Immunantworten auf sequentielle binokulare Transplantation allogener retinaler Vorläuferzellen in die Glaskörperhöhle bei Mäusen

Abstrakt:

Die intravitreale Transplantation allogener menschlicher retinaler Vorläuferzellen (RPC) ist eine vielversprechende Behandlungsmethode für eine erblindende Retinadegeneration. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass neurale Vorläufer als Allotransplantate nach Einzelinjektionen gut verträglich sind; Allerdings erhöht die sequentielle Abgabe allogener Zellen das potenzielle Risiko einer Wirtssensibilisierung mit anschließender Immunabstoßung von Transplantaten. Die aktuelle Studie sollte untersuchen, ob eine Immunantwort durch wiederholte intravitreale Transplantationen allogener RPCs unter Verwendung des Maustiermodells induziert wird. Wir injizierten murinen retinalen Vorläuferzellen (gmRPCs), die ursprünglich von Spendern mit einem C57BL/6-Genhintergrund stammten, BALB/c-Empfängermäusen, um Sicherheitsdaten darüber zu liefern, was nach wiederholter Behandlung von Patienten mit allogenen menschlichen Zellprodukten zu erwarten ist . Die Immunantworten auf gmRPCs waren mild und bestanden aus T-Zellen, B-Zellen, Neutrophilen und natürlichen Killerzellen, wobei Makrophagen eindeutig vorherrschten. Tiere, die mit wiederholten Dosen von gmRPCs behandelt wurden, zeigten keine Anzeichen einer Sensibilisierung, noch kam es zu einer immunvermittelten Zerstörung der Transplantate. Trotz des Fehlens immunsuppressiver Behandlungen überlebten allogene gmRPC-Transplantate nach wiederholter Gabe, was die vorläufige Beobachtung stützt, dass eine wiederholte Injektion allogener RPCs in die Glaskörperhöhle bei Patienten mit Retinitis pigmentosa toleriert wird.

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Schlüsselwörter: Stammzellen; Immuntoleranz; Immunprivileg; Transplantatabstoßung; intravitreale Injektion

1. Einleitung

Retinitis pigmentosa (RP) umfasst eine Klasse genetischer Stäbchen-Zapfen-Degeneration und führt zu fortschreitender Sehbehinderung und schließlich zur Erblindung. In den allermeisten Fällen stehen keine bewährten therapeutischen Maßnahmen zur Erhaltung oder Wiederherstellung des Sehvermögens zur Verfügung; Eine Strategie zur Deckung dieses ungedeckten medizinischen Bedarfs ist jedoch die Stammzelltransplantation. Unsere Forschungsgruppe hat die intravitreale Injektion kultivierter menschlicher retinaler Vorläuferzellen (RPC) als eine Möglichkeit untersucht, bei RP einzugreifen, mit dem therapeutischen Ziel, das Fortschreiten zu stabilisieren oder möglicherweise den Krankheitsverlauf umzukehren. RPGs können durch Gewebespende aus unreifen Netzhäuten oder neuerdings auch aus pluripotenten Zelllinien gewonnen werden. Studien an Tiermodellen haben gezeigt, dass diese Zellen in der Lage sind, Photorezeptoren nach der Injektion in das Auge vor der Degeneration zu bewahren und sich im Wirtsauge auch zu Stäbchen-Photorezeptoren zu differenzieren. Aus Tierversuchen gibt es Hinweise darauf, dass injizierte hRPCs zu funktionellen, integrierten Photorezeptoren werden und dadurch potenziell die Netzhaut stabilisieren können, indem sie sterbende Zellen direkt ersetzen. Somit könnten injizierte hRPCs RP sowohl auf neurotrophe Weise als auch über einen Zellersatzmechanismus behandeln. In jedem Fall bietet dieser zellbasierte Ansatz eine rationale Strategie für die Behandlung von Patienten, die an RP und möglicherweise anderen Netzhauterkrankungen leiden.

Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft von RPCs und möglicherweise neuronalen Vorläufern im Allgemeinen ist die relative Toleranz, die diese Zellen nach der Transplantation als Allotransplantate genießen, insbesondere wenn sie an einen Ort mit Immunprivileg wie die Netzhaut abgegeben werden [1,2]. Jüngste Überprüfungen klinischer Studien im Bereich der regenerativen Medizin berichten jedoch weiterhin von weit verbreiteten und erheblichen Herausforderungen im Zusammenhang mit Entzündungen und Immunabstoßung [3,4], auch bei Eingriffen, die auf das Auge abzielen, wie z. B. Gentherapien der Netzhaut [5]. sowie einige, aber nicht alle Zelltherapien [6]. Obwohl es sich um einen lokalen Zelltyp handelt, sind die Zellen des retinalen Pigmentepithels (RPE) nicht von Abstoßungsproblemen ausgenommen [7–9]; Daher ist die Immunsuppression der Empfänger derzeit Standardpraxis [10,11]. Menschliche RPCs hingegen scheinen als Allotransplantate bemerkenswert gut verträglich zu sein [6,12–16], obwohl sich dies nicht auf ihre Verwendung als Xenotransplantate erstreckt, bei denen eine Immunsuppression erforderlich ist [17]. Die Grundlage für das nachhaltige Überleben allogener RPCs im Auge dürfte eine Reihe von Faktoren sein, die mit den verwendeten Zellen und der Empfängerstelle zusammenhängen [1,8,18,19]. In früheren Arbeiten mithilfe der Durchflusszytometrie haben wir gezeigt, dass menschliche neurale Vorläufer, sowohl aus dem Gehirn als auch aus der Netzhaut, Haupthistokompatibilitätsantigene (MHC) der Klasse I, jedoch nicht der Klasse II, exprimieren [20,21]. Der klassische Mechanismus der Transplantatabstoßung beinhaltet die unspezifische Erkennung fremder MHC-Klasse-II-Moleküle durch CD4+-Wirtslymphozyten [20–25]. Auf diese Weise könnte das Fehlen von Klasse-II-Molekülen es transplantierten Vorläuferzellen ermöglichen, der über diesen Mechanismus vermittelten Immunabstoßung zu entgehen. Allerdings ist der scheinbare „immunprivilegierte“ Status intravitreal injizierter hRPCs nicht unbedingt absolut. Während Vorläuferzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) der Maus zu Studienbeginn keine nachweisbaren Klasse-I- oder Klasse-II-MHC-Moleküle exprimieren und als Allotransplantate offensichtlich eine Immunprivilegierung aufweisen [1,2,20], können diese Zellen unter bestimmten Umständen einer Immunabstoßung unterliegen. Studien haben gezeigt, dass MHC-Antigene durch die Stimulation von ZNS-Vorläuferzellen mit Interferon-gamma (IFN) induziert werden können [1,26]. ZNS-Vorläufer können nach der Sensibilisierung eines zuvor transplantierten Wirts abgestoßen werden. Daher exprimieren ZNS-Vorläuferzellen (einschließlich RPCs) Alloantigene, die vom Immunsystem des Wirts erkannt werden. Zusammengenommen bedeutet dies, dass der immunprivilegierte Status transplantierter Vorläuferzellen vorläufig ist und einer Modulation unterliegt, z. B. durch in der lokalen Mikroumgebung vorhandene Zytokine, und dass er sich im Verlauf von Degenerationen wie RP ändern kann. Aus all diesen Gründen ist die Immunantwort auf mehrere intravitreale RPC-Injektionen schwer vorherzusagen und muss speziell untersucht werden.

