ROS-modulierende Wirkungen von Polyphenolen der Preiselbeere (Vaccinium Vitis-idaea L.) auf fettleibige Adipozytenhypertrophie und vaskuläre endotheliale Dysfunktion Teil 1

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Abstrakt:Oxidativer Stress und dysregulierte Adipozytokinsekretion, die mit hypertrophiertem Fettgewebe einhergeht, induzieren eine chronische Entzündung, die zu einer vaskulären endothelialen Dysfunktion führt. Die vorliegende Studie untersuchte die Fähigkeit von Anthocyanin (ACN)- und Nicht-Anthocyanin-Polyphenol (PP)-Fraktionen aus Preiselbeerfrüchten, Fettgewebehypertrophie und endotheliale Dysfunktion unter Verwendung von 3T3-L1-Adipozyten und humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) zu mildern. Diese Studie zeigte, dass die PP-Fraktion die intrazelluläre ROS-Erzeugung in hypertrophierten Adipozyten verringerte, indem sie die antioxidative Enzymexpression (SOD2) verstärkte und die oxidative Enzymexpression (NOX4, iNOS) hemmte. Darüber hinaus reduzierten PP- und ACN-Fraktionen den Triglyceridgehalt in Adipozyten, begleitet von einer Herunterregulierung der Expression lipogener Gene wie aP2, FAS und DAGT1. Die Behandlung mit beiden Fraktionen modulierte die mRNA-Expression und Proteinsekretion von Schlüssel-Adipokinen in hypertrophierten Adipozyten. Expression und Sekretion von Leptin und Adiponektin wurden jeweils herunter- und hochreguliert. Darüber hinaus linderten PP- und ACN-Fraktionen die Entzündungsreaktion in TNF- --induzierten HUVECs, indem sie die Expression entzündungsfördernder Gene (IL-6, IL-1) und Adhäsionsmoleküle (VCAM{{ 14}}, ICAM-1, SELE). Die erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Verzehr von polyphenolreichen Preiselbeerfrüchten aufgrund ihrer antioxidativen und entzündungshemmenden Wirkung zur Vorbeugung und Behandlung von Fettleibigkeit und endothelialer Dysfunktion beitragen kann.

Schlüsselwörter:Polyphenole; Anthocyane;Preiselbeere; antioxidatives Potenzial; Anti-Fettleibigkeit; Antiphlogistikum;cistanche tubulosa-Extrakt;3T3-Ll Adipozyten; Hypertrophie;Adipokine; endotheliale Dysfunktion

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1. Einleitung

Adipositas ist ein unabhängiger Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und eine der Hauptursachen für das erhöhte Risiko von Dyslipidämie, Insulinresistenz, Bluthochdruck und Atherosklerose sowohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern [1]. Bei Adipositas wird weißes Fettgewebe (WAT) durch übermäßige Fettansammlung in hypertrophierten Adipozyten dysfunktional, was zu chronischen Entzündungen, oxidativem Stress und dysregulierter Adipokinsekretion führt, die zu Typ-2-Diabetes mellitus beiträgt und auch unabhängig mit koronarer endothelialer Dysfunktion assoziiert ist [2 ,3]. Hypertrophe Adipozyten sind der wesentliche Faktor, der eine positive Energiebilanz, Diabetes und kardiometabolische Erkrankungen verbindet [2]. WAT wirkt als endokrines Organ und vermittelt über sezernierte Adipokine und Zytokine die Wechselwirkung zwischen viszeralem oder subkutanem WAT und kardiovaskulärem Gewebe.cistanche tubulosa redditAdipokine wie Leptin, Adiponektin und Resistin, Zytokine, TNF- , IL-1 , IL-6, IL-8 und MCP-1 sowie reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies ( ROS und RNS) beeinflussen die Entwicklung der endothelialen Dysfunktion durch direkte und indirekte Mechanismen [4]. Darüber hinaus fördert perivaskuläres Fettgewebe (PVAT), hauptsächlich von adipösen Personen, lokale Entzündungen und eine Beeinträchtigung der Endothelfunktion.

