Salmonella Enterica-Serovare ohne TtrA- und PduA-Gene verstärken die zelluläre Immunantwort bei Hühnerinfektionen

Salmonellen spp. ist einer der wichtigsten durch Lebensmittel übertragenen Krankheitserreger, der für wirtschaftliche Verluste in der Geflügelindustrie und auch Folgen für die öffentliche Gesundheit verantwortlich ist. Sowohl die Überlebensfähigkeit der Krankheitserreger in der Darmumgebung während einer Entzündung als auch ihre Beziehung zum Immunsystem des Wirts spielen bei Infektionen bei Geflügel eine Schlüsselrolle. Das Ziel dieser Studie bestand darin, das Vorhandensein von Makrophagen und CD4+/CD{1}}-Zellpopulationen mithilfe der immunhistochemischen Technik in kommerziellen Abstammungslinien von Hühnern zu quantifizieren, die experimentell mit Wildtyp- und mutierten Salmonellenstämmen infiziert wurden Enteritidis und Salmonella Typhimurium ohne ttrA- und pduA-Gene. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA löste einen höheren Prozentsatz der befleckten Fläche aus als der Wildtyp, mit Ausnahme von Legehennen mit geringer Legehennenzahl. Salmonella Typhimurium-Wildtyp-Stamm und Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA-Infektionen führen zu einem ähnlichen Muster, bei dem die Blinddarmmandeln und das Ileum von Vögeln bei 1 und 14 dpi einen ausdrucksstärkeren gefärbten Bereich zeigten als bei 3 und 7 dpi. In allen untersuchten Abstammungslinien wurde eine deutliche Infiltration von Makrophagen im Vergleich zu CD4+- und CD{11}}-Zellen beobachtet. Insgesamt zeigten Tiere, die mit dem mutierten Stamm infiziert waren, einen positiv gefärbten Bereich, der höher war als der des Wildtyps. Deletionen sowohl im ttrA- als auch im pduA-Gen führten zu einer intensiveren Infiltration von Makrophagen und CD4+- und CD8+-Zellen in den Wirtsvögeln, was darauf hindeutet, dass es selbst bei verschiedenen Salmonellenstämmen zu keiner Abschwächung des Krankheitserregers kam.

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Salmonella enterica ist ein durch Lebensmittel übertragener Krankheitserreger, der zu Verlusten bei Nutztieren führt und sich direkt auf die öffentliche Gesundheit auswirkt. Salmonella enterica subsp. enterica-Serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) und Typhimurium (Salmonella Typhimurium) werden seit Jahrzehnten hauptsächlich mit Lebensmittelinfektionen in Verbindung gebracht. Zwischen 1995 und 2010 wurde Salmonella Enteritidis in 34,2 % aller Proben identifiziert, die positiv auf Salmonella spp1 waren. Darüber hinaus veröffentlichten Winter et al.2 eine umfangreiche Studie zur Untersuchung der Rolle des Tetrathionat-kodierenden Gens, wobei sie den Serotyp Salmonella Typhimurium wählten, aber Mäuse als Versuchsmodell verwendeten. Vor diesem Hintergrund könnte die Vertiefung unseres Wissens über die Wechselwirkung zwischen Wirt und Krankheitserreger dazu beitragen, die Kontroll- und Ausrottungsmessungen zu verbessern. An der Pathogenese der Salmonellose sind mehrere Faktoren beteiligt, beispielsweise die Fähigkeit des Erregers, sich in einer entzündeten Schleimumgebung zu vermehren, abhängig von der Nährstoffaufnahme und der anaeroben Atmung2. Die Nährstoffverfügbarkeit garantiert jedoch nicht das Überleben der Bakterien in einer Konkurrenzumgebung, die dicht von anderen Mikroorganismen besiedelt ist. Somit bietet die Fähigkeit von Salmonella enterica, Tetrathionat unter Verwendung von Tetrathionatreduktase zu metabolisieren, um 1,2-Propandiol als Energiequelle zu produzieren, einen Fitnessvorteil. Dieses Enzym besteht aus TtrA, TtrB und TtrC. Die erste genannte Untereinheit gehört zur Superfamilie der Molybdopterin (MPT) und verfügt über eine FeS-Begrenzungsdomäne, die an der Reduktion von Tetrathionat zu Thiosulfat (S2O3 2−)2–4 beteiligt ist. Te 1,2-Propandiol wird von bakteriellen Mikrokompartimenten (MCP) verwendet. Diese Struktur besteht aus sieben verschiedenen Proteinen, von denen PduA der Hauptbestandteil der MCP-Struktur ist5. Zunächst wird 1,2-Propandiol in Propionaldehyd umgewandelt, das wiederum durch Propandiol-Dehydratase-Aktivität zu Propanol und Propionat reduziert wird. Dieser Prozess erzeugt ATP durch Phosphorylierung, einen Elektronengradienten (1-Propanol) zur NAD-Regeneration und ein Zwischenprodukt (Propionyl-CoA), das als Kohlenstoff- und Energiequelle im gesamten Methylcitrat verwendet werden kann und auf das synthetisierte Vitamin B12 angewiesen ist auf endogene Weise6. Bei Hühnerinfektionen führt die Fähigkeit von Salmonella enterica-Serovaren, in die Darmepithelzellen und Makrophagen einzudringen und dort zu überleben, zu einer Umgehung der Immunantwort7. In diesem Zusammenhang ist die Infektion eine kritische Phase, die von der Interaktion zwischen Bakterien und Wirtszellen und der Fähigkeit der Bakterien abhängt, die Barrieren des Darmepithels zu überwinden, um ihre Kolonisierung und Replikation zu gewährleisten. Dennoch aktiviert es die Entzündungs- und Immunreaktionen8, die zur Endozytose und Phagozytose durch Epithel- bzw. Antigen-präsentierende Zellen (APCs) führen. Die antimikrobielle Aktivität dieser Zellen löst über Makrophagen eine angeborene Reaktion aus, und die adaptive Immunantwort beruht auf der Aktivierung von CD4+ und CD8+9. Um Licht auf die Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen hinter der Darminfektion durch Salmonellen bei Hühnern zu werfen, bewerten wir die Population von Zellen des Immunsystems während der Darmbesiedlung und systemischen Infektion bei Vögeln kommerzieller Abstammungslinien, die durch mutierte Wildtypstämme von Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium angegriffen werden , die Deletionen in Genen tragen, die mit der Metabolisierung von Tetrathionat (ttrA) und 1,2-Propandiol (PDU) zusammenhängen.