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Wenn sich die RPC-Behandlung bei RP als klinisch erfolgreich erweist, bestehen starke Anreize für die Behandlung beider Augen bei dieser beidseitigen Erblindungserkrankung. Zumindest aus Sicherheitsgründen würden binokulare Behandlungen typischerweise nacheinander durchgeführt, mit einer erheblichen Verzögerungszeit zwischen den beiden Injektionen. Bemerkenswert ist, dass diese sequentielle Abgabe allogener Zellen zu einer Sensibilisierung des Wirts als Reaktion auf die erste Injektion führen und möglicherweise eine Immunabstoßung als Reaktion auf die zweite Injektion auslösen könnte. Dies könnte zum Verlust von Transplantaten in beiden Augen führen. Frühere Berichte, in denen die subretinale Einzeldosierung mit hRPCs bei RP [27] oder die erneute Dosierung mit menschlichen neuronalen Vorläufern bei Tieren [28, 29] untersucht wurde, umfassten die Immunsuppression. Daher wurde die folgende Studie als translationale Untersuchung muriner RPCs als sequentielle Allotransplantate in einem immunkompetenten Mausstamm mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund konzipiert. Obwohl menschliche RPC-Produkte nicht berücksichtigt wurden, wurde diese Arbeit im Rahmen von IND-fähigen Studien durchgeführt, um Tierdaten zur Sicherheit bereitzustellen, d. h. ob eine Immunsuppression für Patienten erforderlich wäre, die in von der FDA registrierten Studien wiederholt RPC-Allotransplantatbehandlungen erhielten.

2. Ergebnisse

Um die immunologischen Folgen einer bilateralen RPC-Injektion bei allogenen Mäusen zu untersuchen, wurden gmRPCs (genetischer C57BL/6-Hintergrund) intravitreal in ein Auge von BALB/c-Empfängern injiziert und zwei Wochen später wurde eine zweite Dosis RPCs in das andere Auge injiziert. Das Zeitintervall von 2-Wochen wurde so gewählt, dass es ausreicht, dass das erste Transplantat sowohl angeborene als auch adaptive Immunantworten auslösen kann. Keines der Versuchstiere erhielt eine immunsuppressive medikamentöse Behandlung, sodass die natürlichen physiologischen Immunantworten beobachtet werden konnten.

2.1.Die klinische Beobachtung und die augenärztliche Untersuchung ergaben keine Auffälligkeiten

Das Gewicht der Versuchstiere wurde zum Zeitpunkt jeder gmRPC-Injektion gemessen. Alle Versuchstiere zeigten zwischen der ersten und zweiten Injektion eine Gewichtszunahme, was mit einem insgesamt guten Gesundheitszustand übereinstimmt. Tiere, die am Tag 14 und am Tag 28 ± 1 nach der zweiten gmRPC-Injektion getötet wurden, wurden durch das Operationsmikroskop untersucht. Sowohl der vordere als auch der hintere Augenabschnitt der meisten untersuchten Augen wurden als „innerhalb normaler Grenzen“ (WNL) beurteilt. Es gab keine Anzeichen einer Entzündung oder anderer sichtbarer Anomalien in den unbehandelten, scheinbehandelten und mit gmRPC behandelten Gruppen, was darauf hindeutet, dass die intravitreale gmRPC-Injektion keine entzündlichen Reaktionen oder physischen Gewebeschäden hervorrief, die mit dieser Methode erkennbar waren. Zellcluster, aus denen das Transplantat bestand, waren sowohl am 14. als auch am 28. Tag nach der zweiten gmRPC-Injektion im Glaskörper sichtbar (Abbildung 1). Die wiederholte Injektion von gmRPCs führte zu keinen merklichen Veränderungen in der Größe der Zellcluster, was mit einem anhaltenden Überleben der Spenderzellen vereinbar ist. Am terminalen Endpunkt wurde auch eine grobe Pathologie beurteilt und es wurden keine vergrößerten Augäpfel (die auf eine Tumorbildung hindeuten) oder andere Anomalien festgestellt.

