Prognostischer Wert der Leberkinase B1 (LKB1) bei der Immunität der Magenkrebs-assoziierten Tumor-Mikroumgebung

Abstrakt:

Leberkinase B1 (LKB1) ist ein Tumorsuppressorgen, dessen Inaktivierung bei verschiedenen Tumorarten häufig auftritt. Es ist jedoch nicht bekannt, ob LKB1 mit den klinischen Merkmalen von Magenkrebs (GC) und der Regulierung der Tumorimmunität zusammenhängt. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass LKB1 im Serum gesunder Personen stark exprimiert wird (n = 176) im Vergleich zu GC-Patienten (n = 416) und ist auch mit klinischen Ergebnissen und guten Überlebensraten bei GC-Patienten verbunden. Darüber hinaus sind Gene im Zusammenhang mit Immun-Checkpoints und T-Zell-Aktivierung, wie z. B. Parkinson, beteiligt−1, PD−Es wurde gezeigt, dass L1, CD8A, CD8B, CD28 und GZMM in GC-Untergruppen mit hoher LKB1-Expression stark exprimiert werden. Im Vergleich zu frischem Magenkrebsgewebe wurde LKB1 in CD3+CD8+- und CD3+CD8+CD28+-T-Zellen in frischen benachbarten nicht- Krebsgewebe. CD3+CD8+-T-Zellen produzierten ein IFN−Anti−Immunantwort gegen Krebs. Darüber hinaus korrelierte der Anteil der CD3+CD8+-T-Zellen, die LKB exprimierten, positiv mit IFN−Ausdruck. Darüber hinaus hatten GC-Patienten mit niedriger LKB1-Expression eine schlechte objektive Ansprechrate und ein schlechteres progressionsfreies Überleben und Gesamtüberleben, wenn sie mit Pembrolizumab behandelt wurden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass LKB1 ein potenzieller Immun-Checkpoint bei GC-Patienten sein könnte.

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Schlüsselwörter:

LKB1; Magenkrebs; klinische Ergebnisse; Immun-Checkpoint; CD3+CD8+ T-Zellen

1. Einleitung

Weltweit ist Magenkrebs (GC) ein Problem der öffentlichen Gesundheit und die fünfthäufigste diagnostizierte bösartige Erkrankung [1,2]. Obwohl die gängigen Behandlungsansätze für GC, wie Magenresektion, Chemotherapie, Bestrahlung und gezielte Therapien, in der klinischen Praxis weit verbreitet sind [3], ist die 5−Die Jahresüberlebensrate der fortgeschrittenen GC beträgt < 20 %. Aufgrund der Fortschritte in der GC-Therapie [4,5] gilt die Immuntherapie als innovativer Ansatz [6], der die Behandlung dieser Krankheit aufgeklärt hat [7]. Im Zeitalter der Immuntherapie wurde der programmierte Zelltod 1 (PD−1)/PD−Ligand 1 (PD−L1) hat sich als Biomarker für die Krebsdiagnose und Vorhersage des Ansprechens auf eine Immuntherapie erwiesen, ist jedoch nicht empfindlich genug. Daher ist es wichtig, neue prädiktive Biomarker in der Immuntherapie für GC zu identifizieren.

Leberkinase B1 (LKB1), auch bekannt als STK11, ist eine Serin/Threonin-Kinase, die in zahlreichen Geweben weit verbreitet ist [8]. Zunehmende Beweise haben gezeigt, dass LKB1 ein wichtiger Tumorsuppressor bei mehreren Krebsarten ist, wie z. B. Bauchspeicheldrüsenkrebs [9], Melanom [10,11] und nicht−kleinzelliger Lungenkrebs [12,13] und Gebärmutterhalskrebs [14]. Darüber hinaus ist bekannt, dass LKB1 an der Regulierung der Immunzellfunktionen beteiligt ist [10]. Ein LKB1-Mangel in T-Zellen fördert die Entwicklung einer gastrointestinalen Polyposis [15] und betrifft auch die IL−11−JAK/STAT3-Weg, der zur gastrointestinalen Tumorentstehung führt [16]. Darüber hinaus spielt LKB1 eine wichtige Rolle bei der Makrophagenfunktion, indem es an Prozessen wie Zellwachstum, Stoffwechsel und Polarisierung beteiligt ist [17]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass der Verlust von LKB1 an der Modulation der Immunmikroumgebung des Tumors beteiligt sein könnte [18]. Insbesondere unterdrückt ein LKB1-Mangel T−Zellaktivität durch Förderung der Produktion proinflammatorischer Zytokine und der Rekrutierung von Neutrophilen in der Tumormikroumgebung von Patienten mit Lungenkrebs [19]. Eine begrenzte Anzahl von Studien hat den Zusammenhang zwischen LKB1-Expression, klinischen Ergebnissen, Immunkontext und therapeutischer Reaktionsfähigkeit bei GC geklärt. In dieser Studie haben wir einen Zusammenhang zwischen der LKB1-Expression und den klinischen Ergebnissen bei GC-Patienten nachgewiesen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass eine niedrige LKB1-Expression eine immunsuppressive Mikroumgebung fördert und zu einer schlechten Prognose bei GC-Patienten führen könnte. Darüber hinaus profitierten GC-Patienten mit hoher LKB1-Expression stärker von der Behandlung mit Pembrolizumab. Der prognostische Wert und die mögliche Rolle von LKB1 in der Tumorimmunologie werden hier diskutiert und können zum Verständnis eines möglichen Mechanismus beitragen, der der GC zugrunde liegt.