PVAT trägt zur vaskulären Homöostase bei, indem es vasoaktive Verbindungen wie Adipokine, ROS und Stickoxid (NO) produziert. Durch die Sekretion eines breiten Spektrums bioaktiver Moleküle beeinflusst PVAT die Kontraktion, Proliferation und Migration der glatten Gefäßmuskelzellen [4].

Cistanche kann die Immunität verbessern

Die Endothelzellen, die die Innenwand des Gefäßsystems auskleiden, regulieren homöostatische Funktionen, und ihre Dysfunktion ist ein früher Indikator für Atherosklerose und kardiovaskuläre Erkrankungen [5]. Oxidativer Stress trägt zur Aktivierung von Endothelzellen bei und bereitet sie auf Adhäsion, Infiltration und Aktivierung von Immunzellen vor, was zu einem geringgradigen Entzündungsphänotyp im Gefäßsystem führt [5,6]. ROS können die Endothel-abhängige vaskuläre Entspannung durch verstärkten Abbau von NO verändern [6]. Eine endotheliale Dysfunktion kann rückgängig gemacht werden, was das Fortschreiten der Arteriosklerose verzögern oder sogar verhindern und die arterielle Funktion verbessern und das Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse verringern könnte [5]. Jüngste klinische Studien haben gezeigt, dass nicht-pharmakologische und pharmakologische Therapien, die auf Fettleibigkeit und Insulinresistenz abzielen, die Endothelfunktion verbessern und niedriggradige Entzündungen reduzieren [7]. Diese Ergebnisse haben den Zusammenhang zwischen Fettleibigkeit, Insulinresistenz und endothelialer Dysfunktion gezeigt; Daher sollte die Verringerung der pathologischen Adipozytenfunktion bei Adipositas das Ziel der Prävention von Herz-Kreislauf-Erkrankungen sein. Therapeutische und ernährungsphysiologische Strategien, die oxidativen Stress und Entzündungen in hypertrophiertem Fettgewebe verringern, können ein wichtiges Ziel zur Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen werden [7].

Beeren sind reich an Polyphenolen, wie Flavonolen, Phenolsäuren und Anthocyanen, und epidemiologische Studien haben einen Zusammenhang zwischen einem Anstieg des Verzehrs von Beerenfrüchten mit einem Rückgang von Fettleibigkeit und Herz-Kreislauf-Erkrankungen berichtet ]8]. Beerenfrüchte sind als natürliche Antioxidantien bekannt und werden aufgrund ihres hohen antioxidativen Potenzials immer häufiger als natürliche funktionelle Lebensmittel bezeichnet [9]. Preiselbeeren gelten als „Superfruits“ und sind besonders reich an Antioxidantien wie den Vitaminen C, A und E (Tocopherol) und Polyphenolen [10]. In-vitro- und in-vivo-Studien haben verschiedene gesundheitsfördernde Wirkungen von Preiselbeeren gezeigt, wie z. B. entzündungshemmende [11], antioxidative [11] und antiproliferative Aktivitäten [8,9]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Preiselbeeren ernährungsbedingte Fettleibigkeit und leichte Entzündungen bei diabetischen Tieren verhindern [12]. Unsere vorherige Studie zeigte das entzündungshemmende Potenzial von wässrigem Extrakt aus gefriergetrockneten Preiselbeerfrüchten[11]. Der Extrakt regulierte die entzündungsfördernde (IL-6, MCP-1 und IL-1) und entzündungshemmende (IL-10) Genexpression in entzündetem TNF{{20} }induzierte 3T3-L1-Adipozyten und unterdrückte die Entzündungsreaktion in aktivierten RAW 264.7-Makrophagen durch Herunterregulieren der Expression proinflammatorischer Mediatoren (TNF-, IL-1, IL-6, MCP{{30 }}, iNOS, COX-2). Darüber hinaus wurden bei entzündeten Adipozyten, die mit dem Preiselbeerfruchtextrakt behandelt wurden, signifikante antioxidative Wirkungen beobachtet. Die intrazelluläre ROS-Akkumulation nahm infolge der verstärkten Expression antioxidativer Abwehrenzyme (SOD, Katalase, GPx) und des gehemmten prooxidativen Enzyms (NADPH-Oxidase 4) ab [11].

