R. Vesicarius L. übt eine nephroprotektive Wirkung gegen Cisplatin-induzierten oxidativen Stress aus
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com
Md. Mahmudul Hasan1, Die meisten. Sayla Tasmin2, Ahmed M. El-Shehawi3, Mona M. Elseehy4, Md. Abu Reza1und Ariful Haque2*
Abstrakt
Hintergrund:Cisplatin ist ein hervorragendes Antikrebsmittel, aber seine Verwendung wurde aufgrund der schweren Nephrotoxizität bemerkenswert verringert. R. vicarious L. ist ein Blattgemüse, das offensichtlich ein antiangiogenes, entzündungshemmendes, antiproliferatives, hepatoprotektives und nephroprotektives Potenzial aufweist. Daher wurde diese Studie entwickelt, um den Methanolextrakt (RVE) auf eine mögliche nephroprotektive Wirkung zu untersuchen.
Methoden:In erster Linie wurde die antioxidative Aktivität von RVE in vitro anhand der Fähigkeit von 2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) zum Abfangen freier Radikale bestätigt. Danach wurden männliche Swiss-Albino-Mäuse mit Cisplatin (2,5 mg/kg) für 5 aufeinanderfolgende Tage behandelt, um Nephrotoxizität zu induzieren. Die Erholung von der Nephrotoxizität wurde untersucht, indem die Tiere an den nächsten 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit RVE (25, 50 und 100 mg/kg) intraperitoneal (ip) behandelt wurden. Nach Beendigung der Behandlung wurden die Mäuse getötet und die Nieren gesammelt. Ein Teil davon wurde in Natriumphosphatpuffer homogenisiert, um den Malondialdehyd (MDA)-Spiegel zu bewerten, ein anderer Teil wurde verwendet, um die Genexpression (NQO1, p53 und Bcl-2) zu bewerten. Darüber hinaus wurde die Wasserstoffperoxid (H2O2)-Neutralisierungskapazität von RVE in HK-2-Zellen in vitro bewertet. Schließlich wurden bioaktive sekundäre Pflanzenstoffe in RVE mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) bestimmt.
Ergebnisse:RVE zeigte in vitro eine dosisabhängige antioxidative Aktivität mit einem IC50-Wert von 37,39 ± 1,89 ug/ml.
Die Behandlung mit RVE verringerte bemerkenswert (p < {{0}}.05)="" den="" mda-gehalt="" im="" nierengewebe.="" außerdem="" wurde="" die="" expression="" von="" nqo-,="" p53-="" und="" bcl-2-genen="" signifikant="" (p="">< 0,05)="" in="" dosisabhängiger="" weise="" aufgrund="" der="" verabreichung="" von="" rve="" abgeschwächt.="" rve="" kehrte="" den="" h2o2-spiegel="" in="" hk-2-zellen="" signifikant="" (p="">< 0,05)="" auf="" fast="" den="" normalwert="" um.="" aus="" gc-ms,="" zehn="" verbindungen,="" darunter="" drei="" bekannte="" antioxidantien="" "4h-pyran-4-one,="" 2,="" 3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-")="" ,="" "hexadecansäure"="" und="" "squalen"="" wurden="" nachgewiesen.="" der="" extrakt="" war="" reich="" an="" einem="" alkaloid="">
Fazit:Insgesamt besitzt RVE eine Schutzwirkung gegen Cisplatin-induzierte Nierenschäden.
Schlüsselwörter:Cisplatin, R. vicarious, Mäuse, Niere, HK-2-Zellen, oxidativer Stress, NQO1-Gen
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Einführung
Oxidativer Stress ist das Ergebnis eines Missverhältnisses zwischen der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und regulären antioxidativen Abwehrmechanismen [1]. Regelmäßige biochemische Reaktionen, häufige Exposition gegenüber der ungünstigen Umgebung und eine erhöhte Aufnahme von Xenobiotika führen zur ROS-Produktion [1]. ROS interagieren mit den Cysteinresten redoxempfindlicher Signalmoleküle, einschließlich Transkriptionsfaktoren, Proteintyrosinphosphatasen und Proteinkinasen; Folglich führt die Oxidation von Thiolgruppen an diesen Resten zu Veränderungen der Zielproteine, biologischen Wirkungen, Signalkapazitäten, Immunität und ergänzenden Lebend/Tot-Paradigmen der Zelle [2]. Sauerstoffhaltige chemische Spezies mit reaktiven Eigenschaften sind als ROS bekannt, die freie Radikale und nicht-radikalische Moleküle wie Superoxid bzw. H2O2 umfassen [3]. Oxidativer Stress, der durch ROS induziert wird, ist mit der Ätiologie zahlreicher Krankheiten, einschließlich Krebs, verbunden. Akute myeloische Leukämie (AML) ist eine krebsartige Wucherung von Blutzellen im Knochenmark. Zu den zellulären und molekularen Ereignissen, die AML zugrunde liegen, gehören DNA-Schäden, klonale Vermehrung, erhöhter Zelltod und weitere genetische Instabilität, die das Ergebnis von ROS-induziertem oxidativem Stress sind [4]. Die menschliche Physiologie ist mit zahlreichen Mechanismen ausgestattet, die Antioxidantien erzeugen können, um einen Schutz vor oxidativem Stress auszuüben, was zum Schutz der Zellen vor toxischen Wirkungen führt und der Krankheitsprävention dient [5]. Zellen entwickeln jedoch endogene Mechanismen, um oxidativem Stress entgegenzuwirken und die erforderliche ROS zu erhalten [6].