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2. Materialien und Methoden

2.1. Patienten und Blutproben

Diese retrospektive Studie wurde von der örtlichen Ethikkommission des Zhejiang Cancer Hospital (IRB−2021−154) genehmigt. Wir haben zwischen Januar 2015 und August 2022 Blutproben von 176 gesunden Erwachsenen und 416 GC-Patienten entnommen und von 26 GC-Patienten 26 Paare frisches Krebsgewebe und angrenzendes nicht krebsartiges Gewebe entnommen. Patienten mit anderen bösartigen Tumoren in der Vorgeschichte wurden ausgeschlossen.

2.2. Expression von CEA, CA19−9, AFP und LKB1

Ein kommerzielles ELISA-Testkit (RX106671H; Ruixinbio, Quanzhou, Fujian, China) wurde verwendet, um den Grad der LKB1-Expression in den Plasmaproben gemäß einem standardisierten Protokoll zu bewerten. Kurz gesagt, entsprechende Plasmaproben (50 µL) und Standardmodellproteine ​​(50 µL) wurden zu 96-Well-Platten gegeben. Als nächstes wurden 100 µL eines HRP-markierten Antikörpers hinzugefügt und die 96-Well-Platten wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Platten dreimal mit einem Waschpuffer gewaschen. Die Substratmischung (100 µL) wurde hinzugefügt und die Platten wurden in einem Mikroplatten-Lesegerät bei OD 450 analysiert. Chemilumineszenz wurde verwendet, um CEA (CFDA 20163402679, Siemens Healthcare Diagnostic Products., Shanghai, China), CA19−9 (CFDA 20173401781, Siemens Healthcare Diagnostic Products., Shanghai, China) und AFP-Expression (CFDA 20173400053, Siemens Healthcare Diagnostic Products., Shanghai, China). Die Software SPSS 19.0 (IBM, Armonk, NY, USA) wurde verwendet, um die Fläche unter den ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) von CEA, CA19−9, AFP und LKB1 zu bestimmen. Basierend auf dem pathologischen TNM-Stadium, dem FIGO-Stadium und der HER2-Expression wurden 416 GC-Patienten in verschiedene Untergruppen eingeteilt. Ein gepaarter t-Test wurde verwendet, um die LKB1-Expression in verschiedenen Untergruppen von GC-Patienten zu analysieren.