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Ergebnisse

Experiment 1 – Salmonella Enteritidis-Provokation.

Die Ergebnisse der Quantifizierung des Vorhandenseins der Immunantwortzellen in Blinddarmmandeln, Blinddarm, Ileum und Leber von Broilern, leichten Legehennen und halbschweren Legehennen sind in den Tabellen 1, 2 und 3 aufgeführt. Wir haben mehr CD gefunden 4+ und Makrophagenzellinfiltration von Broilern, die mit Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA (SEΔttrAΔpduA) infiziert waren, als von Broilern, die mit Salmonella Enteritidis Wildtyp-Stamm (wt-SE) oder nicht infizierten Vögeln infiziert waren, in allen untersuchten Geweben. Eine Ausnahme wurde für die CD4+-Zellinfiltration bei 3 dpi in den Blinddarmmandeln, im Ileum und in der Leber sowie für die Makrophageninfiltration bei 3 und 14 dpi in der Leber von SEΔttrAΔpduA-herausgeforderten Broilern festgestellt. Darüber hinaus wurde die Anzahl der infiltrierten CD8+-Zellen in größerer Menge bei Vögeln beobachtet, die SEΔttrAΔpduA bei 1 und 7 dpi im Blinddarm und in der Leber, bei 3 dpi in den Blinddarmmandeln und bei 14 dpi im Ileum ausgesetzt waren. Im Gegensatz dazu zeigten Vögel, die mit wt-SE belastet waren, eine starke Infiltration von CD8+-Zellen im Ileum und in den Blinddarmmandeln bei 1 bzw. 7 dpi (Tab. 1; ergänzende Abb. S1). Tabelle 2 und ergänzende Abbildung S2 zeigen die CD4+ und CD8+ sowie die Makrophageninfiltration in Geweben halbschwerer Legehennen. Im Allgemeinen gab es große Unterschiede zwischen den Bereichen der Zellinfiltrate, sowohl hinsichtlich des Belastungsstamms als auch der untersuchten Gewebe. Mit SEΔttrAΔpduA herausgeforderte Vögel zeigten größere Flächen, die von CD4+-Zellen (im Ileum bei 1 und 14 dpi und Leber bei 7 dpi) und Makrophagen (im Ileum bei 7 dpi und Leber bei 3, 7 und 14) bedeckt waren dpi) als im gleichen Gewebe von Vögeln, die mit Wildtier-SE infiziert waren. Andererseits wurden CD8+-Zellen in größeren Mengen in Blinddarmmandeln (bei 1 und 7 dpi) und im Blinddarm (bei 3 dpi) von Vögeln gefunden, die dem wt-SE-Stamm ausgesetzt waren. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA wurde bei Broilern und halbschweren Legehennen unterschiedlich beobachtet und löste bei der Herausforderung durch leichte Legehennen eine weniger intensive Immunantwort in Zellbereichen aus als der Wildtyp. Wt-SE-infizierte Vögel zeigten größere CD{47}}-Infiltrationsbereiche in den Blinddarmmandeln (bei 1 und 3 dpi), im Blinddarm (bei 3, 7 und 14 dpi), im Ileum (bei 1 und 7 dpi) und in der Leber (bei 1 und 7 dpi). 14 dpi). In ähnlicher Weise haben Herausforderungen mit SEΔttrAΔpduA zu verringerten Infiltrationsflächen von CD8+ in Blinddarmmandeln (bei 1 dpi) und Ileum (bei 7 und 14 dpi) sowie Makrophagen in Blinddarmtonsillen und Blinddarm (bei 3 dpi) geführt. im Vergleich zu Vögeln, die einer Wt-SE-Herausforderung ausgesetzt waren. Es wurden keine signifikanten Veränderungen der Immunzellenfläche von CD8+- und Makrophagenzellen in der Leber sowohl von SEΔttrAΔpduA- als auch von wt-SE-infizierten Vögeln beobachtet. Die detaillierten Ergebnisse der Herausforderung mit Legehennen mit geringer Legehennenzahl sind in Tabelle 3 dargestellt (siehe ergänzende Abbildung S3).