NAD(P)H: Chinonoxidoreduktase 1 (NQO1) ist ein Flavoenzym [7], das Zwei- oder Vier-Elektronen-Reduktionen katalysieren kann und diese Eigenschaft zur Entgiftung von Chininen nutzt [8]. Es kann Zellen vor oxidativen Schäden schützen, indem es den Redox-Zyklus beiseite lässt und die Produktion freier Radikale reduziert [8]. Neben der xenobiotischen Entgiftung ist NQO1 auch an der Superoxid-Neutralisierung, Modulation des p53-proteasomalen Abbaus [9], Bcl-2-Hemmung [10] und erhöhter Anfälligkeit für Zellverletzungen beteiligt [11].
Cisplatin ist das erste von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Krebsmedikament auf Platinbasis [12]. Cisplatin übt Apoptose aus, indem es oxidativen Stress und eine Überexpression des Tumorsuppressorgens p53 induziert [12]. Mehrere Nebenwirkungen, einschließlich Nephrotoxizität, Hepatotoxizität, Gastotoxizität, Ototoxizität, Myelosuppression und Neurotoxizität, sind das Ergebnis von Cisplatin-induziertem oxidativem Stress [12]. Diese Nebenwirkungen haben die Verwendung von Cisplatin bemerkenswert verringert, obwohl es eine hervorragende Antikrebsaktivität hat. Cisplatin ist bekannt dafür, oxidativen Stress auszulösen und das NQO1-Gen in Mäusenieren zu unterdrücken [13]. Daher wird die Suche und Validierung nach wirksamen natürlichen Quellen von Antioxidantien zu einem Bereich des Bewusstseins. Die Einnahme pflanzlicher Antioxidantien wie Flavonoide, Carotinoide und Phenolverbindungen kann zu einem Schutz vor Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Katarakten und Krebs führen [14].
R. vicarious (Polygonaceae) ist in Bengali als „Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom“ bekannt [15]. Es wächst in den Wüsten- und Halbwüstengebieten Asiens, Australiens und Nordafrikas [16]. Es ist eine wenig untersuchte gefährdete Pflanze in Bangladesch. In Bangladesch verzehren die Menschen die ganze Pflanze als Gemüse, nachdem sie mit Salz, verschiedenen Gewürzen und Öl gekocht wurden. Manchmal verwenden die Leute nur die frischen Blätter in gemischten Salaten als Alternative zu Kopfsalat. Das rohe Blatt ist leicht sauer, wird aber nach dem Kochen stark sauer. Außerdem werden Fischgerichten während des Kochens normalerweise einige Blätter beigemischt, um einen leicht säuerlichen Geschmack zu erhalten.
Diese Pflanze wird weltweit als Gemüse- und Heilkraut verwendet [17]. Die Blätter und Samen werden als Gegenmittel für Schlangen- bzw. Skorpiongift verwendet [17]. In der Volksheilkunde wird R. vicarius seit langem zur Behandlung von Lebererkrankungen, schlechter Verdauung, Verstopfung, Hämorrhoiden, Erbrechen, Blähungen, Herzbeschwerden, Schmerzen, Milzerkrankungen, Dyspepsie, Zahnschmerzen, Bronchitis, Asthma, Krätze, Leucodermie und als A Abführmittel, Magenmittel, Vorspeise, Tonikum, Diuretikum und Analgetikum [18]. Diese Pflanze enthält zahlreiche biologisch wichtige Verbindungen, darunter Flavonoide, Anthrachinone, Carotinoide, Vitamine, Lipide und organische Säuren, die als Antioxidantien, antimikrobielle Mittel und Antikrebsmittel bekannt sind [19]. Jeder Teil dieser Pflanze enthält Quercetin (Flavonoide) in erhöhter Menge [15]. Diese Pflanze enthält 0,25 mg Vitamin A, 1,33 mg Vitamin C, 2,37 mg Vitamin E [15], 3,38 mg Flavonoide und 5,66 mg Polyphenole [20] pro 100 g Trockengewicht.