2.3. Analyse der LKB1-Expression in Immunzellen und der Zusammenhang mit Immun-Checkpoints

Comprehensive Analysis on Multi-Omics of Immunotherapy in Pan-cancer [CAMOIP] (http://www.camoip.net/) (Zugriff am 1. Januar 2{{10}}23) ist ein Tool zur Analyse Expressions- und Mutationsdaten aus der Krebsgenomanalyse (TCGA) und den mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICI) behandelten Projekten. Zur Analyse der Immunogenität und Signalweganreicherung bei GC-Patienten wurde eine Standardverarbeitungspipeline verwendet. CAMOIP wurde auch verwendet, um unterschiedliche Immunzellexpressionen entsprechend der LKB1-Expression bei GC-Patienten zu analysieren. Die UCSC-Xena-Datenbank (https://xena.ucsc.edu/public) (abgerufen am 1. Januar 2023) ist eine Plattform zur Analyse von Krebsgenomikdaten, die die Visualisierung und Analyse histologischer Daten aus mehreren Krebsproben unterstützt. Die UCSC Xena-Datenbank bietet LKB1, T-Zell-Immun-Checkpoint-Gene, T-Zell-Aktivierung und Antigenpräsentation der mRNA-Expression. Eine komplexe Heatmap wurde mit der R-Sprache (4.2.1) erstellt. Die Software SPSS 19.0 (IBM, Armonk, NY, USA) wurde verwendet, um die LKB1-Expression basierend auf Quartilen zu analysieren. Wir haben die GC-Patienten entsprechend dem mittleren Wert der LKB1-Expression in Gruppen mit hoher und niedriger LKB1-Expression eingeteilt. Ein t-Test wurde verwendet, um T-Zell-Immun-Checkpoint-Gene, T-Zell-Aktivierung und Antigenpräsentation der mRNA-Expression bei GC-Patienten in Untergruppen von LKB1-GC-Patienten mit hoher und niedriger Expression zu analysieren. p-Werte < 0,001 wurden als statistisch signifikant angesehen.

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2.4. Durchflusszytometrie

Frisches krebsartiges (n {{0}}) und frisches angrenzendes nicht krebsartiges Gewebe (n=26), die intraoperativ gewonnen wurden, wurden innerhalb von 30 Minuten in einer Gewebemahllösung zermahlen. Mahllösung und mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) (1 × 106 Zellen/ml) wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (50 µL, CR20012; Zhejiang Crenry, Zhejiang, China) gesammelt, ergänzt mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA). (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) und 15 Minuten lang mit antihumanen monoklonalen Antikörpern inkubiert. Die anti-humanen monoklonalen Antikörper wurden verwendet, wie in Tabelle 1 und Ergänzungstabelle S1 und Ergänzungsabbildung S1 gezeigt: Anti-LKB1 (PTG, Wuhan, Hubei, China); anti-CD68 (Bilegend, San Diego, CA, USA); anti-CD209 (Bilegend, San Diego, CA, USA); Anti-CD28 (Bilegend, San Diego, CA, USA); Anti-CD45/CD56/CD19 (Beckman Coulter, St. Louis, MO, USA); Anti-CD45/CD4/CD8/CD3 (Beckman Coulter, St. Louis, MO, USA); Anti-CD4, CD3 (Beckman Coulter, St. Louis, MO, USA); Anti-CD45RO (Beckman Coulter, St. Louis, MO, USA); Anti-CD8 (Beckman Coulter, St. Louis, MO, USA); Anti-CD38 (Beckman Coulter, St. Louis, MO, USA); und Anti-CD45RA (Beckman Coulter, St. Louis, MO, USA). Ein CD3/CD4/CD8/CD28/PD-1-Nachweiskit wurde von Raise Care (Hangzhou, China) erworben. Zur Analyse der Ergebnisse wurden die CXP-Analysesoftware und ein Beckman Coulter FC 500 Durchflusszytometer verwendet [20,21]. Für den Zytokinnachweis in Plasmaproben von GC-Patienten wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers ein Zytokin-Nachweiskit (Seager, Dalian, China) verwendet.

Tabelle 1. Vergleich zwischen GC-Patienten und gesunden Personen mit klinischen Parametern.

2.5. Anteile von Immunzellen in frischem Gewebe

Ein t-Test wurde verwendet, um die Immunzellanteile in frischem Krebsgewebe (n=26) und frischem angrenzendem nicht krebsartigem Gewebe (n=26) zu analysieren. Der Unterschied zwischen den LKB1+- und PD1+LKB1+-Immunzellanteilen in frischen krebsartigen und frischen angrenzenden nicht krebsartigen Geweben wurde mithilfe eines gepaarten t-Tests analysiert. Die Software SPSS 19.0 (IBM, Armonk, NY, USA) wurde verwendet, um die Korrelation zwischen Immunzellanteilen und Zytokinen in frischem krebsartigem und frischem angrenzendem nicht krebsartigem Gewebe zu bestimmen.