Die vorliegende Studie untersuchte die Fähigkeit der Preiselbeerfrucht-Anthocyanin(ACN)-Fraktion und der Nicht-Anthocyanin-Polyphenol (PP)-Fraktion, hypertrophe Fettleibigkeit und endotheliale Dysfunktion zu verhindern und zu behandeln, die in den In-vitro-Modellen nachgeahmt wurden. Die Wirkung von ACN- und PP-Fraktionen auf die molekularen Signalwege bei oxidativem Stress, Entzündungen und fehlregulierter Adipokinsekretion wurde in fettleibigen hypertrophierten 3T3-L1-Adipozyten analysiert. Das Schutzpotenzial gegen endotheliale Dysfunktion wurde unter Verwendung von TNF-x-induzierten humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) bewertet.

2. Materialien und Methoden

2.1. Herstellung von Anthocyanin- und Nicht-Anthocyanin-Polyphenolfraktionen

Die von der Firma DANEX (PHU"DANEX", Wielen, Polen) erhaltene gefrorene Preiselbeere (Vaccinium Vitis-idea L.) wurde zu Fruchtmark homogenisiert, das anschließend bei -80 Grad eingefroren und einer Gefriertrocknung unterzogen wurde nach dem zuvor beschriebenen Verfahren[11]. Das Fruchtpulver wurde in einer wässrigen Lösung von 0,75 Prozent (v/v) Essigsäure suspendiert. Das Verhältnis von Feststoff (g) und Extraktionsmittel (ml) betrug 1:10. Nach dem Mischen in einem Vortex-Mischer für 30 Sekunden wurde die Suspension in ein Schallbad gegeben (5 min, 20 Grad). Wiederum wurde die Extraktionsmischung in einem Wirbelmischer für 30 Sekunden gerührt und bei 20 Grad stehen gelassen.

Nach 10 Minuten wurde die Probe bei 3600 × g (10 Minuten, 20 Grad) zentrifugiert und der erhaltene Überstand wurde gesammelt. Das frische Extraktionsmittel wurde in die verbleibenden Feststoffe gegossen, um die zweite Extraktionsstufe zu starten. Der Ablauf der zweiten Stufe war derselbe wie der erste. Die Extrakte beider Stufen wurden vereinigt und bei 12,000×g zentrifugiert, um winzige Fruchtrückstände zu entfernen.

Im nächsten Schritt der Fraktionsvorbereitung wurde die Entfernung von Zuckern und organischen Säuren aus dem Extrakt durchgeführt. Die Trennung wurde mit dem Chromatographiesystem AKTA Explorer 100 Air (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) durchgeführt, das mit einer XK 26/20-Glassäule (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) ausgestattet war ). Die Säule wurde mit 40 ml makroporösem Adsorptionsharz Amberlite XAD-7 HP (DuPont, Wilmington, DE, USA) gefüllt. Vor dem Aufbringen auf die Säule wurde die Lösung (50 ml des in der Extraktionsstufe erhaltenen Extrakts) unter Verwendung eines Spritzenfilters mit einer Porengröße von 0,45- um (Millex-HV Durapore PVDF) einer Membran mit Glasfaservorfilter (Merck Millipore, Burlington, MA, USA). Es wurden drei Elutionsmittel verwendet: A – 5 Prozent (v/o) Ameisensäure, B – Methanol und C – 0,1 Prozent (u/o) Ameisensäure. Die Ameisensäurelösungen wurden durch Mischen einer geeigneten Menge Ameisensäure mit deionisiertem Wasser hergestellt. Die Fließgeschwindigkeit des Elutionsmittels wurde auf 5 ml/min eingestellt. Während der Trennung wurde das folgende chromatographische Programm verwendet: Säulenäquilibrierung: 95 Prozent A, 5 Prozent B, 3 CV (Säulenvolumen); Probeninjektion -50 ml des Extrakts; Waschen ungebundener Substanzen-1:100 % C,6 CV;Waschen ungebundener Substanzen-2:100 % A,1 CV;Elution:20 % A,80 % B,5 CV;Säulenwäsche: 100 % B, 2,5 CV.