Tabelle 1. Darstellung des signifikanten Unterschieds im Zusammenhang mit der quantitativen Verteilung verschiedener Immunantwortzellen in Organen von Broilern, die mit Wild- und Mutantenstämmen von Salmonella Enteritidis infiziert sind, an verschiedenen Tagen nach der Infektion. DPI, Tage nach der Infektion; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis Wildtyp; ns, kein nennenswerter Unterschied. Innerhalb jedes Organs und jeder DPI bedeutet * die Differenz durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Bonferronis Vergleichstest zwischen den Werten wilder und mutierter Stämme (*P Kleiner oder gleich 0.05; **P Weniger als oder gleich 0.01; ***P Kleiner oder gleich 0,001; ****P Kleiner oder gleich 0,0001). Der in der Tabelle (∆-SE oder wt-SE) als signifikant dargestellte Stamm innerhalb des Organs und DPI ist derjenige, der den Hauptinflationsbereich jeder Zelle darstellt.

Tabelle 2. Darstellung des signifikanten Unterschieds im Zusammenhang mit der quantitativen Verteilung verschiedener Immunantwortzellen in Organen halbschwerer Legehennen, die an verschiedenen Tagen nach der Infektion mit Wild- und Mutantenstämmen von Salmonella Enteritidis infiziert waren. DPI, Tage nach der Infektion; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis Wildtyp; ns, kein nennenswerter Unterschied. Innerhalb jedes Organs und jeder DPI bedeutet * die Differenz durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Bonferronis Vergleichstest zwischen den Werten wilder und mutierter Stämme (*P Kleiner als oder gleich 0.{{10}}5 ; **P Kleiner als oder gleich 0.01; ***P Kleiner als oder gleich 0,001; ****P Kleiner als oder gleich 0,0001). Der in der Tabelle (∆-SE oder wt-SE) als signifikant dargestellte Stamm innerhalb des Organs und DPI ist derjenige, der den Hauptinflationsbereich jeder Zelle darstellt.

Tabelle 3. Darstellung des signifikanten Unterschieds im Zusammenhang mit der quantitativen Verteilung verschiedener Immunantwortzellen in Organen von Legehennen, die mit Salmonella Enteritidis-Wild- und Mutantenstämmen infiziert sind, an verschiedenen Tagen nach der Infektion. DPI, Tage nach der Infektion; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis Wildtyp; ns, kein signifikanter Unterschied. Innerhalb jedes Organs und jeder DPI bedeutet * die Differenz durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Bonferronis Vergleichstest zwischen den Werten wilder und mutierter Stämme (*P Kleiner als oder gleich 0.{{10}}5 ; **P Kleiner als oder gleich 0.01; ***P Kleiner als oder gleich 0,001; ****P Kleiner als oder gleich 0,0001). Der in der Tabelle (∆-SE oder wt-SE) als signifikant dargestellte Stamm innerhalb des Organs und DPI zeigt den Hauptinfiltrationsbereich für jede Zelle an.