2.6. Gewebeimmunhistochemie (IHC)

Die Biobank des Zhejiang Cancer Hospital stellte frisches krebsartiges (n=26) und frisches angrenzendes, nicht krebsartiges Gewebe (n=26) zur Verfügung, die in dieser Studie verwendet wurden. Zur Durchführung der IHC gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde ein IHC-Kit (Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd., Peking, China) verwendet. Kurz gesagt, Paraffinschnitte wurden zur Antigengewinnung nacheinander entparaffiniert, rehydriert und gekocht. Der primäre LKB1-Antikörper (IPB0924 [Verdünnungsverhältnis 1:100]; Baijia, Taizhou, Jiangsu, China) und der Interferon-Gamma (IFN−)-Antikörper (IPB0703 [Verdünnungsverhältnis 1:100]; Baijia, Taizhou, Jiangsu, China) wurden 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schnitte wurden dreimal mit PBS gewaschen. Den Paraffinschnitten wurde 20 Minuten lang ein histochemischer Polymerverstärker (400 µL) zugesetzt, gefolgt von drei Waschgängen mit PBS. Als nächstes wurden sekundäre Antikörper zu den Paraffinschnitten gegeben und 20 Minuten lang inkubiert, gefolgt von Waschen, DAB-Färbung, Gegenfärbung und Montage.

2.7. Ansprechen der Behandlung von GC-Patienten auf Pembrolizumab basierend auf der LKB1-Expression

Das Ansprechen auf die Behandlung auf Pembrolizumab und klinische Daten von GC-Patienten, die sich einer Immun-Checkpoint-Blockade (ICB) unterzogen, wurden einem früheren Bericht entnommen [22]. Die Software SPSS 19.0 (IBM, Armonk, NY, USA) wurde verwendet, um die LKB1-Expression basierend auf Quartilen zu analysieren. Wir haben die GC-Patienten entsprechend dem mittleren Wert der LKB1-Expression in Gruppen mit hoher und niedriger LKB1-Expression eingeteilt. Die R-Sprache (4.2.1) wurde verwendet, um das Ansprechen der Pembrolizumab-Behandlung von GC-Patienten anhand der LKB1-Expression zu bestimmen. Die Expression von PD-L1 wurde mit der Software SPSS 19.0 (IBM, Armonk, NY, USA) basierend auf Quartilen analysiert. GC-Patienten wurden entsprechend dem mittleren Wert in PD-L1-Gruppen mit hoher und niedriger Expression eingeteilt. Basierend auf der LKB1- und PD-L1-Expression wurden GC-Patienten innerhalb der PD-L1-Untergruppen mit hoher und niedriger Expression in LKB1 hoch und niedrig stratifiziert, und Python wurde verwendet, um das Ansprechen auf die Pembrolizumab-Behandlung in den Untergruppen widerzuspiegeln. Das Gesamtüberleben und das progressionsfreie Überleben der mit Pembrolizumab behandelten GC-Patienten wurden mithilfe der Kaplan-Meier-Methode mit einem Log-Rank-Test analysiert.

2.8. Statistische Analyse

Statistische Analysen wurden mit der Software SPSS 19.0 (IBM, Armonk, NY, USA) durchgeführt. Das Überleben der Patienten wurde telefonisch bestätigt und mithilfe der Kaplan-Meier-Methode mit einem Log-Rank-Test analysiert. p-Werte < 0.05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Darüber hinaus wurde Kaplan-Meier Plotter (http://www.kmplot.com) (abgerufen am 1. Januar 2023) verwendet, um die Wirkung von LKB1 (hohe vs. niedrige Expression) auf das Überleben von GC-Patienten zu bestätigen. Python wurde verwendet, um die klinischen Merkmale und Parameter der GC-Patienten widerzuspiegeln.

3. Ergebnisse

3.1. Zusammenhang zwischen LKB1-Expression und klinischen Merkmalen bei GC-Patienten

In dieser Studie wurden 416 GC-Patienten (268 Männer und 148 Frauen) und 176 gesunde Personen (87 Männer und 89 Frauen) eingeschlossen. Die Merkmale gesunder Personen und GC-Patienten sind in Abbildung 1A und Tabelle 1 zusammengefasst. Die klinischen Ergebnisse der GC-Patienten sind zusammengefasst, einschließlich CEA-, CA19−9-, AFP- und HER2-Expression, pathologischer Grad, Union for International Cancer Control (UICC). ) Tumorstadium, Lymphknotenbefall und Fernmetastasen (Abbildung 1B, Tabellen 1 und 2). Wie in Abbildung 1C gezeigt, wurden CEA, CA19−9 und AFP im Serum von GC-Patienten stark exprimiert, während LKB1 bei gesunden Personen stark exprimiert wurde. Im Vergleich zu CEA, CA19−9 und AFP hatte LKB1 die beste Spezifität und Sensitivität (AUC=0.727; Abbildung 1D). Unter den klinischen Parametern war LKB1 gemäß den UICC-Stufenkriterien in den Stadien T3–4, N2–3, M1 und III–IV deutlich niedriger (p < {{30}}.0 5, p < 0.05, p < 0,001 bzw. p < 0,01; Abbildung 1E und Tabelle 2). Darüber hinaus wurde LKB1 bei HER2-negativen GC-Patienten zahlenmäßig stark exprimiert (Abbildung 1F). Somit legen diese Ergebnisse nahe, dass LKB1 möglicherweise an der GC-Progression beteiligt ist.