Shahat und Kollegen [21] zeigten in einem Rattenmodell anti-angiogenetische und anti-proliferative Wirkungen von Methanol (80 Prozent) Extrakt aus R. stellvertretendem Luftteil gegen hepatozelluläres Karzinom. Eine andere Studie zeigte in vitro ein anti-angiogenes Potenzial von R. vicarius-Extrakt [22]. Der Methanolextrakt des ganzen R. vicarius übt in vivo Schutz gegen Tetrachlorkohlenstoff-induzierte Hepatotoxizität aus [23]. Eine entzündungshemmende Wirkung bei Kaninchen wurde durch den methanolischen Blattextrakt von R. vicarius nachgewiesen [24]. Eine neuere Studie [25] berichtete in vivo über eine nephroprotektive Wirkung von fraktioniertem ethanolischem R. vicarius-Extrakt gegen Gentamicin- und Kaliumdichromat-Toxizität.
Unter Berücksichtigung der obigen Informationen wollten wir die Wirkung von R.-Ersatzextrakten (RVE) im Hinblick auf die Genesung von Cisplatin-induzierter Nephrotoxizität durch Aufrechterhaltung der NQO1-Genexpression in einem Tiermodell untersuchen.
cistanche Nutzen für die Gesundheit: Behandlung von Nierenerkrankungen
Materialen und Methoden
Chemikalien und Reagenzien
Cisplatin und 2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) wurden von SIGMA-ALDRICH (USA) erworben.
Creatinine Colorimetric Assay Kit (Produkt-ID – 700.460) wurde von Cayman Chemical (USA) erworben. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), fötales Rinderserum (FBS) und Antibiotikum (10,000 U/ml Penicillin und 10,000 ug/ml Streptomycin) wurden von Gibco (Gibco Laboratories, VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). ROS-Glo™ H2O2 Assay Kit und GoTaq® qPCR Master Mix wurden von Promega (USA) bezogen. Das Reverse-Transkriptions-Kit TIAN-Script M-MLV wurde von TIANGEN (China) und Primer von IDT (Integrated DNA Technologies, Malaysia) erworben. Alle anderen in diesem Experiment verwendeten Chemikalien und Reagenzien waren von analytischer Qualität.
Pflanzenprobenentnahme und Extraktaufbereitung
Frische R.-Ersatzpflanzen wurden von einem lokalen Markt in Sonadighi, Rajshahi, Bangladesch, gekauft. Das Pflanzenexemplar wurde von Dr. Ahmad Humayan Kabir, Abteilung für Botanik, Universität Rajshahi, Bangladesch, identifiziert und authentifiziert. Ein Exemplar unter Beleg-Nr. 00095 wurde im Herbarium der Abteilung für Botanik der Universität Rajshahi aufbewahrt. Die oberirdischen Teile der Pflanze wurden gereinigt, bei 37 Grad getrocknet, unter Verwendung eines elektronischen Trockners zu einem groben Pulver gemahlen und in einem verschlossenen Behälter bei 4 Grad gelagert. Das feine Pulver (10 g) wurde in Methanol (500 ml) gelöst. Der Inhalt wurde 10 min lang bei 20 kHz beschallt (Soniprep 150, China). Die Filtration des Extrakts wurde unter Verwendung von Glasfaserfilterpapier (Macherey NAGEL, GmbH, Deutsch) mit einem DURAN-Filtergerät (Deutsch) durchgeführt. Abschließend wurde das Filtrat mit einem Gefriertrockner (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, USA) aufkonzentriert. Der Extrakt wurde schließlich RVE genannt.
In-vitro-Antioxidans-Aktivitätstest
Die in-vitro-Antioxidanskapazität von RVE wurde basierend auf dem Abfangen von DPPH wie zuvor beschrieben [26] mit geringer Modifikation durchgeführt. Die DPPH-Radikalfängerfähigkeit von RVE wurde basierend auf der Umwandlung der violetten Farbe von DPPH in gelbe Farbe bewertet. Das Reaktionsgemisch in jedem Mikrozentrifugenröhrchen (2 ml) bestand aus 95 0 μl methanolischer Lösung von DPPH-Radikalen (0,1 mM) und 50 μl RVE aus fünf verschiedenen Konzentrationen (200, 500, 1000, 2000 und 4000 ug /mL Methanol), um Endkonzentrationen von 10, 25, 50, 100 und 200 ug/mL herzustellen. Als Kontrolle wurde ein weiteres Röhrchen mit 50 &mgr;l Methanol und 950 &mgr;l methanolischer DPPH-Lösung aufbewahrt. Die Reagenzgläser wurden für 30 min an einem dunklen Ort stehen gelassen. Die Extinktion der Mischungen wurde bei 517 nm unter Verwendung eines GENESYS 10S UV-VIS-Spektrophotometers (Thermo SCIENTIFIC, USA) gemessen. Schließlich wurde der Prozentsatz der Radikalfängeraktivität (RSA) basierend auf der Verfärbung von DPPH unter Verwendung der folgenden Formel Prozent RSA=[(ADPPH – ARVE)/ADPPH] × 100 berechnet, wobei ADPPH die Extinktion der DPPH-Lösung ist (Kontrolle) und ARVE ist die Extinktion der RVE-Lösung. Die Konzentration, bei der RVE zu 50 Prozent RSA führte, wurde als IC50-Wert bezeichnet und unter Verwendung eines Diagramms berechnet, in dem der Prozentsatz an RSA gegen verschiedene verwendete RVE-Konzentrationen aufgetragen wurde.