Abbildung 1. Transplantierte gmRPCs, in vivo mittels Fundusfotografie durch ein Operationsmikroskop sichtbar gemacht (alle=linkes Auge, OS). (A, B), scheinbehandelte Tiere (Schein/Schein, S/S); (C, D), Kontrolltiere mit scheinbehandeltem rechten Auge, gefolgt von gmRPCs-behandeltem linken Auge (Schein/Zelle, S/C) und Tiere, bei denen beide Augen nacheinander mit gmRPCs behandelt wurden (Zelle/Zelle, C/C). durch das Operationsmikroskop beobachtet und abgebildet. Das obere Feld (A, C, E) zeigt Bilder des OS, aufgenommen am 14. Tag nach der zweiten Injektion; Das untere Feld (B, D, F) zeigt Bilder des OS, aufgenommen am 28. Tag nach der zweiten Injektion. Allotransplantate waren zu beiden Zeitpunkten (Tag 14: (C, D) und Tag 28: ( E, F)). Abgesehen von den Transplantaten gab es bei dieser axialen Betrachtung keine offensichtliche Entzündung oder zusätzliche Anomalie im vorderen und hinteren Segment.

2.2. Immunfluoreszenzmarkierung zeigte Immunzellen im Glaskörper

Die Immunfluoreszenzmarkierung für fünf wichtige Immunzelltypen (Makrophagen, Neutrophile, natürliche Killerzellen, T-Zellen und B-Zellen) wurde an den Kryoschnitten des Auges durchgeführt und zeigte eine positive Infiltration von Immunzellen im Auge nach der gmRPC-Injektion (Abbildung 2A–F). T-Zellen (CD3), B-Zellen (CD45R), Neutrophile (Ly-6G) und natürliche Killerzellen (CD49b) zeigten eine begrenzte Präsenz in Augen, denen gmRPCs injiziert wurden, wohingegen aktivierte Makrophagen (Iba-1 ) waren die wichtigsten Immunzellen, die auf die intravitrealen Transplantate reagierten. Vergleichbares Gewebe von unbehandelten und scheinbehandelten Tieren zeigte in Augen-Kryoschnitten keine Immunzellen, was darauf hindeutet, dass die beobachtete Infiltration von Immunzellen eine Reaktion auf die gmRPC-Transplantate war. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung befanden sich die Immunzellen in der Umgebung der gmRPC-Transplantate oder innerhalb der gmRPC-Cluster selbst.

Abbildung 2. Immunmarkierung infiltrierter Immunzellen nach Behandlungsgruppe. Immunfluoreszenzbilder von (A) Kontrollschnitten (Sekundärantikörper allein), (B) Anti-Iba-1 (aktivierter Makrophagen- und Mikroglia-Marker), (C) Anti-Ly-6G (Neutrophilen-Marker), (D) Anti-CD49b (natürlicher Killerzellmarker), (E) Antikörper Anti-CD3 (T-Zellmarker) und (F) Anti-CD45R (B-Zellmarker) sind in der Abbildung dargestellt. Die wenigen vorhandenen roten Signale deuten auf eine positive Antikörpermarkierung für Leukozytenmarker hin, grüne Signale auf die gmRPC-Transplantate und blaue Signale auf eine DAPI-Kernmarkierung. Gelb ist eine unspezifische Überlappung von Signalen, die am deutlichsten in den äußeren Segmenten des Photorezeptors zu erkennen ist, die Autofluoreszenz aufweisen. Behandlungsgruppen: unbehandelt (UT), beide Augen unbehandelt; S/S, beide Augen scheinbehandelt (sequentiell) mit Vehikel; S/C, dem rechten Auge wurde Vehikel injiziert, gefolgt vom linken Auge mit 50,000 gmRPCs und; C/C, beiden Augen wurden 50,000 gmRPCs (sequentiell) gemäß dem Zeitplan in Abschnitt 4 injiziert

Die Spitzenzahlen jeder Immunzelle im Auge variierten je nach Zelltyp (Abbildung 3A–E). Im Gegensatz dazu zeigte die Zwei-Wege-ANOVA keine Unterschiede in der Infiltration von Immunzellen beim Vergleich von Tieren, die einzelne gmRPC-Injektionen (Schein/Zellen) erhielten, mit Tieren, die bilaterale Injektionen (Zellen/Zellen) erhielten. Dies war der Fall bei der Infiltration von Makrophagen (Anti-Iba-1-Färbung) (Abbildung 3A), Neutrophilen (Anti-Ly-6G-Färbung) (Abbildung 3B) und natürlichen Killerzellen (CD49b-Färbung) ( Abbildung 3C), T-Zellen (CD3-Färbung) (Abbildung 3D) und B-Zellen (CD45R-Färbung) (Abbildung 3E).

2.3. ELISPOT zeigte keine Antigen-Rückrufreaktionen

ELISPOT ist eine Möglichkeit, die antigenspezifische IFN-produzierende T-Zell-Aktivierung zu testen. Die Behandlung mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) war eine Positivkontrolle, die den Second Messenger DAG nachahmte, um den T-Zell-Rezeptorweg zu aktivieren und dadurch wiederum eine T-Zell-Aktivierung zu bewirken. In Abbildung 4A–D zeigten PMA-behandelte Gruppen im Vergleich zu Kontrollgruppen mit Responderzellen allein (d. h. Lymphozyten aus CLNs, Splenozyten aus der Milz) viel höhere IFN-Spotzahlen. Wenn die Responder-Zellen zusammen mit C57BL/6-Splenozyten (B6 SPL) kultiviert wurden, waren die Proben am 14. Tag vergleichbar mit den Responder-Zellen allein-Gruppen, mit nur geringfügig höheren IFN-Spotzahlen, was auf einen Mangel an T-Zell-Aktivierung hinweist (Abbildung 4A, B).