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Experiment 2 – Salmonella Typhimurium-Provokation.

Die Ergebnisse der Quantifizierung des Vorhandenseins der Immunantwortzellen in Blinddarmmandeln, Blinddarm, Ileum und Leber von Broilern, halbschweren Legehennen und leichten Legehennen sind in den Tabellen 4, 5 bzw. 6 aufgeführt. Insgesamt zeigten Broiler, die mit dem Mutantenstamm infiziert waren, an allen vier Probenahmetagen eine größere positiv markierte Fläche als diejenigen, die mit dem Wildtyp-Stamm Salmonella Typhimurium (wt-STM) infiziert waren. Darüber hinaus wurden in den nicht infizierten Kontrollgruppen keine Veränderungen der Immunantwortzellen beobachtet. Die CD4+-Zellflächen in allen Geweben von Broilern erreichten einen statistischen Unterschied bei 1 dpi, mit größeren Infiltrationen für die Herausforderung mit Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA). Ein signifikanter Unterschied zwischen der Fläche der quantifizierten Immunantwort von STM∆ttrA∆pduA- und wt-STM-provokierten Vögeln bestand darin, dass größere Infiltrationen auftraten, wenn die Provokation mit dem mutierten Stamm im Caecum und Ileum bei 1 dpi und in der Leber erfolgte bei 14 dpi (CD8+-Zellen); im Blinddarm, Ileum und in der Leber bei 1 und 14 dpi (Makrophagen) (Tabelle 4; ergänzende Abbildung S4). Die Ergebnisse von halbschweren Legehennen zeigten keinen statistischen Unterschied zwischen Mutanten- und Wildtyp-Stammbelastungen für CD4+-Zellen im Blinddarm und CD{21}}-Zellen in den Blinddarmmandeln und im Ileum an allen 4 Tagen Postinfektionen ausgewertet (Tabelle 5; ergänzende Abbildung S5). Wenn jedoch ein signifikanter Konzentrationsbereich von Zellen des Immunsystems beobachtet wurde, wurden die halbschweren Legehennen durch STM∆ttrA∆pduA herausgefordert: Hauptinfiltrationsbereich von Makrophagen in allen untersuchten Geweben (bei 1 und 14 dpi); ein Hauptinfiltrationsbereich von CD4+-Zellen in den Blinddarmmandeln und der Leber (bei 1, 7 und 14 dpi) (Tabelle 5; ergänzende Abbildung S5). Tabelle 6 und ergänzende Abbildung S6 zeigen die CD4+-, CD8+- und Makrophageninfiltration im Gewebe heller Legehennen. Vögel, die mit STM∆ttrA∆pduA herausgefordert wurden, zeigten im Vergleich zu Immunantwortzellen eine größere Fläche von CD4+- und Makrophagenzellen in den Blinddarmmandeln und im Blinddarm (bei 14 dpi) sowie im Ileum (bei 1 und 14 dpi). Bereich der gleichen Gewebe von Vögeln, die mit Wildtier-STM infiziert waren. Es wurde kein statistischer Unterschied für das CD8+-Infiltrationsgebiet in den Blinddarmmandeln, im Blinddarm und im Ileum von infizierten Vögeln festgestellt. Im Gegensatz zu Ergebnissen, die in anderen Geweben erzielt wurden, wies die Leber von STM∆ttrA∆pduA-infizierten Vögeln einen ausdrucksstärkeren gefärbten Bereich von Immunantwortzellen für CD4+- und CD8+-Zellen bei allen vier dpi auf. und Makrophagen bei 1 und 14 dpi.

Tabelle 4. Darstellung des signifikanten Unterschieds im Zusammenhang mit der quantitativen Verteilung verschiedener Immunantwortzellen in Organen von Broilern, die mit Salmonella Typhimurium Wild- und Mutantenstämmen infiziert sind, an verschiedenen Tagen nach der Infektion. DPI, Tage nach der Infektion; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium Wildtyp; ns, kein nennenswerter Unterschied. Innerhalb jedes Organs und jeder DPI bedeutet * die Differenz durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Bonferronis Vergleichstest zwischen den Werten wilder und mutierter Stämme (*P Kleiner oder gleich 0.05; **P Weniger als oder gleich 0.01; ***P Kleiner oder gleich 0,001; ****P Kleiner oder gleich 0,0001). Der in der Tabelle (∆-STM oder wt-STM) als signifikant dargestellte Stamm innerhalb des Organs und DPI ist derjenige, der den Hauptinflationsbereich jeder Zelle darstellt.

