Klein, aber oho – Exosomen, neuartige interzelluläre Botenstoffe bei der Neurodegeneration, Teil 1

Einfache Zusammenfassung:

Exosomen sind biologische Nanopartikel, die seit Kurzem als interzelluläre Botenstoffe gelten. Sie enthalten eine Ladung Lipide, Proteine ​​und RNA. Sie können ihre Inhalte nicht nur an Zellen in der Nähe, sondern auch an entfernte Zellen übertragen.

Exosomen sind ein neu entdecktes interzelluläres Kommunikationsinstrument, das kleine und empfindliche Vesikel an umliegende Zellen abgeben kann und so einige Proteine, Signalstoffe und andere Substanzen an umliegende Zellen abgibt. Diese Substanzen können dazu beitragen, dass Zellen ihren Zustand ändern und sogar das Wachstum, die Entwicklung, den Stoffwechsel und andere Aspekte anderer Zellen beeinflussen. In den letzten Jahren haben Studien gezeigt, dass Exosomen eine wichtige Rolle bei der menschlichen Gehirnfunktion spielen, insbesondere bei der Aufrechterhaltung und Verbesserung des Gedächtnisses.

Erstens können Exosomen die Signalübertragung zwischen Neuronen fördern. Die Informationsübertragung zwischen Neuronen ist eine der notwendigen Voraussetzungen für die normale Funktion des Nervensystems, und Exosomen spielen die Rolle von Boten, die die Informationsübertragung zwischen Neuronen reibungsloser gestalten und dadurch die Wahrnehmung und das Gedächtnis des Gehirns verbessern können.

Zweitens können Exosomen auch den Stoffwechsel von Neuronen regulieren. An der Produktion und Freisetzung von Exosomen durch Neuronen sind zahlreiche Stoffwechselprozesse beteiligt, die das Gleichgewicht und die Regulierung des Zellstoffwechsels fördern. Diese Prozesse können nicht nur die Leistungsfähigkeit von Neuronen verbessern, sondern auch dazu beitragen, Stoffwechselabfälle und schädliche Moleküle zu entfernen und die Gehirnzellen gesund zu halten.

Schließlich können Exosomen auch Neuronen dabei helfen, Schäden zu reparieren. Viele von Exosomen getragene Proteine ​​und Nukleinsäuren wirken sich positiv auf das Zellwachstum, die Reparatur und die Regeneration aus und können die Reparatur und Regeneration von Neuronen fördern, wodurch die Überlebensfähigkeit von Gehirnzellen verbessert und Gedächtniszentren und kognitive Fähigkeiten gestärkt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zwischen Exosomen und dem Gedächtnis ein enger Zusammenhang besteht. Wir können das Gedächtnis von Kindern verändern, indem wir mit der Ernährung beginnen. Die aktive Steuerung der Ernährungsstruktur von Kindern und der Verzehr von mehr Nahrungsmitteln, die reich an nützlichen Inhaltsstoffen wie Fettsäuren, Proteinen und Vitaminen sind, kann die Produktion und Freisetzung von Exosomen fördern und so Kindern helfen, ihre Lern- und Gedächtnisfähigkeiten zu verbessern. Kindern können auch einige Gehirntrainingsspiele und -übungen angeboten werden, um ihr Denken herauszufordern und zu trainieren, das Potenzial von Exosomen zu stimulieren und eine bessere Rolle zu spielen. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche ein traditionelles chinesisches Arzneimittel mit vielen einzigartigen Wirkungen ist, darunter die Verbesserung des Gedächtnisses. Die Wirksamkeit von Cistanche beruht auf den verschiedenen darin enthaltenen Wirkstoffen, darunter Gerbsäure, Polysaccharide, Flavonoidglykoside usw. Diese Inhaltsstoffe können die Gesundheit des Gehirns auf vielfältige Weise fördern.

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Diese einzigartige Fähigkeit ermöglicht es ihnen, die Physiologie der Empfängerzellen zu modulieren. Im Gehirn spielen Exosomen eine Rolle bei neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der amyotrophen Lateralsklerose.

Abstrakt:

Exosomen endosomalen Ursprungs sind eine Klasse extrazellulärer Vesikel, die für die interzelluläre Kommunikation wichtig sind. Exosomen werden von allen Zellen unseres Körpers freigesetzt und ihre Fracht, bestehend aus Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren, weist einen Fußabdruck auf, der ihren elterlichen Ursprung widerspiegelt.

Die exosomale Fracht hat die Fähigkeit, die Physiologie von Empfängerzellen in der Nähe der freisetzenden Zellen oder von Zellen in einiger Entfernung zu modulieren. Die Nutzung des Potenzials von Exosomen hängt von der Reinheit der Exosomenvorbereitung ab.