Abbildung 1. Die Beziehungen zwischen der LKB1-Expression und den klinischen Merkmalen. (A, B): Klinische Merkmale bei gesunden Personen (n=176) und GC-Patienten (n=416) wurden mit Python kartiert. (C): Die Expression von CEA, CA19−9 und AFP wurde im Serum von GC-Patienten und gesunden Personen gemessen. (D): Im Vergleich zu CEA, CA19−9 und AFP wies LKB1 eine höhere Sensitivität und Spezifität auf. (E) Die LKB1-Expression war bei GC-Patienten im Stadium N2–3, M1 und III–IV geringer. (F), LKB1 wurde bei HER2-negativen GC-Patienten numerisch stark exprimiert. HER2-~+: HER2-negative GC-Patienten. HER2++~+++: außer bei HER2-negativen GC-Patienten. Ungepaarter t-Test, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Tabelle 2. Ausgangsmerkmale von GC-Patienten.

3.2. LKB1 fördert eine immunsuppressive Mikroumgebung bei GC-Patienten

Den TCGA-Datenbanken zufolge unterschied sich der T-Zell-Rezeptorkomplex deutlich zwischen GC-Patienten mit hoher und niedriger LKB1-Expression (Abbildung 2A). Wir zeigten außerdem, dass sich die Expression von T-Zellen bei GC-Patienten in den Untergruppen mit hoher und niedriger LKB1-Expression unterschied, einschließlich CD8+-T-Zellen, regulatorischen T-Zellen, Neutrophilen und Eosinophilen (Abbildung 2B). Darüber hinaus wurden starke Korrelationsmuster zwischen der LKB1-Expression und der Hochregulierung von Genen beobachtet, die an T-Zell-Immuncheckpoints, der T-Zell-Aktivierung und der Antigenpräsentation beteiligt sind (Abbildung 2C). Wir haben GC-Patienten basierend auf PD-1-, PD-L1-, CD8A-, CD8B-, CD28- und GZMM-mRNA-Expression innerhalb der LKB1-Untergruppen mit hoher und niedriger Expression weiter geschichtet. Interessanterweise wurden alle Gene in der LKB1-Untergruppe mit hoher Expression stark exprimiert (Abbildung 2D). Die Expression von LKB1, PD-1 und PD-L1 zeigte begrenzte Unterschiede im schleimigen und diffusen Typ (Ergänzende Abbildung S2). Diese Daten legen nahe, dass LKB1 mit dem T-Zell-Aktivierungsphänotyp und dem T-Zell-Immuncheckpoint bei GC-Patienten assoziiert sein könnte.

3.3. LKB1 wird selektiv in T-Zellinfiltraten (CD3+CD8+) in der GC exprimiert

Um die LKB1-Expression in der Immunmikroumgebung zu bestimmen, haben wir die Expression von sechs immuninfiltrierenden Zellen im peripheren Blut (B), frischem Krebsgewebe (T) und angrenzenden nicht krebsartigen Geweben (N) sowie 12 Arten der Zytokinexpression bei GC-Patienten gemessen ( Abbildung 3A). Wir haben auch die LKB1-Expression basierend auf der Häufigkeit aller sechs Immuninfiltrationszellen, einschließlich B-Zellen, T-Zellen, Neutrophilen, Makrophagen und dendritischen Zellen, nachgewiesen (Abbildung 3A und ergänzende Abbildung S3). Wir fanden heraus, dass der Anteil der T-Zellen (CD3+CD8+) in benachbarten nicht krebsartigen Geweben (N) höher war, während der Anteil der T-Zellen (CD3+CD{{ 9}}) war in frischem Krebsgewebe (T) höher und andere T-Zellen zeigten begrenzte Unterschiede zwischen frischem Krebsgewebe (T) und angrenzendem nicht krebsartigem Gewebe (N; Abbildung 3B). Darüber hinaus T-Zellen (CD3+CD8+LKB1+, CD3+CD8+CD28+LKB1+, CD 3+CD8+CD28+PD−1+LKB1+) hatte signifikant höhere Verhältnisse in frischen angrenzenden nicht krebsartigen Geweben (N; Abbildung 3C). Die LKB1-Expression in anderen Immunzellen war bei frischem Krebsgewebe (T) und angrenzendem nicht krebsartigem Gewebe (N) ähnlich, mit Ausnahme von Neutrophilen (Ergänzende Abbildung S3). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass LKB1 möglicherweise speziell mit der T-Zell-Infiltrat-Mikroumgebung (CD3+CD8+, CD3+CD8+CD28+) assoziiert ist bei GC-Patienten.