Tabelle 5. Darstellung des signifikanten Unterschieds im Zusammenhang mit der quantitativen Verteilung verschiedener Immunantwortzellen in Organen halbschwerer Legehennen, die an verschiedenen Tagen nach der Infektion mit Salmonella Typhimurium-Wild- und Mutantenstämmen infiziert waren. DPI, Tage nach der Infektion; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium Wildtyp; ns, kein nennenswerter Unterschied. Innerhalb jedes Organs und jeder DPI bedeutet * die Differenz durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Bonferronis Vergleichstest zwischen den Werten wilder und mutierter Stämme (*P Kleiner als oder gleich 0.{{10}}5 ; **P Kleiner als oder gleich 0.01; ***P Kleiner als oder gleich 0,001; ****P Kleiner als oder gleich 0,0001). Der in der Tabelle (∆-STM oder wt-STM) als signifikant dargestellte Stamm innerhalb des Organs und DPI ist derjenige, der den Hauptinflationsbereich jeder Zelle darstellt.

Tabelle 6. Darstellung des signifikanten Unterschieds im Zusammenhang mit der quantitativen Verteilung verschiedener Immunantwortzellen in Organen von Legehennen, die mit Salmonella Typhimurium Wild- und Mutantenstämmen infiziert sind, an verschiedenen Tagen nach der Infektion. DPI, Tage nach der Infektion; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium Wildtyp; ns, kein signifikanter Unterschied. Innerhalb jedes Organs und jeder DPI bedeutet * die Differenz durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Bonferronis Vergleichstest zwischen den Werten wilder und mutierter Stämme (*P Kleiner als oder gleich 0.{{10}}5 ; **P Kleiner als oder gleich 0.01; ***P Kleiner als oder gleich 0,001; ****P Kleiner als oder gleich 0,0001). Der in der Tabelle dargestellte Stamm (∆-STM oder wt-STM) ist innerhalb des Organs signifikant und DPI zeigt den Hauptinfiltrationsbereich für jede Zelle an.

Diskussion

Wenn Bakterien anaeroben Bedingungen ausgesetzt sind, können sie die Stoffwechselsubstrate Tetrathionat und 1,2-Propandiol als Energie- und Atmungsquelle nutzen10. Somit sind Salmonella spp. wird seit langem untersucht, wie sich die Löschung von Genen, von denen bekannt ist, dass sie für diese Signalwege verantwortlich sind, auf ihr Überleben im Wirt auswirken würde. Nach unserem besten Wissen wurde nur eine Studie veröffentlicht, die gleichzeitig die Rollen von Tetrathionat- und Propandiol-kodierenden Genen untersuchte. Unsere Forschungsgruppe berichtete über die Auswirkungen dieser Deletionen, indem sie die systemische Infektion und die fäkale Ausscheidung von Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium in kommerziellen Hühnerlinien untersuchte11. Um die Diskussion zu diesem Thema anzuregen, hoben die vorliegenden Ergebnisse die Immunzellen hervor, die in verschiedene Gewebe von Hühnerlinien infiltriert wurden, die sowohl mit Wildtyp- als auch mit Mutantenstämmen infiziert waren, die Deletionen in ttrA- und pduA-Genen trugen. Im Verlauf des 2-wöchigen Experiments folgen die positiv gefärbten Bereiche von CD4+- und CD8+-Zellen und Makrophagen größtenteils einem ähnlichen Muster, wobei bei 1 und 14 dpi eine höhere Anzahl an Immunantworten vorliegt Zellen. Dies kann durch den primären Kontakt des Abwehrsystems des Wirts beim Eindringen des Erregers erklärt werden. Der vorherige Bericht hat gezeigt, dass bei infizierten Hühnern, selbst wenn Salmonellen bei 12 dpi nicht ausgeschieden werden, die Infektion durch einen Kloakenabstrich ab 13 dpi positiv werden kann12, was erklärt, warum die Bereiche der Zellen des Immunsystems bei 3 und 7 dpi niedriger waren, aber wieder zunahmen . Auf den ersten Blick wäre zu erwarten, dass die ausgelöste Reaktion des Wirts verringert würde, wenn sowohl pduA als auch ttrA gelöscht würden, da diese Gene eine wichtige Rolle für das Überleben während einer Salmonelleninfektion spielen2,4,13–15. Unsere Ergebnisse beim Vergleich einer Doppelmutante, der beide Gene fehlen, zeigten jedoch das Gegenteil: Die Mutantenstämme von Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium lösten eine stärkere Immunantwort der Zellen aus als die Wildtypstämme.