Abbildung 3. Quantifizierung der Infiltration von Immunzellen nach gmRPC-Transplantation. Infiltrierte Immunzellen wurden nach der gmRPC-Injektion für jede Versuchsbedingung als rote Fluoreszenzsignale im Bildgebungsfeld sichtbar gemacht, mit ImageJ gezählt und in Balkendiagrammen dargestellt. Daten von Iba-1 (aktivierter Makrophagen- und Mikroglia-Marker) (A), Anti-Ly-6G (Neutrophilen-Marker) (B), Anti-CD49b (Marker für natürliche Killerzellen) (C), Antikörper Anti-CD3 (T-Zellen-Marker) (D) und Anti-CD45R (B-Zellen-Marker) (E) wurden in der Abbildung angezeigt. Zwei-Wege-ANOVA-Tests wurden verwendet, um die Signifikanz zwischen den Schein-/Zell- und Zell/Zell-Gruppen zu testen; p-Werte waren: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p < 0,6411 und (E) p < 0,7201 (keine waren signifikant).

Beim Testen allogener Spenderzellen mit diesem Assay zeigten die Responderzellen der Tiere, denen gmRPCs intraperitoneal injiziert wurden (IP-Gruppe), keine Antigen-Recall-Reaktionen, da die Proben im Vergleich zu den Scheintieren, die nie exponiert wurden, keine stärkere T-Zell-Aktivierung durch IFN-Spot-Zählungen zeigten zu gmRPCs (Schein/Schein). Auch zeigten die Tiere, denen die gmRPCs entweder einmal (Schein/Zelle) oder wiederholt (Zelle/Zelle) intravitreal injiziert wurden, keinerlei Antigen-Recall-Reaktionen. In einem Fall schienen die Reaktionen auf wiederholte gmRPC-Dosierung gedämpfter zu sein (Abbildung 4B). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass gmRPCs eine sehr geringe Antigenität aufweisen. Beachten Sie, dass C57BL/6-Splenozyten mit dem genetischen Hintergrund der gmRPCs abgeglichen wurden. Unerwarteterweise erhöhten die alternativen Stimulatorzellen, gmRPCs, die IFN-Spotzahl in allen Versuchsgruppen im Vergleich zu den Negativkontrollgruppen (Abbildung 4A–D). Eine mögliche Erklärung könnten die gmRPCs sein, die in diesem Test einen hohen Hintergrund verursachen. Wichtig ist, dass es keinen Unterschied zwischen den unbehandelten, scheinbehandelten Gruppen mit einer einzelnen gmRPC-Injektion und den Gruppen mit wiederholter gmRPC-Injektion gab, was wiederum auf das Fehlen von Antigen-Recall-Reaktionen hinwies.

Abbildung 4. ELISPOT-Quantifizierung nach gmRPC-Transplantation. ELISPOT-Assays wurden auf die folgenden Gruppen festgelegt: Kontrolle, Responderzellen allein (Lymphozyten oder Splenozyten, die T-Zellen enthalten, die aus zervikalen Lymphknoten (CLNs) oder Milzen (SPL) der Versuchstiere isoliert wurden; PMA, Responderzellen, behandelt mit Phorbol {{1} }Myristat 13-Acetat (PMA) und Ca-Ionophor; B6 SPL, Responderzellen gemischt mit Splenozyten, isoliert aus C57BL/6-Tieren; gmRPCs, die gleichen Responderzellen gemischt mit gmRPCs. (A), Die Responderzellen waren die Splenozyten von den Versuchstieren, die am Tag 14 nach der zweiten gmRPCs-Injektion getötet wurden. (B) Die Responderzellen waren die Lymphozyten aus den CLNs der Versuchstiere, die am Tag 14 nach der zweiten gmRPCs-Injektion getötet wurden. (C) Die Responderzellen waren die Splenozyten der Versuchstiere, die am Tag 29 nach der zweiten gmRPCs-Injektion getötet wurden. (D) Die Responderzellen waren die Lymphozyten aus den CLNs der Versuchstiere, die am Tag 29 nach der zweiten gmRPCs-Injektion getötet wurden. Zwei-Wege-ANOVA-Tests wurden verwendet, um die Signifikanz (*) zwischen den Schein-/Zell- und Zell/Zell-Gruppen zu testen; p-Werte waren: (A) p < 0.5332, (B) p < 0.0001 (signifikant), (C) p < 0.0207 ( signifikant) und (D) p < 0,3355.

3. Diskussion 

Es besteht großes Interesse an der Stammzelltechnologie als Mittel zur Behandlung degenerativer Erkrankungen der Netzhaut, und unsere Gruppe untersucht den Einsatz allogener hRPCs bei RP. Um Daten zu möglichen Immunfolgen zu sammeln, wenn mehr als eine Dosis eines allogenen menschlichen RPC-Produkts über eine intravitreale Injektion verabreicht wird, führten wir die vorliegende Tierstudie mit gmRPCs aus einem C57BL/6-Hintergrund als Transplantate und BALB/c-Mäusen als Wirten durch. Diese unterschiedlichen genetischen Hintergründe wurden verwendet, um eine sequentielle Behandlung mit allogenen hRPCs zu modellieren und vorläufige Sicherheitsdaten vor Tests am Menschen bereitzustellen.