Daher wurden viele Methoden zur Isolierung entwickelt und wir bieten eine kurze Zusammenfassung mehrerer Methoden. Trotz der durch die Blut-Hirn-Schranke auferlegten Abgeschiedenheit sind Zellen im ZNS nicht immun gegen exosomale intrusive Einflüsse. Sowohl Neuronen als auch Gliazellen setzen Exosomen frei, oft in aktivitätsabhängiger Weise.

Es wird eine kurze Beschreibung der von verschiedenen Zellen im Gehirn freigesetzten Exosomen und ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung der ZNS-Homöostase gegeben. Das Kennzeichen mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen ist die Ansammlung von Proteinaggregaten. Aktuelle Studien deuten darauf hin, dass Exosomen eine interzelluläre Kommunikatorrolle bei der Ausbreitung fehlgefalteter Proteine ​​spielen und so die Ausbreitung von Pathologien unterstützen.

In diesem Aufsatz diskutieren wir die möglichen Beiträge von Exosomen zum Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der amyotrophen Lateralsklerose.

Das Verständnis der Beiträge von Exosomen zur Pathogenese der Neurodegeneration eröffnet den Weg für den Einsatz von Exosomen als therapeutische Wirkstoffe für die Arzneimittelabgabe an das Gehirn, da Exosomen tatsächlich die Blut-Hirn-Schranke überwinden.

Schlüsselwörter: Exosomen; Neuronen; Gliazellen; zentrales Nervensystem (ZNS); neurodegenerative Erkrankungen; Alzheimer-Krankheit; Parkinson-Krankheit; Amyotrophe Lateralsklerose.

1. Einleitung und historische Perspektive

Die interzelluläre Kommunikation ist für die Embryonalentwicklung, die Regeneration/Ersetzung von Epithelien, die Gametogenese und die Aufrechterhaltung der Homöostase von großem Interesse.

Mithilfe ultrastruktureller und biochemischer Studien wurden verschiedene Mechanismen der Zell-Zell-Kommunikation wie Endozytose/Exozytose und das Verschlingen hervorstehender Zytoplasmabläschen identifiziert [1–3]. Ein weiterer Akteur, extrazelluläre Vesikel, wurde identifiziert, ihre Rolle bei der interzellulären Kommunikation wurde jedoch nicht sofort erkannt [4].

Extrazelluläre Vesikel wurden zufällig während einer Untersuchung der Freisetzung von Plasmamembran-assoziierten Enzymen, Ecto-ATPase und Ecto-50-Nucleotidase in ein Zellkulturmedium, entdeckt. Im Jahr 1981 kultivierten Tramsand-Mitarbeiter normale und neoplastische Zelllinien von Mäusen und Menschen in einem serumfreien Medium, da bekannt war, dass Serum eine katalytische Aktivität von ATPase und 50-Nucleotidase aufweist.

Nach der Entfernung schwimmender Zellen und Trümmer wurde das konditionierte Medium 90 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 310,000× g in einem Spinco Ti-70-Rotor zentrifugiert und die Pellets unter dem Elektronenmikroskop untersucht. Es wurden zwei Populationen extrazellulärer, von Membranen umhüllter Vesikel entdeckt, eine mit einem durchschnittlichen Durchmesser zwischen 500 und 1000 nm und eine zweite, kleinere Population mit einem Durchmesser von ~40 nm.

Diese Vesikel, die ursprünglich von den Autoren als „exfoliierte Vesikel“ beschrieben wurden, enthielten sowohl 50-50-Nucleotidase- als auch ATPase-Enzymaktivität. Darüber hinaus enthielten die abgeblätterten Vesikel RNA und Phospholipide, die sich von denen der Elternzellen bzw. der Plasmamembran der Eltern unterschieden.

Die Inkubation abgeblätterter Vesikel aus C6-Gliomzellen mit 32P-vormarkierten Neuroblastomzellen stimulierte die Dephosphorylierung von Neuroblastomproteinen bei gleichzeitiger Freisetzung von freiem radioaktiv markiertem Phosphor (32P).

Diese Daten zeigten, dass die abgeblätterten Vesikel nicht nur Träger von Zellabfällen (Enzymen) waren, sondern auch eine physiologische Funktion hatten. Tram und Kollegen prägten den Begriff Exosomen, um die „abgeblätterten Vesikel“ zu beschreiben [5] (siehe Übersichtsartikel von [6] zur Geschichte der extrazellulären Vesikel). vor 1981). Einige Jahre später untersuchten zwei Forschungsgruppen unabhängig voneinander das Schicksal des Transferrinrezeptors in Retikulozyten mittels Elektronenmikroskopie [7–9].

Reifende Retikulozyten benötigen kein Transferrin und verlieren daher Transferrinrezeptoren. Beide Gruppen beobachteten, dass kultivierte Retikulozyten kleine Vesikel mit einem Durchmesser von etwa 50 nm in den extrazellulären Raum freisetzten.