Versuchstiere und experimentelles Design
Männliche Schweizer Albino-Mäuse im Alter von 42 Tagen (30–32 g Körpergewicht) wurden vor Beginn des Experiments für 1 Woche in einem Raum (Temperatur von etwa 25 ± 2 Grad und ~ 50 Prozent Luftfeuchtigkeit, 12 h Dunkel-/Hell-Zyklus) akklimatisiert. Trinkwasser und Nahrung wurden ad libitum zur Verfügung gestellt.
Mäuse wurden zufällig in acht Gruppen (n {{0}}) aufgeteilt. Die erste (Kontroll-)Gruppe wurde mit 0,2 ml 0,9-prozentigem NaCl behandelt. Die nächsten vier Gruppen wurden mit Cisplatin bei 2,5 mg/kg für 5 Tage in einem Intervall von 24 Stunden behandelt. Nach der Verabreichung von Cisplatin wurde eine Gruppe (zweite Gruppe) ohne weitere Behandlung belassen und als gestresste Kontrollgruppe bestimmt. Die dritte, vierte und fünfte Gruppe wurden weiter mit RVE bei 25, 50 bzw. 100 mg/kg für 5 Tage behandelt. Weitere drei Gruppen wurden nur mit RVE bei 25, 50 bzw. 100 mg/kg für 5 Tage behandelt. Cisplatin und RVE wurden in destilliertem Wasser gelöst. Alle Behandlungen wurden intraperitoneal verabreicht. Nach 24 h letzter Behandlung wurden die Tiere nach zervikaler Dislokation eingeschläfert [25]. Dann wurde das Peritoneum mit einer Schere eröffnet, Blut wurde nach Herzpunktion entnommen und die Nieren wurden mit einer Pinzette entnommen. Blut wurde unterzogen, um den Kreatininspiegel im Serum zu überprüfen. Die Nieren wurden der Bewertung des Malondialdehydspiegels und der Genexpression unterzogen.
Messung von Serumkreatinin
Das Serumkreatinin wurde mit dem Creatinine Colorimetric Assay Kit-700,460 (Cayman Chemical, USA) gemäß dem mit dem Kit gelieferten Protokoll des Herstellers gemessen.
Messung der renalen Lipidperoxidation
Malondialdehyd (MDA) ist ein Endprodukt der Lipidperoxidation im Nierengewebe und wird üblicherweise als Indikator für die ROS-Produktion gemessen. Der MDA-Spiegel wurde jedoch gemäß einer früheren Studie im Nierengewebe gemessen [27]. Zunächst wurde das Nierengewebe in Natriumphosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) homogenisiert. Eine Reaktionslösung aus 0,8 % Thiobarbitursäure (1,5 ml), 8,1 % SDS (200 μl), 20 % (pH 3,5) Essigsäure (1,5 ml) und dH2O (600 μl) wurde auf 100 hinzugefügt μl homogenisiertes Gewebe, und die Mischung wurde dann bei 95 Grad für 1 h inkubiert. Nach dem Abkühlen wurden die Mischungen bei 10,000 g für 10 min bei 4 Grad zentrifugiert und die Extinktion des Überstands wurde bei 532 nm mit Standard 1, 1, 3, 3- Tetramethoxypropan gemessen. Die Menge an Gesamtprotein wurde unter Verwendung des Bradford Protein Assay Kits (BIO-RAD, USA) und durch Vergleich mit Standard-Rinderserumalbumin (BSA) gemessen. Die Intensität von Lipidperoxiden wurde als Nanomol (nM) MDA pro Milligramm (mg) Protein ausgedrückt.
Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (Echtzeit-PCR)
Echtzeit-PCR wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [28, 29]. Gesamt-RNA aus Nierengewebe wurde unter Verwendung von TRIzol®-Reagenz (Invitrogen) gemäß dem vom Hersteller gelieferten Protokoll isoliert. Die isolierte RNA (1 ug) wurde dann in cDNA umgewandelt. Zunächst wurden 2 μL zufälliges Hexamer (10 μM), 2 μL dNTPs (10 mM), 1 μL RNA und nukleasefreies HO bis zu 15 μL entnommen und für 5 min bei 70 Grad inkubiert. Die Mischung wurde sofort für 2 min auf Eis gestellt. Dann wurden 4 μL Erststrangpuffer (5x) und 1 μL M-MLV Reverse Transkriptase in jedes Röhrchen gegeben und für 10 min und 50 inkubiert
min bei 25 Grad bzw. 42 Grad. Schließlich wurde das M-MLV-Reverse-Transkriptase-Enzym durch Inkubieren der Mischung bei 95 Grad für 5 Minuten inaktiviert. Die synthetisierten cDNA-Produkte wurden einer Echtzeit-PCR zur Quantifizierung der NQO1-, p53- und Bcl-2-Genexpression unter Verwendung spezifischer Primer unterzogen (Tabelle 1). Jede Reaktion (10 μl) wurde dreifach durchgeführt, bestehend aus 5 μl GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, USA), 0,5 μl (10 mM) jedes Primers, 3 μl nukleasefreies Wasser und 1 μl cDNA in 48-Well-Reaktionsplatten. Thermozyklen wurden unter Verwendung einer Real-Time-PCR-Maschine (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, USA) mit den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 95 Grad für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 Grad für 30 s, 50 Grad für 30 s und 72 Grad für 25 s. Die Spezifität der PCR-Reaktionen wurde bestätigt, indem die Schmelzkurve bei 95 Grad für 15 s, 45 Grad für 15 s und 95 Grad für 15 s analysiert wurde. Die Spezifität der PCR-Reaktionen wurde bestätigt, indem die Schmelzkurve bei 95 Grad für 15 s, 45 Grad für 15 s und 95 Grad für 15 s analysiert wurde. Die relative Quantifizierung der Genexpression wurde unter Verwendung des endogenen GAPDH-Gens als Kontrolle basierend auf der ΔΔCq-Methode durchgeführt.
Zellkultur und Behandlung
Humane Epithelzelllinie des proximalen Tubulus der Niere, HK-2-Zellen, wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und Antibiotika (50 U/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin), in einem Inkubator mit 5 % CO2 und 95 % gehalten Prozent Luftfeuchtigkeit bei 37 Grad.
H2O2-Messassay
Der H2O2-Spiegel in HK-2-Zellen wurde unter Verwendung des ROS-Glo™ H2O2 Assay-Kits (Promega, USA) gemäß dem vom Kit-Hersteller bereitgestellten Protokoll geschätzt. HK-2-Zellen (1000 Zellen) in 70 ul DMEM wurden in Vertiefungen der 96--Well-Mikrotiterplatte gegeben. Nachdem die Anhaftung der Zellen an der Wandoberfläche ermöglicht wurde, wurden 10 &mgr;l DMEM aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatte durch 10 &mgr;l Cisplatin (25 &mgr;M in DMEM) ersetzt und für 12 h in einem Inkubator aufbewahrt. Dann wurden 10 &mgr;l RVE zugegeben, um Endkonzentrationen von 125, 250 und 500 &mgr;g/ml in DMEM herzustellen, und für weitere 12 h inkubiert. Danach wurden 20 μl H2O2-Substratlösung und 100 μl ROS-Glo™-Nachweislösung in jede Vertiefung gegeben. Die Reaktion wurde 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde die Lumineszenz unter Verwendung von GloMax Luminometer (Promega, USA) gemessen.
GC-MS-Analyse
Die GC-MS-Analyse von RVE (gelöst in Methanol) wurde wie zuvor beschrieben [30] unter Verwendung von GCMS-QP2020 (SHIMADZU) durchgeführt, das einen Autosampler (AOC{ {5}}s), ein Autoinjektor (AOC-20i) und ein Gaschromatograph (GC-2010 Plus), der an ein Massenspektrometer angeschlossen ist, das mit einem SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Sil-MS-Kapillarsäule (30 m × 0,25 μm ID × 0,25 μm DF). Das Trägergas Helium wurde auf einer konstanten Flussrate von 1,72 ml/min gehalten und einem Injektionsvolumen von 5 μl mit einem Splitverhältnis von 10:1 unterzogen. Die Temperatur des Injektors wurde bei 220 Grad gehalten, die Ionenquellentemperatur war 280 Grad, die Ofentemperatur wurde von 80 Grad (Halten für 2 min) mit einem Anstieg von 5 Grad/min auf 150 Grad (Haltezeit 5,0 min), dann 5 Grad/min auf 280 Grad und endet mit einer 8-minütigen Isotherme bei 280 Grad. Massenspektren wurden bei 1,5 kV mit einem Scan-Intervall von 0,5 s aufgenommen und die Probe wurde in einem Bereich von 45–350 m/z gefahren. Die Lösungsmittelverzögerung betrug 0 bis 3 min, und die gesamte GC-MS-Laufzeit betrug 55 min. Die relative Konzentration der detektierten Verbindungen wurde gemessen, indem ihre durchschnittliche Peakfläche mit der Gesamtfläche verglichen wurde. Die Interpretation des Massenspektrums in GC-MS wurde unter Verwendung der Datenbanken des National Institute Standard and Technology (NIST), einschließlich NIST08, NIST08s und NIST14, durchgeführt.
statistische Analyse
Die statistischen Analysen wurden durch ANOVA nach dem Dunnett-T3-Test unter Verwendung der IBM SPPS-Software (Version 20) durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Der signifikante Vergleich wurde auf p<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
Ergebnisse
In-vitro-Antioxidans-Aktivitätstest
Obwohl zuvor berichtet wurde, dass RVE eine antioxidative Aktivität aufweist, haben wir die antioxidative Aktivität unseres Extrakts erneut überprüft, indem wir die DPPH-Kapazität zum Abfangen freier Radikale verwendet haben. RVE neutralisierte DPPH dosisabhängig (Abb. 1). RVE zeigte in vitro eine beträchtliche antioxidative Aktivität und der berechnete IC50-Wert von RVE betrug 37,39 ± 1,89 ug/ml.