Um die Reaktionen vollständig beurteilen zu können, erhielten die Wirtstiere keine immunsuppressive Behandlung. Wir verglichen die durch eine einzelne gmRPC-Injektion erzeugten Immunantworten mit einer sequentiellen bilateralen Dosierung gemäß dem beschriebenen Injektionsplan. Ophthalmologische Untersuchungen ergaben keine Entzündungen oder andere nennenswerte Unterschiede zwischen den Tiergruppen, die 1 Dosis gmRPCs oder 2 Dosen gmRPCs erhielten, was darauf hindeutet, dass entweder die Empfänger durch die anfänglichen gmRPC-Behandlungen nicht sensibilisiert wurden oder die Sensibilisierung subtil war. Die Ergebnisse der Immunmarkierung zeigten, dass alle fünf untersuchten Immunzelltypen, nämlich T-Zellen (CD3), B-Zellen (CD45R), Makrophagen (Iba-1), Neutrophile (Ly-6G) und natürliche Killerzellen ( CD49b) war in das Auge eingedrungen und hatte nach der Transplantation auf die RPC-Transplantate abgezielt. Dennoch war diese Infiltration relativ moderat und bestand, obwohl andere Zelltypen nachweisbar waren, überwiegend aus Iba-1-positiven Makrophagen. Es war eine sehr begrenzte Anzahl von T-Zellen, B-Zellen, Neutrophilen und natürlichen Killerzellen vorhanden. Interessanterweise war die Überlebensrate bei einzelnen und wiederholten RPC-Transplantaten gleichwertig, in beiden Fällen ohne Transplantatverlust, trotz der Anwesenheit von Makrophagen. Insgesamt deutet dies darauf hin, dass sowohl die angeborene als auch die adaptive Immunantwort auf genetisch unterschiedliche RPCs moderat waren, obwohl keine Immunsuppression eingesetzt wurde. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse des ELISPOT-Tests keine Antigen-Recall-Reaktionen in gmRPC-behandelten Gruppen, was mit der Behauptung übereinstimmt, dass T-Zellen bei der Abstoßung von gmRPC-Transplantaten von C57BL/6-Mäusen keine wichtige Rolle spielen. Auch hier wurde eine Makrophageninfiltration von gmRPC-Transplantaten beobachtet, die jedoch nicht mit einer signifikanten Transplantatzerstörung im Sinne einer klassischen Immunabstoßung einherging [22–24].

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Zusammengenommen offenbaren diese Beobachtungen eine Situation, die sich deutlich von den allgemein anerkannten T- und B-Zell-vermittelten allogenen Transplantatabstoßungsmechanismen unterscheidet, die in anderen Geweben beobachtet werden. Mehrere Faktoren können zu dieser Situation beitragen. Einerseits gibt es die Vorstellung, dass das Auge ein „immunprivilegierter“ Ort ist, auch wenn das Ausmaß, in dem der Glaskörper solche Eigenschaften mit der Hornhaut und der Netzhaut teilt, weniger untersucht und vielleicht umstrittener ist. Andererseits scheinen die RPCs selbst als Allotransplantate im Vergleich zu häufiger untersuchten Zelltypen eine geringere Immunogenität aufzuweisen. Wie wir zuvor gezeigt haben, fehlt in murinen RPCs die Grundexpression von MHC-Klasse-I- und -Klasse-II-Antigenen, obwohl diese durch Zytokinstimulation induzierbar sind. Dieses Fehlen einer MHC-Expression könnte zum Überleben dieser Zellen nach der Transplantation beitragen. Dennoch stützt das Vorhandensein von Immunzellen in den Transplantaten die Annahme, dass die Transplantattoleranz in diesem Fall nicht passiv ist und auf einem aktiven immunregulatorischen Phänomen beruht. Hier ist zu betonen, dass die gleiche Art der Infiltration von Immunzellen bereits nach Einzelinjektionen vorlag und durch wiederholte Gabe nicht verstärkt wurde. Dies unterstreicht unsere Schlussfolgerung, dass die Infiltration von Immunzellen in die Transplantate, insbesondere durch Makrophagen, nicht das Ergebnis einer früheren Injektion war Sensibilisierung des Wirts. Innerhalb der Parameter dieses Experiments schien eine wiederholte Gabe die allgemeine Lebensfähigkeit des Transplantats nicht zu beeinträchtigen, was mit der Möglichkeit einer anhaltenden Wirksamkeit im therapeutischen Kontext übereinstimmt. Alternative Parameter, wie z. B. unterschiedliche Intervalle zwischen den Injektionen, könnten die Aktivität der Immunzellen in einem Ausmaß erhöhen oder verringern, das für die klinische Anwendung relevant wäre. Ob die zellulären Bestandteile von Infiltraten, einschließlich des Vorherrschens von Makrophagen, auch auf den Menschen zutreffen würden, ist unklar. Darüber hinaus hängt das Überleben dieser Allotransplantate möglicherweise nicht von einer normalen Netzhaut mit einer gesunden Blut-Netzhaut-Schranke ab. Die hier verwendeten BALB/c-Empfänger sind Albinos und anfällig für leichte Schäden [30]. Darüber hinaus wurde in früheren Arbeiten mit verschiedenen Netzhautdegenerationsmodellen wiederholt ein anhaltendes Überleben beobachtet (z. B. [31]).