Abbildung 2. LKB1 ist mit dem T-Zell-Aktivierungsgen und Immun-Checkpoints assoziiert. (A) Der T-Zell-Rezeptorkomplex zeigte den größten Unterschied in den LKB1-Untergruppen mit hoher und niedriger Expression. (B) CAMOIP-Datenbankanalyse der unterschiedlichen Expression von Immunzellen zwischen den LKB1-Untergruppen mit hoher und niedriger Expression. (C) Die Heatmap zeigt die Z-Score-normalisierten log-cpm-Werte für Signatur-Immungensätze basierend auf der LKB1-Expression (n=407). (D) PD-1, PD-L1, CD8A, CD8B, CD28 und GZMM wurden in der Patientenuntergruppe mit LKB1-hohem GC stark exprimiert. Ungepaarter t-Test, ns: kein signifikanter Unterschied, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 , **** p < 0,0001.

Abbildung 3. LKB1 ist mit der T-Zell-Infiltration bei GC-Patienten verbunden. (A) Die Heatmap zeigt den Anteil der Immunzellen im peripheren Blut (B), im frischen Krebsgewebe (T) und im angrenzenden nicht krebsartigen Gewebe (N) sowie die Zytokinexpression. (B) Die Verhältnisse verschiedener Arten von T-Zellen in frischem Krebsgewebe (T) und angrenzendem nicht krebsartigem Gewebe (N). (C) Unterschiedliche Anteile von T-Zellen, die LKB1 in frischem Krebsgewebe (T) und angrenzendem Nichtkrebsgewebe (N) exprimieren. Gepaarter t-Test, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

3.4. LKB1 korreliert möglicherweise mit der IFN−-Expression

Wir gingen davon aus, dass die Expression von LKB1 in Immunzellen mit der Funktion der Immunzellen korreliert. Basierend auf den Ergebnissen analysierten wir den Zusammenhang zwischen dem Anteil der Immuninfiltrationszellen (LKB1+) und der Zytokinexpression (Abbildung 4A). Eine frühere Studie zeigte, dass von T-Zellen produziertes IFN− (CD3+CD8+) ein wirksamer Indikator für die Vorhersage der klinischen Wirksamkeit und des Überlebens mit Anti-PD-1-Blockade bei GC-Patienten ist [23,24] . Wir fanden heraus, dass nur die T-Zellen-Anteile (CD3+LKB1+) und (CD3+CD8+LKB1+) eine leicht positive Korrelation mit IFN− aufwiesen Expression in frischem krebsartigem (T) und angrenzendem nicht krebsartigem Gewebe (N; Abbildung 4B). Als nächstes bestimmten wir die LKB1- und IFN−-Expression in den oben genannten frischen Krebsgeweben (T) und angrenzenden nicht krebsartigen Geweben (N) und stellten fest, dass die LKB1-Expression in Krebsgeweben im Gegensatz zur IFN−-Expression signifikant geringer war (Abbildung 4C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass LKB1 möglicherweise einen positiven Zusammenhang mit der Antitumor-IFN−-Expression hat, die von T-Zellen (CD3+CD8+, CD3+CD8+CD{{ 23}}).

Abbildung 4. LKB1 korrelierte positiv mit der IFN−-Expression. (A) Analyse des Zusammenhangs zwischen dem Anteil des Immunzellinfiltrats (LKB1+) und der Zytokinexpression. (B) Korrelation der T-Zellen-Anteile (CD3+LKB1+) und (CD3+CD8+LKB1+) mit der IFN−-Expression in frischem Krebs (T) und angrenzendes nicht krebsartiges Gewebe (N). (C) Immunhistochemische Analysen der LKB1- und IFN−-Expression in frischen krebsartigen (T) und angrenzenden nicht krebsartigen Geweben (N).