Messung von Serumkreatinin
Der Serumkreatininspiegel bei Mäusen war nach der Verabreichung von Cisplatin signifikant (p < {{0}},05)="" erhöht="" (tabelle="" 2).="" die="" behandlung="" mit="" rve="" verbesserte="" den="" kreatininspiegel="" bemerkenswert="" (p="">< 0,05)="" dosisabhängig="" (tabelle="">
Messung der renalen Lipidperoxidation
Im Vergleich zur Kontrolle erhöhte Cisplatin den MDA-Gehalt im Nierengewebe von Mäusen erheblich (p < {{0}},05)="" (tabelle="" 3).="" im="" gegensatz="" dazu="" stellte="" die="" rve-behandlung="" den="" mda="" in="" dosisabhängiger="" weise="" deutlich="" (p="">< 0,05)="" auf="" fast="" den="" normalwert="" wieder="" her="" (tabelle="">
Echtzeit-PCR
Cisplatin verringerte signifikant (p < {{0}}.05)="" die="" nqo1-mrna-expression="" um="" das="" 0,15--fache="" und="" erhöhte="" p53-="" und="" bcl-2-mrna="" ausdruck="" um="" das="" 24-="" bzw.="" 4,2--fache="" (abb.="" 2).="" rve="" verringerte="" die="" mrna-expression="" von="" nqo1,="" p53="" und="" bcl-2="" dosisabhängig="" erheblich="" (p="">< 0.05)="" (abb.="" 2).="" verglichen="" mit="" der="" einzigen="" mit="" cisplatin="" behandelten="" gruppe="" war="" die="" nqo1-mrna-expression="" um="" das="" 3,57-,="" 6,36-="" und="" 9,28--fache="" bei="" 25,="" 50="" und="" 100="" erhöht.="" mg/kg="" rve="" (abb.="" 2a).="" wiederum="" war="" die="" p53-mrna-expression="" um="" das="" 0-0,63-,="" 0,46-="" und="" 0,21--fache="" bei="" 25,="" 50="" bzw.="" 100="" mg/kg="" rve="" verringert="" (fig.="" 2b).="" die="" bcl-2-mrna-expression="" wurde="" ebenfalls="" um="" das="" 0,71-,="" 0,40-="" und="" 0,32--fache="" bei="" 25,="" 50="" bzw.="" 100="" mg/kg="" rve="" verringert="" (fig.="" 2c).="" es="" wurden="" jedoch="" keine="" signifikanten="" (p=""> 0,05) Veränderungen im Expressionsniveau der NQO1-, p53- und Bcl-2-Gene aufgrund der Behandlung mit RVE gefunden (Abb. 3).
H2O2Messassay
Im H2O2-Messassay wird der H2O2wurde als proportional zur Lumineszenz angesehen. Die Verabreichung von Cisplatin erhöhte den H2O2-Spiegel signifikant (p < {{0}}.05)="" um="" das="" 2,2--fache="" (abb.="" 4).="" die="" behandlung="" mit="" rve="" senkte="" den="" h2o2-spiegel="" erheblich="" (p="">< 0.05)="" um="" das="" 0,25-,="" 0,38-="" und="" 0,49--fache="" bei="" 125,="" 250="" und="" 500="" ug/ml="">
GC-MS-Analyse
Insgesamt 10 Verbindungen (Tabelle 4 und Abb. 5), darunter „Isoborneol, pentamethyldisilanyl ether (sesquiterpene Alcohol)“, „Thymine (pyrimidin nucleobase)“, „4H-Py- ran-4-one, 2,{{ 8}}dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl- (saponin)", "Hexadecansäure, Methylester (Fettsäuremethylester)", "9,12- Octadecadiensäure, Methylester (Fettsäuremethylester)“, „9-Octadecensäure (Z)-, Methylester (Fettsäuremethylester)“, „Methylstearat (Fettsäuremethylester)“, „Diisooctylphthalat (Ester)", "13-Docosenamid, (Z)-(Alkaloid)" und "Squalen (Triterpen)" wurden in RVE nachgewiesen.
cistanche tubolosa Vorteile: Senkung der Blutfette
Diskussion
Natürliche und synthetische Antioxidantien wurden umfassend untersucht und erwiesen sich als funktionell entweder zur Vorbeugung oder Verbesserung der Toxizität in der Tierphysiologie [31]. Nahrungsergänzungsmittel mit Antioxidantien sind die Komponenten, die entweder durch chemische Synthese oder durch Extraktion aus natürlichen Lebensmitteln entwickelt wurden, aber diese sind in ihrer Zusammensetzung nicht identisch mit Antioxidantien, die in Lebensmitteln verfügbar sind [5]. Daher gehen die Meinungen im Laufe der Zeit auseinander, ob synthetische Antioxidantien ähnliche gesundheitliche Vorteile bringen wie natürliche Antioxidantien [32]. Es besteht der Drang, die Verwendung synthetischer Antioxidantienzusätze zu verringern und nach alternativen, billigen, erneuerbaren, natürlichen und möglicherweise sichereren Quellen für wirksame natürliche Antioxidantien zu suchen.