Im Vergleich zum Transplantatüberleben stellt die Lebensfähigkeit der Zellen innerhalb der Transplantate eine komplexere Situation dar. Es ist ein Verlust von ZNS-Vorläuferzellen bekannt, der schnell nach der Transplantation auftritt, wahrscheinlich aufgrund mehrerer Faktoren, einschließlich eines plötzlichen Entzugs des Wachstumsfaktors. Sobald sie sich im Auge angesiedelt haben, verschmelzen die dissoziierten Zellen zu kugelförmigen Aggregaten, deren Zentren eine suboptimale Mikroumgebung für das Wachstum zu bieten scheinen, möglicherweise aufgrund der fehlenden Vaskularisierung und der Herausforderungen bei der Nährstoffdiffusion. Der scheinbare Tropismus der Makrophagen für die RPC-Transplantate könnte eine unspezifische Reaktion auf das Vorhandensein dieser nicht lebensfähigen Zellen im Inneren der Transplantate sein, wobei die Makrophagen in ihrer Rolle als Aasfresser von Zelltrümmern fungieren. Alternativ könnten vollständig lebensfähige RPCs die Makrophagen aktiv anlocken, z. B. über die Expression chemoattraktiver Zytokine, woraufhin die Wirtszellen sekundär auf die Trümmer nicht lebensfähiger Spenderzellen stoßen würden. Wichtig ist, dass der Grad der Makrophageninfiltration, der in diesen besonderen Situationen beobachtet wird, im Gegensatz zu Reaktionen auf zelluläre Allotransplantate an nicht immunprivilegierten Stellen offenbar keine negativen Folgen für das Transplantat oder die Netzhaut des Wirts hat [4]. Abschließend ist zu erwähnen, dass die hier berichteten Ergebnisse, obwohl sie auf ein Mausmodell beschränkt sind, möglicherweise Auswirkungen auf die Arbeit am Menschen haben. Im Gegensatz zur Maus wissen wir, dass kultivierte menschliche RPCs zu Studienbeginn starke Mengen an MHC-Klasse-I-Antigenen exprimieren; Daher ist der Vergleich zugegebenermaßen vorläufig. Dennoch ist es interessant festzustellen, dass klinische Tests von subretinalen hRPC-Transplantaten durch eine Gruppe in China [13] sowie intravitreale hRPC-Transplantationen durch unsere Gruppe anschließend ein nachhaltiges Überleben der Allotransplantate bei nicht immunsupprimierten Patienten mit RP gezeigt haben (JC -01, [32], unveröffentlichte Daten). Dies war auch nach der sequentiellen Injektion beider Augen der Fall (JC-01 Extension, unveröffentlichte Daten), analog zu der hier vorgestellten Arbeit. Darüber hinaus wurde das Transplantatüberleben in einer Folgestudie zu JC-02 beobachtet [33], in der nacheinander wiederholte Dosen an dasselbe Auge verabreicht wurden [34]. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine Immunsuppression bei der Transplantation neuronaler Vorläuferzellen, insbesondere am Auge, nicht immer notwendig ist, obwohl die Grenzen dieses Phänomens und die zugrunde liegenden Regulierungsmechanismen noch geklärt werden müssen.

4. Materialien und Methoden

4.1. Zellkultur

Zuvor charakterisierte gmRPCs [31] wurden als Spenderzellen für diese allogene Studie ausgewählt. Ursprünglich wurden gmRPCs aus GFP-transgenen C57BL/6-Mäusen isoliert, die genetisch verändert wurden, um ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (GFP) zu exprimieren. Die Expression des GFP-Proteins in den gmRPCs war insofern von Interesse, als sie die Visualisierung von Transplantaten nach der Injektion ermöglicht, ohne dass eine zusätzliche Markierung erforderlich ist. Für die aktuelle Studie wurden gmRPCs in Advanced DMEM/F12, ergänzt mit N-2 Supplement (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, USA), Glutamax-1 (1:100, Life Technology), kultiviert , Carlsbad, CA, USA) und EGF (20 ng/ml, rekombinant, Human, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden in gemischten Suspensionen/locker befestigten Kolonien in unbeschichteten Gewebekulturflaschen gehalten. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung mit TrypLE Select CTS (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) passagiert, eine Minute lang 1:5 in PBS verdünnt und mit dem 10-fachen Volumen an zugesetztem Trypsin neutralisiert. Die Zell-Trypsin-Mischung wurde 2 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 140 g zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Zellpellet in frischem Medium resuspendiert, bevor es in der gewünschten Konzentration in Gewebekulturflaschen ausgesät wurde. Zellkonzentration und Lebensfähigkeit wurden mittels Trypanblau-Färbung bestimmt; Die Zählungen wurden von Countess (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) und einem Hämozytometer durchgeführt.

Für intravitreale Injektionen wurde das Zellpellet mit 50.000 Zellen/µL in BSS PLUS® resuspendiert. Zellkonzentration und Lebensfähigkeit wurden vor und nach den Injektionen bewertet. Die injizierte Dosis betrug 50 000 Zellen pro Auge und Injektion. Die Dosis und das Vehikel wurden auf der Grundlage unserer früheren Studien ausgewählt.

4.2. Versuchstiere

Der Zweck der aktuellen Studie bestand darin, die möglichen allogenen Immunantworten zu untersuchen, die durch wiederholte intravitreale Injektion allogener RPCs hervorgerufen werden. Die Empfängertiere waren BALB/c-Mäuse, die sich genetisch von den C57BL/6-Mäusen unterscheiden, aus denen die gmRPCs isoliert wurden. Die Verwendung von mindestens drei Tieren pro behandelter Versuchsgruppe zu jedem Zeitpunkt wurde als notwendig erachtet, um die Bewertung der statistischen Signifikanz zwischen den Gruppen in Bezug auf Ergebnisvariablen und potenzielle Tierverluste während des Versuchszeitraums zu ermöglichen. Darüber hinaus wurden angesichts der vielen zusätzlichen Faktoren, die das Versuchsergebnis potenziell beeinflussen könnten, wie z. B. ein erfolgloser Zellinjektionsvorgang oder ein möglicher Abrieb infolge von Tierkämpfen, Injektionsvorgänge an fünf Tieren pro Gruppe durchgeführt, um weiterhin sicherzustellen, dass die für die statistische Analyse erforderlichen Mindestzahlen erreicht werden.

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Tabelle 1 zeigt die vier Gruppen von Tieren, die für jeden der vier Zeitpunkte (4, 7, 14 und 28 Tage) vorbereitet wurden, an denen Bewertungen der Histopathologie, einschließlich Immunfluoreszenz, durchgeführt werden würden. Zwei zusätzliche Gruppen von Tieren, denen 10ˆ6 gmRPCs intraperitoneal injiziert wurden, wurden als Positivkontrollen für jeden der beiden ELISPOT-Bewertungszeitpunkte (14 und 28 Tage) vorbereitet. Tabelle 2 fasst die für jede Gruppe geplanten Bewertungen zusammen.