Der gesamte Ablauf der Elutionsstufe, der die Extinktion (überwacht bei λ{{0}}, 320 und 520 nm) zeigte, wurde bei 30 Grad unter Verwendung eines Rotationsverdampfers (Laborota 4003 HB control, Heidolph, Deutschland).Die Feststoffe wurden in einer wässrigen Lösung von 0,75 Prozent (o/o) Essigsäuregelöst.Die Lösung wurde in Glasfläschchen überführt und bei -85 Grad eingefrorenund dann in einen Gefriertrockner Beta {{8 }} (Martin Christ, Deutschland). Die Gefriertrocknung erfolgte für 48 h. Die eigentliche Trocknung erfolgte unter einem Druck von 10 Pa für 40 h (20 h bei einer Regaltemperatur von -15 Grad und 20 h bei 15 Grad).Die Endtrocknung erfolgte bei einer Temperatur von 22 Grad für 8 h ohne Druckkontrolle.Feste Präparate wurden in hermetisch verschlossenen Fläschchen unter Stickstoffatmosphärebei -85 C gelagert.

Der Feststoffgehalt des Fläschchens wurde in der wässrigen Lösung von 5 % (o/o) Ameisensäure gelöst und unter Verwendung eines 0.45- μm Porengrößenfilters (Merck Millipore) filtriert. Die Trennung der Anthocyane von den anderen Polyphenolverbindungen in den Proben wurde unter Verwendung eines AKTA Explorer 100 Air Chromatographen durchgeführt, der mit einem UV/VIS-Detektor und einer Agilent Zorbax SB C18-Säule (250 × 21,2 mm) ausgestattet war. Die Trennung wurde bei 20 Grad durchgeführt. Die Fließgeschwindigkeit der flüssigen Phase betrug 21 ml/min. Zwei Eluenten wurden verwendet: A -5 Prozent (v/v) Ameisensäure in Wasser und B-Methanol. Nach der Säulenäquilibrierung (95 Prozent A, 5 Prozent B, 3 CV) und Probeninjektion im Volumen von 2 ml wurde die Trennung in einem komplexen Gradienten durchgeführt. Das Verlaufsprogramm war wie folgt: 5 Prozent B-0,5 CV; 20 Prozent B-2 CV; 20 Prozent B-1,2 CV; 30 Prozent B-3. 5 CV;30 Prozent B-1.2CV;45 Prozent B-3.5 CV;45 Prozent B-1.2CV;100 Prozent B-2.5 CV;100 Prozent B-2,5 CV. Der Ausfluss mit einer Absorption bei λ=520 nm wurde gesammelt und als Anthocyanin-（ACN）-Fraktion bezeichnet. Der Abfluss, der eine Absorption bei 入=320 nm zeigte, wurde ebenfalls gesammelt und als Nicht-Anthocyanin-Polyphenolfraktion (PP) bezeichnet. Beide Fraktionen wurden eingedampft, in einer wässrigen Essigsäurelösung gelöst, gefriergetrocknet und wie oben beschrieben gelagert. Alle zur Herstellung der ACN- und PP-Fraktionen verwendeten Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich (Merck Group, Poznan, Polen) bezogen.