Einer der wichtigsten Mechanismen ist der nukleare Faktor Erythroid-2 Related Factor-2 (Nrf2)-Weg, der Zellen im Allgemeinen vor oxidativem Stress schützt, der durch exogene oder endogene Stressoren induziert wird [27]. Die wirksamen Antioxidantien induzieren die Expression von Nrf2, das sich weiter in den Zellkern bewegt und an das Antioxidans-Response-Element (ARE) bindet, das die Expression des entgiftenden und antioxidativen Phase-II-Gens NQO1 provoziert [33, 34]. NQO1 wird breit und unterschiedlich auf gewebespezifische Weise exprimiert. NQO1 ist ein zytosolisches antioxidatives Flavoprotein, das die 2--Elektronenreduktion von Chinonen zu Hydrochinonen katalysiert, was zu einer Entgiftung der Elektrophilen und der Vorwegnahme des Redox-Zyklus führt [35]. Gemäß einer früheren Studie [36] aktiviert -Lapachon NQO1, was den intrazellulären NAD+-Spiegel weiter erhöht und die Niere vor Cisplatin-induzierter akuter Schädigung schützt.
Es ist bekannt, dass Cisplatin Schäden in der glomerulären Filtrationsmembran durch oxidativen Stress, Entzündung und Apoptose verursacht, was insgesamt zu einer verringerten glomerulären Filtrationsrate und einem Verlust der normalen Membranpermeabilität führt [37]. Daher war der Serumkreatininspiegel erhöht. Serumkreatinin ist einer der potenziellen Marker für die Nierenfunktion. Die Behandlung mit Cisplatin erhöhte den MDA-Gehalt im Nierengewebe, das ein Sekundärprodukt der Lipidperoxidation ist, und dieser Bericht stimmt mit früheren Studien überein [27, 35, 37, 38]. Die Behandlung mit RVE reduzierte den MDA-Gehalt im Nierengewebe signifikant. Gleichzeitig war auch der Kreatininspiegel verringert, was auf die verbessernde Wirkung von RVE hinweist.
Außerdem war die NQO1-Expression signifikant verringert und die p53- und Bcl-2-Expression waren signifikant erhöht, nachdem sie Cisplatin ausgesetzt waren. In Bezug auf die NQO1- und p53-Expression in vivo stimmt unser Ergebnis mit einer früheren Studie überein [13]. Eine neuere Studie [39] zeigte, dass Cisplatin die Expression von Bcl-2 in der Niere von Mäusen signifikant verringerte, aber überraschenderweise fanden wir eine erhöhte Expression. Dieser Unterschied kann das Ergebnis eines Dosisunterschieds sein [40], da Mohamed und Kollegen [39] 8 mg/kg für 12 Tage verwendeten, während wir 2,5 mg/kg für nur 5 Tage verwendeten. Eine andere Studie [41] gab an, dass Cisplatin die Expression von Bcl-2 in einer Dosis erhöhen kann, in der es nicht zytotoxisch ist. Auch hier sensibilisiert eine erhöhte Bcl-2-Expression die Zellen gegenüber oxidativem Stress [40].