3.5. LKB1 sagt ein gutes Ansprechen auf Pembrolizumab in der GC voraus

Basierend auf den Ergebnissen könnte LKB1 ein potenzieller Immun-Checkpoint sein. Wie in Abbildung 5A angegeben, war eine niedrige LKB1-Expression mit einem deutlich kürzeren Gesamtüberleben verbunden, basierend auf dem Überleben von GC-Patienten von 2015 bis 2019. In Übereinstimmung mit diesem Befund wurde die Kaplan-Meier-Datenbank (http://kmplot.com/) ( (Zugriff am 1. Januar 2023) deutete auch darauf hin, dass die LKB1-Expression die Prognose von GC-Patienten erheblich beeinflusste, wobei das Gesamtüberleben bei Patienten mit niedriger LKB1-Expression deutlich geringer ausfiel (Abbildung 5B). Um den prädiktiven Wert von LKB1 für die Immuntherapie zu bewerten, wurde anschließend die ICB-Kohorte bestehend aus mit Pembrolizumab behandelten GC-Patienten analysiert (Tabelle 3). Im Vergleich zu GC-Patienten mit hoher LKB1-Expression hatte die Untergruppe mit niedriger LKB1-Expression eine verringerte objektive Ansprechrate (ORR; Abbildung 5C). Darüber hinaus zeigten GC-Patienten mit geringer LKB1-Expression ein schlechteres PFS und OS (Abbildung 5D). Eine frühere Studie zeigte, dass die Expression von PD-L1-mRNA mit der Wirksamkeit der Pembrolizumab-Behandlung verbunden war [6]. Darüber hinaus wurden GC-Patienten basierend auf der LKB1- und PD-L1-Expression innerhalb der PD-L1-Untergruppen mit hoher und niedriger Expression in LKB1 hoch und niedrig stratifiziert. Wie in Abbildung 5E dargestellt, hatten GC-Patienten mit hoher Expression von LKB1 und PD-L1 die höchste ORR. Die Korrelation zwischen PD-L1/LKB1-Expression und molekularen Parametern bei GC-Patienten ist in Tabelle 4 zusammengefasst. Zusammengenommen könnte LKB1 ein potenzieller Immunkontrollpunkt für die Vorhersage des Ansprechens auf Pembrolizumab bei GC-Patienten sein.

Tabelle 3. Objektive Reaktion von Magenkrebspatienten auf Pembrolizumab.

Tabelle 4. Zusammenhang zwischen der LKB1/PD-L1-Expression und molekularen Parametern.

Abbildung 5. Die LKB1-Expression sagt die Reaktion auf Pembrolizumab bei GC-Patienten voraus. (A) Hohe Werte der LKB1-Expression waren von 2015 bis 2019 mit einem verlängerten Überleben bei GC-Patienten verbunden. (B) Der Kaplan-Meier-Plotter zeigte, dass hohe Werte von LKB1 das Überleben von GC-Patienten verlängerten. (C) Die gestapelten Balken- und Wasserfalldiagramme zeigen die Reaktion auf Pembrolizumab in der ICB-Kohorte (n=43) basierend auf der LKB1-Expression. (Pearsons χ2-Test). (D) Kaplan-Meier-Kurven des progressionsfreien Überlebens (PFS) und des Gesamtüberlebens (OS) in der ICB-Kohorte (n=43) basierend auf der LKB1-Expression. (E) Basierend auf der LKB1-mRNA-Expression in den Untergruppen von GC-Patienten mit hoher und niedriger PD-L1-Expression zeigte die Heatmap die Reaktion auf Pembrolizumab und molekulare Parameter in der ICB-Kohorte (n=43). GS, genomisch stabil; MSI-H, Mikrosatelliteninstabilität – hoch; EBV, EBV positiv; Siegelringzelle: Magen-Siegelringzellkarzinom; ORR, objektive Rücklaufquote; SD, stabile Erkrankung; PR, Teilantwort; PD, fortschreitende Erkrankung; CR, vollständige Reaktion; M/D Adeno, mäßig differenziertes Adenokarzinom; P/D Adeno, schlecht differenziertes Adenokarzinom; W/D Adeno, gut differenziertes Adenokarzinom; Gemischt (W/D und P/D), gut differenziertes Adenokarzinom und schlecht differenziertes Adenokarzinom.