2.2.Identifizierung und Quantifizierung von Polyphenolen in ACN- und PP-Fraktionen

Die Polyphenolzusammensetzung von ACN- und PP-Fraktionen wurde durch das HPLC-DAD-ESI-MS-Verfahren auf einem HPLC-System der Serie Agilent 1200 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA) analysiert, das mit einem G1315D-Photodioden-Array-Detektor ausgestattet und online gekoppelt war mit einem Flugzeit-MS-System Agilent 6224. Chromatographische Trennungen wurden auf einer 150 × 2,1 mm, 3- μm C18-Säule (Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen, Schottland) durchgeführt. Eine zuvor veröffentlichte Studie beschreibt die Trennbedingungen (mobile Phase, Gradientenelutionsprogramm, Flussrate, Probeninjektionsvolumen) [11].

Die HPLC-Chromatogramme wurden bei 280,325,355 und 520 nm aufgenommen, empfohlen zum Nachweis von Flavan-3-olen, Hydroxyzimtsäurederivaten, Flavonolen bzw. Anthocyanen.

Polyphenolverbindungen in ACN- und PP-Fraktionen wurden als Äquivalente von Cyanidin-3-O-Glucosid (Anthocyanine), Catechin ((Epi)catechin und Procyanidine), 4-Hydroxybenzoesäure (Hydroxybenzoesäurederivate), Ferulasäure quantifiziert (Ferulasäurederivat), Chlorogensäure (3-O-Caffeoylchinasäure), p-Cumarsäure (Cumarsäurederivat), Trihydroxybenzoesäure-Gallussäure (Benzoesäure- und Arbutinderivate) und Quercetin (Quercetin-Glykoside) . Alle Proben wurden dreifach aus unabhängig hergestellten Lösungen von ACN- und PP-Fraktionen injiziert.

Nach Passieren des DAD-Detektors wurde das Säuleneluat zum MS-System geleitet, das mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) ausgestattet war, die im Positiv-Ionen- und Negativ-Ionen-Modus betrieben wurde. Ein zuvor veröffentlichter Artikel stellt ESI-MS-Parameter vor, die zur Identifizierung von Phenolverbindungen in ACN- und PP-Fraktionen verwendet werden [11]. Gerätesteuerung, Datenerfassung und Analyse wurden mit der Software MassHunter B.04.00 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA) erreicht. Sigma-Aldrich lieferte phenolische Standards und andere Reagenzien für die HPLC/DAD/MS-Analyse.

2.3. 3T3-L1 Adipozytenkultur und Behandlung

Maus-Präadipozyten-3T3-L1-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, CL-173) erhalten. Die Zellen wurden bei 37 Grad unter 5 Prozent CO kultiviert, die Atmosphäre in Dulbecco's modifiziertem Adlermedium (DMEM) (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen) mit 1 0 Prozent (o/o) fötalem Rinderserum (FBS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific Polska, Warschau, Polen)Ergänzung. 3T3-L1-Präadipozyten wurden dem Differenzierungsprozess nach dem zuvor beschriebenen Protokoll unterzogen [11]. Präadipozyten wurden mit einer Dichte von 2,5 × 104 Zellen/cm² in Platten mit 12- Vertiefungen ausgesät und kultiviert, bis sie Konfluenz erreichten. Dann wurden sie 2 Tage lang mit einem Differenzierungsgemisch stimuliert, das 0,25 μM Dexamethason (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen), 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen) enthielt. und 1 μM Insulin (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen) in DMEM mit 10 Prozent FBS. Das Medium wurde durch DMEM ersetzt, das mit 10 Prozent FBS und 1 &mgr;M Insulin ergänzt war. Nach 2 Tagen wurde das Kulturmedium durch DMEM mit 10 % FBS-Zusatz ersetzt und in Intervallen von 2- Tagen bis zur Analyse am Tag 12.3T3- aufgefrischt. L1-Adipozyten wurden für 24 h mit ACN- und PP-Fraktionen behandelt Konzentrationen von 5, 10 und 20 ug/ml.