Die Expression von p53 ist jedoch unter normalen physiologischen Bedingungen niedrig, es wird jedoch erwartet, dass sie hochreguliert wird, sobald sie mit Cisplatin behandelt wird, da dieses platinbasierte Chemotherapeutikum den p53-abhängigen apoptotischen Weg aktiviert. Sobald wir Mäuse mit Cisplatin behandelten, war p53 in den Mäusenieren im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht. Ein weiteres Proto-Onkogen Bcl-2 korreliert ebenfalls mit dem NQO1-Expressionsniveau. Indem wir die p53-Expression nachahmten, stellten wir auch fest, dass die Bcl- 2-Spiegel bei der Behandlung mit Cisplatin erhöht waren, sich aber bei der Behandlung mit RVE signifikant erholten. Dies ist möglich, als Reaktion auf oxidativen Stress wird das p53-Gen aktiviert und führt zum Anhalten des Zellzyklus, zur Seneszenz oder zur Apoptose [6]. Bei der Entgiftung wird oft angenommen, dass die NQO1-Überexpression mit der Apoptose in Krebszellen korreliert [10], obwohl der zugrunde liegende Mechanismus der Apoptose und der Überexpression von NQO1 immer noch umstritten ist. Darüber hinaus verringert die NQO1-Überexpression beim hepatozellulären Karzinom die Bcl-2-Expression [10]. Das Proto-Onkogen Bcl- 2 hat auch p53 wie die Korrelation mit der NQO1-Expression. p53 ist ein sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor, der durch zahlreiche Arten von zellulärem Stress aktiviert wird [42], während eine Bcl-2-Überexpression als mitochondrialer Porenstabilisator wirkte, um die Cytochrom-c-Freisetzung bei oxidativem Stress zu erleichtern [12]. In unserem Fall haben wir beide Genantworten mit Cisplatin-Behandlung in normalem Nierengewebe überprüft und ihre verstärkte Expression festgestellt. Die RVE-Behandlung führte die Expression von p53 und Bcl-2 dosisabhängig auf nahezu normale Werte zurück. Diese Art der Aufhebung der Bcl-2-Expression wurde auch unter Verwendung des ROS-Scavengers Trolox gezeigt [43]. Darüber hinaus war der H2O2-Spiegel auch in HK-2-Zellen durch die Behandlung mit Cisplatin in vitro deutlich erhöht. Nach der Behandlung mit RVE wurde der H2O2-Spiegel signifikant auf etwa den Normalwert wiederhergestellt. Dies ist möglicherweise auf die Wirkung der RVE-Behandlung zurückzuführen, die die NQO1-Expression erhöht [44], die einen Schutz gegen oxidativen Stress ausübt [6].
Das GC-MS-Chromatogramm bestätigte die Existenz von zehn Verbindungen in RVE. Darunter "4H-Pyran- 4-one, 2, 3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-", "Hexadecanoic acid" und " Squalen“ sind bekannte Antioxidantien[45–47]. Diese drei Verbindungen übten zusammen möglicherweise eine synergistische nephroprotektive Wirkung aus. Frühere Studien berichteten auch über die Induktion der NQO1-Expression durch Vitamin A [48], Vitamin C [49], Vitamin E [50], Flavonoide [51] und Polyphenole [50]. Daher schlägt dieser Bericht vor, aufzuklären, ob dieser spezielle Extrakt Vitamin A, Vitamin C, Vitamin E, Flavonoide und Polyphenol enthält oder nicht.
Fazit
Der Gesamtbefund legt nahe, dass RVE beim Schutz der Nieren vor Cisplatin-induzierten Schäden physiologisch wirksam ist. Daher ist es entscheidend, die genauen Verbindungen aufzuklären, die für die Milderung der durch Cisplatin induzierten Nephrotoxizität verantwortlich sind, was für die Anwendung beim Menschen von Vorteil sein könnte.
Danksagungen
Die Autoren danken dem Bangladesh Council of Scientific and Industrial Research (BCSIR), Rajshahi Branch, für die Bereitstellung von Laborunterstützung bei der Quantifizierung von RNA.
Autorenbeiträge
MMH führte experimentelles Design, Experimente, Datenanalyse und -vorbereitung, Schreiben und Bearbeiten von Manuskripten, Überarbeiten und Entwerfen von Manuskripten durch; MST & MME haben Experimente und Datenanalysen durchgeführt; AME & MAR trugen zur Überwachung und Ressourcen bei; AH war verantwortlich für Konzeptualisierung, Supervision, Ressourcen und Manuskriptredaktion. Alle Autoren
überprüfte das Manuskript. Die Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.
Finanzierung
Die aktuelle Arbeit wurde von der Taif University Researchers Supporting Project Number (TURSP - 2020/75), Taif University, Taif, Saudi-Arabien, finanziert.
Verfügbarkeit von Daten und Materialien.
Alle relevanten Daten sind verfügbar und können auf Anfrage an den korrespondierenden Autor übermittelt werden.
Erklärungen
Ethik-Zustimmung und Zustimmung zur Teilnahme
Die Ethik zur Durchführung dieses Experiments wurde vom Institutional Animal, Medical Ethics, Biosafety, and Biosecurity Committee (IAMEBBC), Institute of Biological Sciences (IBSc), University of Rajshahi genehmigt und unter der Memo-Nummer 31/{{1} bereitgestellt. }IAMEBBC/IBSc. Alle Methoden wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften der oben genannten Ethikkommission durchgeführt. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien von ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) durchgeführt. „Zustimmung zur Teilnahme“ gilt nicht für diese Studie.
Angaben zum Autor
1Labor für Molekularbiologie und Proteinwissenschaft, Abteilung für Gentechnik und Biotechnologie, Fakultät für Lebens- und Geowissenschaften, Universität Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesch. 2Labor für Molekularpathologie, Institut für Biologische Wissenschaften, Universität Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesch. 3Department of Biotechnology, College of Science, Taif University, PO Box 11099, Taif 21944, Saudi-Arabien. 4Department of Genetics, Faculty of Agriculture, Alexandria University, Alexandria 21545, Ägypten.
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