt [68]. Kurz gesagt wurden fünf zufällige Fotografien der kortikalen Region und fünf Fotografien der externen Markregion (dh der durch Cisplatin geschädigten Bereiche) aufgenommen, wobei diese Bereiche gleichmäßig kartiert wurden. Jedes Bild wurde in 10 identische Abschnitte unterteilt (unter Verwendung der Microsoft Office PowerPoint 2016-Software), denen jeweils eine Bewertung von 0 (kein Schaden), 1 (Vorhandensein von Schäden in weniger als 1/3 der Fläche) und 2 (Vorhandensein von Schäden) zugewiesen wurde zwischen 1/3-2/3 der Fläche) oder 3 (Vorhandensein von Schäden in mehr als 2/3 der Fläche). Der Schaden wurde unter Berücksichtigung des Vorhandenseins von tubulärer Nekrose und Zellablösung, tubulärer Dilatation, Vakuolisierung, Vorhandensein von hyalinen Ablagerungen und Verlust des Bürstensaums bewertet.

4.5.Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Ausreißer wurden mit dem Grubbs-Test|69] identifiziert. Die Normalverteilung der Daten wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test ausgewertet. In der Bioverfügbarkeitsstudie wurde der Vergleich zwischen den beiden Gruppen unter Verwendung des Student-t-Tests oder des Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt. Die pharmakokinetische Studie wurde mittels einer modellunabhängigen Analyse der durchschnittlichen Plasmaspiegel von durchgeführtQuercetin. Die geschätzten Parameter zur Bewertung der relativen Bioverfügbarkeit vonQuercetinwaren Fläche unter der Teilkurve der Plasmaspiegel (AUC)24, Fläche unter der Gesamtkurve der Plasmaspiegel (AUC)0~, Steigung der Endphase, Eliminationshalbwertszeit (ti/2) , und mittlere Verweilzeit (MRT). Die Schätzung der pharmakokinetischen Parameter erfolgte durch Kombination der Trapezmethode zur Schätzung der Fläche unter der Teilkurve und der nichtlinearen Regression der terminalen Phase der Plasmaspiegelkurve. Für die Nephroprotektionsstudie wurde eine Varianzanalyse (ANOVA) mit Scheffe-Tests oder einem Kruskal-Wallis-Test für Vergleiche zwischen den Gruppen durchgeführt. Die statistische Analyse wurde mit der Software IBM SPSS Statistics 20.0 (International Business Machines, Armonk, NY, USA) durchgeführt. Zur Erstellung der Grafiken und Illustrationen wurden Microsoft Office Excel und PowerPoint 2016 (Microsoft, Redmond, WA, USA) verwendet.

Verweise

1. Awdishu, L.; Mehta, RLThe6R's of Drug-InducedNephrotoxizität. BMCNephrol.2017,18,124. [CrossRefl[PubMed]

2. Perazella, MADrug Use undNephrotoxizitätauf der Intensivstation.NiereInt.2012,81,1172-1178. [Querverweis] [PubMed]

3. Taber, SS; Mueller, BADrug-Associated Renal Dysfunction. Crit.Care Clinic.2006,22,357-374, vi. [Querverweis] Huang, JX; Blaskovich, MA; Cooper, MACell- und Biomarker-basierte Assays zur VorhersageNephrotoxizität.

Notiz:Das Obige ist keine vollständige Referenzliste