2.4. HUVEC Kultur und Behandlung

Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) wurden von ATCC (CRL{{0}}) erhalten. HUVECs wurden in F-12K-Medium (ATCC) kultiviert, das mit 10 % FBS (Gibco), Endothelzellen-Wachstumsergänzung aus bovinem Neuralgewebe (30 ug/ml) (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen) und Heparin ( 100 ug/ml) (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen). HUVECs wurden mit einer Dichte von 6 × 10 3 Zellen/cm² auf 24--Well-Platten, beschichtet mit Rattenschwanzkollagenlösung (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen), ausgesät. Dann wurden 24--h-Kulturen von HUVECs für 3 h ACN- und PP-Fraktionen in Konzentrationen von 0,1, 1 und 10 ug/ml ausgesetzt und anschließend mit TNF- (10 ng/ml) (Sigma-Aldrich, Poznan , Polen) für weitere 3 h, um eine Entzündung zu induzieren.

2.5. Zelllebensfähigkeitsassay

Die Lebensfähigkeit von hypertrophierten 3T3-L1-Adipozyten und TNF- --induzierten HUVECs, unbehandelt und mit ACN- und PP-Fraktionen behandelt, wurde unter Anwendung des MTT(3-(4,{{7 }}Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen) nach dem zuvor beschriebenen Verfahren [13]. Niedrige Konzentrationen von ACN- und PP-Fraktionen, die für die Zellbehandlung verwendet wurden, beeinflussten die Farbe des Mediums und die Extinktionsablesung im MTT-Test nicht.

2.6. Bestimmung der intrazellulären ROS-Produktion

Die ROS-Erzeugung in 3T3-L1-Adipozyten wurde unter Verwendung des Nitroblau-Tetrazolium (NBT)-Assays gemessen, basierend auf dem zuvor beschriebenen Verfahren [14]. Nach 90--minütiger Inkubation in 0,2-prozentiger NBT-Lösung (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen) wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit Methanol fixiert. Nach Extraktion des Formazan unter Verwendung von KOH und DMSO wurde die Extinktion bei 620 nm abgelesen (Tecan Infinite M200, Tecan Group Ltd., Männedorf, Schweiz).

2.7. Messung des intrazellulären Lipidgehalts

Die Wirkung von PP- und ACN-Fraktionen auf den Lipidgehalt in hypertrophierten Adipozyten wurde durch die zuvor beschriebene Färbemethode Oil Red O (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen) [13] und durch Messung der Gesamttriglyzeride (TG) unter Verwendung des Adipogenese-Assay-Kits ( Sigma-Aldrich, Poznan, Polen) nach Herstellerangaben. Der intrazelluläre TG-Gehalt wurde durch einen Enzymtest bestimmt. Ein dem vorhandenen TG entsprechendes kolorimetrisches Produkt wurde bei 570 nm gemessen. Die TG-Konzentration wurde basierend auf der für den TG-Standard gezeichneten Kurve berechnet.

2.8.RNA-Extraktion und Echtzeit-PCR-Analyse

3T3-L1-Adipozyten und HUVECs wurden mit TRI-Reagenz (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen) zur vollständigen RNA-Isolierung behandelt. Die Erststrang-cDNA-Synthese wurde mit 1 &mgr;g Gesamt-RNA unter Verwendung eines Transcriptor-Erststrang-cDNA-Synthesekits (Roche Diagnostics, Polen) basierend auf den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Quantifizierung der Genexpression wurde unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Systems (SmartCycler DX real-time PCR System Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) durchgeführt. Die PCR-Mischung in einem Endvolumen von 25 μl enthielt eine cDNA-Probe (1 μl), spezifisch vorwärts und Reverse Primer (5 μM/1 μL) und SYBR⑧ Select Master Mix (12,5 μL) (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Primersequenzen sind in Tabelle S1 gezeigt. Die PCR-Zyklusbedingungen umfassten eine anfängliche Denaturierung bei 94 Grad für 10 min, gefolgt von 40 PCR-Zyklen: 40 Sekunden bei 95 Grad, die 30 Sekunden bei 59 Grad C und 30 Sekunden bei 72 Grad. Die relative Genexpression wurde unter Verwendung der 2-△ACT-Methode berechnet. Die Transkriptspiegel wurden auf -Actin normalisiert für 3T3-L1-Adipozyten und GAPDH für HUVECs. Die relative mRNA-Expression wurde als fache Änderung im Vergleich zu (unbehandelten) Kontrollzellen ausgedrückt. Alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt.