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Ein kürzester gefärbter Bereich könnte zu einer hohen Anzahl von Kolonien im Darmtrakt führen, was eine frühere Studie bestätigt, in der die Stämme Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA und Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA in größerer Zahl aus Kloakenabstrichen gewonnen wurden als ihr Wildtyp korrelierte11 . Salmonellen können sich je nach verfügbarem Nährstoffrepertoire als extrazelluläres oder intrazelluläres Bakterium verhalten und treten als Schalter zwischen Darmbesiedlung und Internalisierung in Wirtszellen auf16. Wenn die Bakterien von Makrophagen aufgenommen und abgetötet werden, werden einige Peptidfragmente auf die Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zelle übertragen und vom Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC), Klasse II, kodiert. Diese Peptid-MHC-II-Bindung stimuliert die T-CD4+-Lymphozyten. Wenn sich die Bakterien jedoch dafür entscheiden, in die Wirtszelle einzudringen und in das Zytoplasma des Makrophagen einzudringen, stimuliert die Peptidverbindung mit einem anderen MHC-Typ, Klasse I, die Produktion von T-CD8+-Lymphozyten17. Interessanterweise zeigen CD4+- und CD8+-Zellen während des gesamten Experiments das gleiche Makrophagenmuster und repräsentieren sogar unterschiedliche Immunantworten. Da CD4+- und CD8+-Zellen hauptsächlich T-Lymphozyten darstellen, die Teil der adaptiven Immunantwort sind, sind die Makrophagen Teil der angeborenen Immunantwort9. Darüber hinaus beobachteten wir, dass Broiler ausdrucksstärkere positiv markierte Bereiche aufweisen als Legehennen, was durch eine frühere Studie bestätigt wurde, in der Broiler, die Mutantenstämmen ausgesetzt waren, beispielsweise eine invasivere Darmbesiedlung und systemische Infektionen zeigten11. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass der immunhistochemische Ansatz interessante Informationen über das Verhalten von Immunantwortzellen auf mehreren Organen verschiedener kommerzieller Abstammungslinien während einer Infektion durch Salmonella enterica-Serovare liefert. Darüber hinaus beweist die vorliegende Studie, dass die Löschung beider Gene, selbst in verschiedenen Salmonellenstämmen, dazu führte, dass Bakterien im Wirt eine stärkere Immunantwort hervorriefen, was zeigt, dass der Erreger nicht abgeschwächt wurde. Wir können davon ausgehen, dass Salmonellen möglicherweise einen anderen Überlebensmechanismus finden konnten, der noch pathogener wurde. Die Verwendung von ttr- und pdu-Operons im Einklang mit cob- und PRP-Operons wurde in der vorherigen Studie als notwendig für die anaerobe Atmung gezeigt16, was uns zu der Annahme veranlasst, dass es nicht nur erforderlich ist, mehr Gene aus jedem Operon zu löschen18, sondern dass wir dies auch getan haben Ich denke darüber nach, diesen gesamten Satz zu streichen, um weniger pathogene Stämme von Salmonella enterica zu erreichen.

Materialen und Methoden

Die gemäß relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführten Experimente wurden von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren der Sao Paulo State University genehmigt (CEUA/Unesp-Prozess – 006621/18; am 10. Mai 2018) und in der Vogelpathologie durchgeführt Labor der Abteilung für Pathologie, Teriogenologie und One Health der Fakultät für Agrar- und Veterinärwissenschaften der Sao Paulo State University (FCAV/Unesp), Jaboticabal, Brasilien.

Bakterienstämme und Mutantenkonstruktion.

Die hier verwendeten Bakterienstämme wurden in einem kryoprotektiven Medium gelagert, das aus Lysogenie-Brühe (LB; BD DifcoTM, USA) und 30 % Glycerin (Merck, BR-H30402394 228) bestand, und in einem Ultra-Gefrierschrank (−) gelagert 80 Grad) am Avian Pathology Laboratory von FCAV/UNESP. Salmonella Enteritidis P125109 (Zugangsnummer: AM933172) und Salmonella Typhimurium str. 9819 wurden zur Nalidixinsäure- und Spectinomycin-Resistenz (Nalr Spcr) induziert und lieferten den genetischen Hintergrund für die Konstruktion mutierter Stämme durch die Lambda-Red-Technik20 mit geringfügigen Modifikationen, beschrieben in Saraiva et al.11. Hier konstruierte mutierte Bakterien werden im Text als SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) und STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due) identifiziert.

In-vivo-Experiment.