Tabelle 1. Experimentelle Gruppen.

Tabelle 2. Bewertungszeitpunkte.

4.3. Intravitreale Injektion

Die gmRPCs wurden über eine intravitreale Injektion verabreicht. Nach der Anästhesie wurden Mydriacyl (1 %ige Tropicamid-Augenlösung) und Phenylephrin (2,5 %ige Augenlösung) auf beide Augen des zu injizierenden Tieres aufgetragen. Wenn eine ausreichende Mydriasis erreicht war, wurde das Tier manuell festgehalten und der Kopf des Tieres gedreht, um die Augenachse des zu injizierenden Auges mit der Optik des Operationsmikroskops auszurichten und so den hinteren Augenabschnitt (d. h. Glaskörper und Netzhaut) sichtbar zu machen. . Das Auge wurde sanft manuell durch Druck auf die Augenlider vorgeschoben und eine 31G-Nadel auf einer Insulinspritze wurde verwendet, um vorsichtig die Sklera neben dem Limbus im unteren Nasenquadranten zu durchstechen. Eine Mikropipettenspitze aus poliertem Glas, die Spenderzellen (oder Vehikelkontrolle) enthielt, wurde unter direkter Sicht durch den Einschnitt in den Glaskörperhohlraum vorgeschoben. Es wurde darauf geachtet, die Integrität der Linse oder der Strukturen des hinteren Segments nicht zu beeinträchtigen. Die Zellen oder Träger allein wurden in einem Volumen von 1 Mikroliter injiziert. Nach einigen Augenblicken der Pause, um einen Ausgleich des Augeninnendrucks zu ermöglichen, wurde die Pipettenspitze nach und nach aus dem Auge entfernt, alles unter direkter Sicht. Eventuelle intraokulare Blutungen wurden zusammen mit der Lokalisation notiert. Nach der Injektion wurde das Tier zur Genesung in einen sauberen Käfig gelegt, der mit einer frischen Einwegunterlage mit der absorbierenden Seite nach oben bzw. der Kunststoffseite nach unten ausgelegt war. Die Genesung wurde durch die Verwendung eines Heizkissens erleichtert und durch die Gehfähigkeit des Tieres überprüft. Nach dem Aufwachen wurde das Tier in den postoperativen Käfig mit ad libitum Zugang zu Wasser überführt. Die Tiere wurden nach der Operation täglich visuell überwacht. Es wurden minimale oder keine Anzeichen im Zusammenhang mit der intraokularen Injektion beobachtet.

Nach dem Eingriff wurden die Tiere auf Reiben des operierten Auges, zerzaustes Fell oder anhaltende Lethargie beobachtet, alles Gründe für eine sofortige Euthanasie. Zwei Tiere wurden aufgrund von Verletzungen, die sie sich im Kampf zugezogen hatten, getötet. Alle anderen Tiere wurden an den geplanten Endpunkten getötet. Die Euthanasie erfolgte durch CO2-Inhalation.

4.4. Augenuntersuchung

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) und Reaktion auf Lichtstimulation. Als Ausgleich für den Verlust des Blinzelns wurde bei Bedarf eine Hypromelloselösung (Gonak) topisch auf beide Augen aufgetragen, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern. Für das bildgebende Verfahren wurden anästhesierte Tiere auf ein Heizkissen gelegt und in Brustlage positioniert. Am Ende des Eingriffs wurde eine teilweise Aufhebung der Anästhesie durch die Verabreichung von Atipamezol (0,1–1 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion erreicht.

4.5. Histopathologie

Die Immunantworten bei Tieren, die zwei aufeinanderfolgende Transplantate (eines in jedes Auge) erhielten, wurden anhand der Histopathologie beider Augen am Tag 4, Tag 7, Tag 14 und Tag 28 ± 1 nach der Injektion des zweiten Auges bewertet. Die gemäß Tabelle 1 behandelten Mäuse wurden nach dem in Tabelle 2 angegebenen Zeitplan getötet. Die Tiere wurden durch Kohlendioxidinhalation eingeschläfert. Bei den Versuchstieren wurden Herzperfusionen mit 2 % Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durchgeführt. Anschließend wurden alle Augäpfel gesammelt und 48 Stunden lang bei 4 °C in 2 % PFA/PBS eingeweicht. Die fixierten Augäpfel wurden vor dem Einbetten durch einen Saccharosegradienten verarbeitet (10 % Saccharose in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur, 20 % Saccharose in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur und 30 % Saccharose in PBS bei 4 °C über Nacht). OCT-Medien für Kryoschnitte. Kryoschnitte (10 µm) der Augen wurden mit Harrison-Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt, um die Mikroanatomie der Netzhaut sichtbar zu machen und die injizierten Spenderzellen zu lokalisieren.

Für die mit gmRPC behandelten Gruppen wurden Kryoschnitte mittels Immunfluoreszenz für GFP+-Zellen (Spenderzellen) ausgewertet. Die Identifizierung der in den Augen vorhandenen spezifischen Immunzelltypen erfolgte durch Markierung mit spezifischen Primärantikörpern für Folgendes: CD3 (T-Lymphozyten-Marker) [35], CD45R (B-Lymphozyten-Marker) [36], Iba-1 (aktivierter Makrophagen- und Mikroglia-Marker) [37], Ly-6G (Neutrophilen-Marker) [38] und CD49b (natürlicher Killerzell-Marker) [39]. Kryoschnitte wurden dreimal bei Raumtemperatur in PBS gewaschen und mit 0,03 % Triton X-100 und 10 % normalem Ziegenserum in PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) blockiert 1 Stunde bei Raumtemperatur. Ratten-Anti-Maus-CD3 (1:100-Verdünnung, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), Ratten-Anti-Maus-CD45R (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), Kaninchen-Anti-Maus-Iba{{ 26}} (Verdünnung 1:400, Wako Chemicals, Richmond, VA, USA), Ratten-Anti-Maus-Ly-6G (Verdünnung 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) und Ratten-Anti -Maus-CD49b (1:100-Verdünnung, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) wurden auf die Proben aufgetragen und über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Die Proben wurden erneut dreimal in PBS bei Raumtemperatur gewaschen. Alexa-Fluor-konjugierte Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Ratten-Alexa-Flour-568 und Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-Flour-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) wurden 1 Stunde lang auf die Proben aufgetragen bei Raumtemperatur. Anschließend wurden alle Proben noch dreimal bei Raumtemperatur in PBS gewaschen. Deckgläser wurden mit DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) montiert und die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur trocknen gelassen.