2.9.Bestimmung der Adipokinproduktion

Leptin- und Adiponektinkonzentrationen wurden mit ELISA-Kits (Sigma-Aldrich, Poznan, Polen) gemäß den Protokollen des Herstellers gemessen. Die Quantifizierung wurde unter Verwendung der Kalibrierung von Standards durchgeführt. Jeder Standard und jede Probe wurde dreifach getestet. Inter-Assay- und Intra-Assay-Variabilitätskoeffizienten wurden mit 12,5 Prozent bzw. 9,3 Prozent für Leptin und 11,2 Prozent bzw. 7,9 Prozent für Adiponektin berechnet.

2.10.Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde unter Verwendung der Software STATISTICA Version 13.3 (Stat-soft, Inc., Tulsa, OK, USA) durchgeführt. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) und der Post-Hoc-Test nach Tukey wurden angewendet, um die Unterschiede zwischen den Mittelwerten mehrerer Gruppen abzuschätzen. Der Levene-Test bestätigte die Annahme der Gleichheit der Varianzen. Die statistische Signifikanz wurde auf p gesetzt<>

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Polyphenolzusammensetzung in den Preiselbeer-ACN- und -PP-Fraktionen

Die Studie konzentrierte sich auf zwei polyphenolische Präparate, die aus Preiselbeerfrüchten abgetrennt wurden: die Anthocyanin-ACN-Fraktion und die Nicht-Anthocyanin-PP-Fraktion. Die anhand der HPLC-DAD-ESI-MS-Analyse ermittelten Polyphenolprofile in den ACN- und PP-Fraktionen sind in Tabelle 1 dargestellt. einschließlich 3-O-Galactosid (82,5 Prozent), 3-O-Arabinosid (13,0 Prozent) und 3-O-Glucosid (4,5 Prozent) (Tabelle 1A) .

Tabelle 1. Verbindungen, die in Anthocyanin(ACN)-Fraktion (A) und Nicht-Anthocyanin-Polyphenol(PP)-Fraktion (B) identifiziert wurden, wurden aus Preiselbeerfrüchten erhalten.

The purity of ACN preparation was evaluated at 97.3%; among the non-anthocyanin constituents, 1-O-Benzoyl-β-glucose was identified by HPLC-ESI-MS analysis in positive ion mode (precursor ion at m/z307.079, production at m/z 185.0432). The PP fraction contained polyphenolic compounds belonging to three predominant groups: Flavan-3-ols, hydroxycinnamic acid derivatives, and flavonols, which accounted for 40.4%, 22.8%, and 31.0%, respectively. In addition, the anthocyanin compounds' residue (5.8%)was detected in the PP fraction with cyanidin-3-O-galactoside as dominant anthocyanin, cyanidin-pentoxide, and cyanidin 3-O-(6"-acetyl)-glucoside (Table 1B), trace amounts of which have been identified previously in the original lingonberry fruit extract [11]. In the PP fraction, the following polyphenols were quantified in a significant amount (>5 Prozent): Procyanidine vom A- und B-Typ, Catechin, 3-O-Caffeoylchinasäure, Ferulasäure-Hexosid, Quercetin und seine Derivate (3-O-Galactosid,3-O- Arabinofuranosid, 3-O-Rhamnosid). Tabelle 1B zeigt Massenspektraldaten aller polyphenolischen Verbindungen, die vorläufig in der PP-Fraktion von Preiselbeerfrüchten identifiziert wurden.

Dieser Artikel ist extrahiert aus Nutrients 2021, 13, 885 7