Experiment 1 – Salmonella Enteritidis. Sechsunddreißig 1-Tage alte Küken aus jeweils drei verschiedenen Abstammungslinien (Masthühner, halbschwere Legehennen und leichte Legehennen), insgesamt einhundertacht Tiere, wurden aus kommerziellen Brütereien bezogen. Bei der Ankunft wurde der Boden der Transportkartenboxen untersucht, um den Salmonellenfreiheitsstatus der Vögel zu bestätigen21, und die Tiere wurden in Metallkäfigen im akklimatisierten Raum untergebracht und erhielten nach Belieben antibiotikafreies Futter und Wasser. Am ersten Tag wurde ein 24--Stunden-Lichtprogramm gewählt, um eine optimale Wasser- und Nahrungsaufnahme sicherzustellen. Anschließend wurde in der ersten Woche ein 12--Stunden-Lichtprogramm eingeführt, das an den restlichen Tagen auf 8 Stunden reduziert wurde. Das Inokulum wurde nach Berchieri Junior et al.22 hergestellt. Hierzu wurden die gefrorenen Kulturen in LB beimpft und über Nacht bei 37 Grad und 15 0 U/min inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Bakterienkulturen in frische Medien überführt und 18 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen wie zuvor inkubiert. Dann wurden 0,2 ml der Kulturen, die 108 koloniebildende Einheiten pro ml (KBE/ml) enthielten, per Metallsonde direkt in den Kropf der Vögel geimpft. Es wurden neun Gruppen gebildet (A bis I) und zufällig nach den verschiedenen Abstammungslinien und Stämmen aufgeteilt (Tabelle 7). Einen, drei, sieben und 14-Tage nach der Infektion (dpi) wurden jeden Tag drei Vögel pro Gruppe bis zum Morgen durch Zervixluxation eingeschläfert, um den medialen Abschnitt der Blinddarmmandeln, des Blinddarms, und Ileum sowie der distale Abschnitt des linken Leberlappens zur weiteren immunhistochemischen (IHC) Analyse. Zu diesem Zweck wurden die Proben in n-Hexan pa (n-Hexano pa, Synth, Brasilien) getaucht, das zuvor in flüssigem Stickstoff gekühlt wurde. Unmittelbar nach dem Einfrieren des Gewebes wurde es in ein 2-ml-Kryoröhrchen (Corning, USA) überführt und in flüssigem Stickstoff konditioniert. Nach der Probenahme wurden die Gewebe bis zum IHC-Prozess bei –80 Grad gelagert.

Experiment 2 – Salmonella Typhimurium. Dieses Experiment wurde nach denselben Merkmalen durchgeführt, die oben in Experiment 1 erwähnt wurden. Sechsunddreißig Küken (1 Tag alt) wurden basierend auf ihren Abstammungslinien und Stämmen zufällig in neun Gruppen (A bis I) eingeteilt (Tabelle 7).

Tabelle 7. Etablierte Gruppen nach den verschiedenen Abstammungslinien und Stämmen. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis Wildtyp; wt-STM, Salmonella Typhimurium Wildtyp; NC, Negativkontrolle.

Immunhistochemie.