4.6. ELISPOT- und MLR-Assays

RPC-spezifische Gedächtnis-T-Zellen wurden 2 und 4 Wochen nach der ersten Transplantatplatzierung mittels eines ELISPOT-Assays (Enzyme-Linked Immunosorbent Spot) überwacht. Die Versuchsgruppen wurden für jeden Zeitpunkt wie in den Tabellen 1 und 2 gezeigt zusammengestellt. Der ELISPOT-Assay fängt sekretierte Proteine ​​auf einer mit spezifischen Antikörpern beschichteten Mikrotiterplatte ein und kann zur Bestimmung der Aktivierung von Gedächtnis-T-Zellen durch den Nachweis der IFN-Sekretion von T-Zellen verwendet werden. Der experimentelle Messwert ist die Anzahl der IFN-Spots auf der Mikroplatte. Die Anzahl der vorhandenen IFN-Spots gibt Aufschluss über die Anzahl der aktivierten T-Zellen. Die Häufigkeit alloreaktiver T-Zellen wurde durch Durchführung einer 48-stündigen gemischten Leukozytenreaktion (MLR) auf 96-Well-Multiscreen-IP-Platten (Millipore, Burlington, MA, USA) ermittelt. Responderzellen waren Lymphozyten/Splenozyten, die T-Zellen enthielten, die aus zervikalen Lymphknoten (CLNs) und der Milz der Versuchstiere gereinigt wurden, und Stimulatorzellen waren die gmRPCs, die ursprünglich von C57BL/6-Mäusen stammten. Die ELISPOT-Tests wurden auf der Grundlage eines Standardprotokolls durchgeführt. 96-well Multiscreen-IP-Platten wurden unter sterilen Bedingungen mit 15 µL 35 %igem Ethanol pro Well vorbenetzt. Die Platten wurden dreimal mit sterilem PBS gewaschen, bevor 100 µL des IFN-Fängerantikörpers (Klon AN-18, eBioscience, San Diego, CA, USA), verdünnt in PBS (2 µg/ml), auf die Platten aufgetragen wurden. Die Platten wurden über Nacht bei 4 Grad inkubiert, bevor die MLR-Tests auf den Platten durchgeführt wurden. Die mit Fängerantikörpern beschichteten Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und dann mit RPMI1640 für 2 Stunden bei 37 °C blockiert.

Jede der Testplatten enthielt die folgenden Kontrollen: Vertiefungen, die keine Zellen enthielten, Vertiefungen, die die Zellen ohne Stimulation enthielten, und Vertiefungen, die die Zellen mit Behandlungen von Phorbol {{0}}Myristat 13-Acetat (PMA) enthielten. und Ca-Ionophor als Positivkontrollen. Die PMA-Behandlung dient als Positivkontrolle, indem sie den Second Messenger DAG nachahmt, um den T-Zell-Rezeptorweg zu aktivieren und wiederum eine T-Zell-Aktivierung zu bewirken, wobei Ca-Ionophor den Eintritt von Kalziumionen in die Zellen erleichtert. Die Platten wurden vor der Farbreaktion 36 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden sechsmal mit PBS gewaschen, das {{10}}.01 % Tween 20 enthielt, und dann mit 100 µL Nachweisantikörper (Klon R64A2, eBioscience, San Diego, CA, USA) verdünnt in PBS (0,5 µg/ml) wurde auf jede Vertiefung aufgetragen. Die Platten wurden weitere 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden erneut mit 0,01 % Tween 20 in PBS gewaschen. 100 µL Streptavidin-AP (1:1000-Verdünnung, Invitrogen) wurden pro Vertiefung aufgetragen und die Platten wurden 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Alle Platten wurden erneut dreimal mit 0,01 % Tween 20 in PBS und weitere drei Mal nur mit PBS gewaschen. Schließlich wurden 100 µL BCIP/NBT (Sigma Aldrich, München, Deutschland) zur Färbung in jede Vertiefung gegeben. Alle Platten wurden vor der Datenanalyse gründlich mit Leitungswasser gewaschen und getrocknet.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

5. Schlussfolgerungen

Diese Studie zeigt, dass sequentielle binokulare Transplantationen allogener RPCs in die Glaskörperhöhle bei der Maus keine klassische Immunabstoßung hervorrufen. Obwohl anerkannt ist, dass diese allogenen histologischen Studien nicht mit klinischen RPC-Produkten am Menschen durchgeführt werden konnten, scheinen die Daten mit den Ergebnissen einer klinischen Sicherheitsstudie (jCyte, JC-01E, unveröffentlichte Daten) bei Patienten mit Retinitis übereinzustimmen pigmentosa erhielten nicht gleichzeitige bilaterale Injektionen ohne immunsuppressive Behandlung. Obwohl es schwierig ist, die beiden Studien direkt zu vergleichen, ist es bemerkenswert, dass die Gesamtergebnisse beider Studien Ähnlichkeiten hinsichtlich des Allotransplantat-Überlebens zeigten.

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