4. Diskussion

GC ist eine häufige bösartige Erkrankung und die dritthäufigste Krebstodesursache weltweit [17,18]. In den letzten Jahrzehnten haben sich die therapeutischen und diagnostischen Strategien für GC deutlich verbessert [19]. Aufgrund des Mangels an wirksamen diagnostischen Markern wird die Diagnose jedoch häufig erst in einem fortgeschrittenen Stadium gestellt, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von<20% [25,26]. Therefore, there is an urgent need to explore tumor markers with favorable specificity and sensitivity for GC diagnosis. In this study, we first showed that LKB1 expression was decreased in GC serum. Compared with GC diagnostic biomarkers mainly used in clinical practice, including CEA, CA19−9, and a−1−fetoprotein (AFP), LKB1 showed the best specificity and sensitivity. Furthermore, LKB1 was associated with clinical features of GC patients, such as grade, invasion depth, TNM stage, UICC stage, and vital status. These results suggested that LKB1 serves as a tumor suppressor gene and suppresses GC progression.

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LKB1 wurde ursprünglich 1997 identifiziert und ist auch als STK11 bekannt [27]. LKB1 ist ein wichtiges menschliches Tumorsuppressorgen, und bei Patienten mit nichtkleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) treten LKB1-Mutationen oder Genomverlust häufig gleichzeitig mit KRAS-Veränderungen auf. Diese Kombination führt zu einem äußerst aggressiven Phänotyp und einer verringerten Überlebensrate [28–30]. Die meisten Berichte über LKB1 konzentrierten sich hauptsächlich auf Lungenkrebs, mit begrenzten Berichten über die Rolle von LKB1 bei der GC. Eine frühere Studie zeigte, dass die LKB1-Expression mit einer schlechten Prognose bei GC-Patienten verbunden sein könnte [31]; Ob LKB1 jedoch als potenzieller diagnostischer Marker und immuntherapeutisches Ziel dient, ist nicht geklärt. Unsere Studie zeigte zum ersten Mal, dass eine geringe Expression von LKB1 bei Patienten mit GC zu einer schlechteren therapeutischen Reaktion auf Pembrolizumab führte, was darauf hindeutet, dass LKB1 ein potenzielles immuntherapeutisches Ziel sein könnte.

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In jüngster Zeit hat die Immuntherapie große Vorteile bei der klinischen Behandlung von GC gezeigt [32,33]. Die PD-1/PD-L1-Blockade hat sich als neuartige und vielversprechende Therapiestrategie herausgestellt [34] und unterstreicht die Bedeutung der Antitumorimmunität und der Normalisierung der Dysfunktion zytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs, CD8+) bei Krebserkrankungen [35]. . Bei zahlreichen Krebsarten reguliert die CTL-Infiltration die Tumorregression und gilt als positiver Prognoseindikator [36]. Studien haben jedoch darauf hingewiesen, dass eine Funktionsstörung von CTL bei der Infiltration zu einer Immunumgehung und letztendlich zu einem Versagen beim Angriff auf Krebszellen führt [37]. Es wurde gezeigt, dass die PD-1/PD-L1-Blockade etablierte Tumoren über dysfunktionale CTL eliminiert und so die Anti-Tumor-Immunität stärkt [38]. Wir haben gezeigt, dass PD-1/PD-L1 in LKB1-stark exprimierenden Untergruppen von GC-Patienten stark exprimiert wurde, was darauf hindeutet, dass LKB1 mit T-Zell-Immuncheckpoints assoziiert sein könnte. Darüber hinaus ist IFN− ein Zytokin, das die Virusreplikation hemmt und die Präsentation spezifischer Antigene verstärkt, die von CD8+T-Zellen freigesetzt werden [39]. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass T-Zell-Aktivierungs- und Antigenpräsentationsgene auch in den Untergruppen der GC-Patienten stark exprimiert wurden, mit hoher LKB1-Expression und T (CD3+CD8+LKB1+, CD3+CD8+CD28+LKB1+)-Zellen hatten eine positive Korrelation mit der IFN−-Expression in frischen Geweben von GC-Patienten. Daraus folgerten wir, dass LKB1 die Sekretion von T-Zellen (CD3+CD8+, CD3+CD8+CD28+) behindern könnte und positiv mit Anti assoziiert ist −Tumor-IFN−-Expression. Der zugrunde liegende Mechanismus, durch den LKB1 mit der Aktivierung zytotoxischer T-Zellen verbunden ist, bedarf weiterer Untersuchungen.

Verweise

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