Gewebeabschnitt. Die gesammelten Proben wurden von –80 Grad in einen Kryostat (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Deutschland) bei –22 Grad überführt, wo sie jeweils 30 Minuten zuvor einzeln in OCT-Verbindung (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Niederlande) blockiert wurden bis 6 µm Schnitt mit Low-Profile-Einwegklingen (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Deutschland). Es ist bemerkenswert, dass Schnitte bei –22 Grad durchgeführt wurden, mit Ausnahme der Leberschnitte, die bei –15 Grad durchgeführt wurden. Es wurden Objektträger hergestellt, die drei Wiederholungen des Schnitts jedes Organs pro markierter Immunzellreaktion enthielten, wobei zwischen jeder Wiederholung eine Verdünnung vorgenommen wurde. Mit einem Pinsel wurden die Gewebeschnitte auf histologischen Objektträgern platziert, die mit Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich, Vereinigtes Königreich, Kat.-Nr. P4832) und Silan (Sigma-Aldrich, USA, Kat.-Nr. 440574) vorbehandelt waren. Die Objektträger wurden danach bis zur IHC-Färbung bei –20 Grad gelagert. Färbung von Immunzellen. Zunächst wurden die Objektträger in 200 ml gekühltes Aceton (Aceton PA – ACS, Synth, Brasilien) getaucht und 10 Minuten lang bei –20 Grad inkubiert. Danach wurden die Objektträger 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in eine Feuchtigkeitskammer (EasyPath®, Brasilien) überführt, um die Proben zu trocknen. Die Objektträger wurden anschließend mit PBS gewaschen und eine Pfütze wurde 5 Minuten lang belassen, um eine Austrocknung des Gewebes zu vermeiden. Zehnmal wurden die Gewebe alle 10 Minuten an einem dunklen Ort in 200 ml 4 %iges H2O2 getaucht und erneut mit PBS gewaschen. Der Bereich um die Gewebeschnitte wurde mit saugfähigem Papier getrocknet und die Probe wurde mit einem hydrophoben Stift (Dako Pen, Dako Denmark A/S, Dänemark) umgangen. Der Waschschritt, bei dem eine Pfütze zurückblieb, wurde wie zuvor wiederholt. Zur Färbung der Immunzellen wurde das biotinfreie Kit Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection – Micropolymer (Abcam©, USA) verwendet, wobei die Methode Avidin-Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC) gewählt wurde. Hierzu wurde die Pfütze entfernt und den Geweben unspezifische Hintergrundfarbblocker-Reagenstropfen zugesetzt. Die Objektträger wurden 30 Minuten lang an einem dunklen Ort in der Feuchtigkeitskammer aufbewahrt, der Waschschritt wurde wiederholt und 200 µL Primärantikörper (Mouse Anti-Chicken CD4-UNLB; Mouse Anti-Chicken CD{{34} } UNLB; Maus-Anti-Chicken-Monozyten/Makrophagen-UNLB, Southern Biotech, USA), verdünnt im Verhältnis 1:200 (v/v) im Antikörper-Verdünnungsreagens (Antibody Diluent, Abcam©, USA), wurde anschließend hinzugefügt. Die Objektträger wurden 18 Stunden lang bei 4 Grad inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Objektträger wie zuvor gewaschen. Nach Entfernen des überschüssigen PBS wurden zehn Tröpfchen des sekundären Antikörpers (Reveal Complement, Abcam©, USA) zugegeben und die Feuchtigkeitskammer 30 Minuten lang in eine dunkle Umgebung gestellt. Anschließend wurde ein Tropfen 3,3′-Diaminobenzidin (DAB Chromogen 50×, Abcam©, USA) in 1 ml Substrat (DAB Substrate, Abcam©, USA), dessen Volumen für drei Objektträger ausreicht, verdünnt und zugegeben die Gewebeabschnitte. Eine Minute später wurden die Objektträger 5 Minuten lang in 200 ml dH2O getaucht. Danach wurden sie in einen Plastikwürfel mit Harris-Hämatoxylin (Êxodo Científca, Brasilien) überführt und dort 1 Minute lang stehen gelassen. Anschließend wurden die Objektträger 10 Minuten lang unter fließendem Wasser bei niedrigem Druck gewaschen. Die Objektträger wurden der Alkohol-Xylol-Reihe (70 % Alkohol, 90 % Alkohol, 100 % Alkohol, Xylol I und Xylol II) unterzogen. Am Ende wurden die Deckgläser auf die Objektträger gelegt, nachdem ein Tropfen wasserfreies Eindeckmedium (Entellan®, Merck, Brasilien) hinzugefügt wurde. Zur weiteren statistischen Analyse wurden unter Verwendung eines optischen Mikroskops (Objektiv 400×) (Coleman®, Modell N-120) mit einem Digitalkameraadapter nach dem Zufallsprinzip Bilder von den Gewebeschnitten aufgenommen, wobei fünf zufällige Sichtfelder ausgewählt wurden (Abb. 1). ).

Datenanalyse.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

Der Prozentsatz von CD{{0}}- und CD8+-Zellen und Makrophagen wurde mit Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, USA) berechnet. Sie wurden als Prozentwerte anhand der Immunzellmarker-positiven Fläche/Gesamtfläche quantifiziert. Statistische Analysen und Grafiken wurden mit der Software GraphPad Prism v.8.0.1 für macOS (GraphPad Sofware, La Jolla, Kalifornien, USA) erstellt und die Daten wurden einer Varianzanalyse (ANOVA) übermittelt, gefolgt von Bonferroni-Mehrfachvergleichen. unter Berücksichtigung eines Signifikanzniveaus von weniger als 5 % (P kleiner oder gleich 0,05).

Abbildung 1. Abschnitt des Blinddarms eines mit Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA infizierten Broilers, der Immunreaktionen in Makrophagen zeigt, 7 Tage nach der Infektion (×400; Avidin-Biotin-Streptavidin-Peroxidase, gegengefärbt mit Hämatoxylin).

Verweise

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