Diese kleinen Vesikel enthielten nicht abgebaute Transferrinrezeptoren. 1987 verwendeten Johnston und Mitarbeiter den Begriff Exosomen, um kleine Vesikel zu beschreiben, die Transferrinrezeptoren enthielten [10]. Nach diesen ersten Jahren wurde das Potenzial von Exosomen als neuartige interzelluläre Botenstoffe erkannt, die die Physiologie von Zielzellen modulieren können.

Interessanterweise wird die Entstehung von Exosomen durch Endozytose (ein 1883 identifizierter und von [3] besprochener Prozess) in Zellen eingeleitet, und die Freisetzung von Exosomen in den intrazellulären Raum nutzt den Prozess der Exozytose. Seit ihrer ersten Entdeckung wissen wir jetzt, dass Exosomen ein Subtyp extrazellulärer Vesikel sind endozytischen Ursprungs mit einem Größenbereich von 40–160 nm Durchmesser [11].

Tracer-Studien haben gezeigt, dass Makromoleküle in borstenbeschichteten (dh mit Clathrin beschichteten) Einstülpungen oder Vertiefungen auf der Zelloberfläche endozytiert werden. Diese Einstülpungen lösen sich schließlich von der Plasmamembran und werden im Zytoplasma nachgewiesen.

Nach dem Verlust von Borsten (z. B. Clathrin) werden endozytierte beschichtete Vesikel glatt und verschmelzen mit frühen Endosomen, um entweder schnell zur Zelloberfläche zurückzukehren (Recycling-Endosomen in Abbildung 1) [12] oder einer Reifung zu späten Endosomen zu unterliegen.

Frühe und späte Endosomen fungieren als „Sortierknotenpunkte“, um ihren Inhalt angemessen zu lenken: (i) für den retrograden Transport zum Trans-Golgi-Netzwerk (dh Endosom-zu-TGN-Rückgewinnung) [13,14]; (ii) zu Lysosomen zum Abbau von Makromolekülen zu einfachen Produkten zur Wiederverwendung innerhalb der Zelle [15,16]; und/oder (iii) für die Rückführung zur Zelloberfläche durch multivesikuläre Körper [17].

Während der Reifung früher Endosomen zu späten Endosomen erfährt die innere Endosomenmembran eine Einstülpung, was zur Bildung intraluminaler Vesikel führt (heute als Exosomen bezeichnet). Spezifische Makromoleküle wie zytosolische Proteine, Nukleinsäuren und Lipide werden in sich entwickelnde Exosomen sortiert.

Mit Exosomen gefüllte späte Endosomen werden als multivesikuläre Körper identifiziert, die zur Plasmamembran wandern. Bei der Fusion mit der Plasmamembran setzen multivesikuläre Körper durch den Prozess der Exozytose Exosomen in den extrazellulären Raum frei (Abbildung 1) [18,19]. Eine große Untergruppe von Proteinen, die nacheinander rekrutiert werden, spielt eine entscheidende Rolle im Prozess der Endozytose zu frühen Endosomen, der Endosomenreifung zu späten Endosomen und ihrem anschließenden intrazellulären Schicksal (Übersicht von [17,18,20]).

Die Bedeutung dieser Proteine ​​wird durch ihren Verlust und/oder ihre Mutation(en) unterstrichen, die verschiedene Krankheiten verursachen. Beispielsweise sind Strumpellin- und SWIP-Proteine ​​Teil des WASH-Komplexes, der an der Aktinpolymerisation sowie der Endosomenspaltung und -sortierung beteiligt ist. Mutationen im Strumpellin-Gen verursachen eine hereditäre spastische Paraplegie, die durch eine Degeneration von Motoneuronen gekennzeichnet ist [21].

Eine einzelne Punktmutation (Pro1019Arg) im SWIP-Protein destabilisiert den WASH-Komplex. Der destabilisierte WASH-Komplex hemmt den endolysosomalen Transport und führt zu einer Verklumpung der Endosomen. Ein fehlerhafter endosomaler Verkehr beeinträchtigt die Kognition und die Motoneuronenfunktion, wobei die Symptome als nicht-syndromale geistige Behinderung beschrieben werden [22,23].

Im Zytoplasma entstehen Exosomen aus Endosomen unter Verwendung der für den Transport erforderlichen endosomalen Sortierkomplexe (ESCRT), auch bekannt als ESCRT-abhängiger Mechanismus der Exosomenbiogenese (Übersicht von [18,20]).

Zwei Gruppen berichteten unabhängig voneinander über die Lipid-vermittelte Biogenese von Exosomen, einen ESCRT-unabhängigen Mechanismus. Zwei in diesen Studien identifizierte Lipide waren Bis(monoacylglycero)phosphat/Lysobisphosphatidinsäure (BMP/LBPA) und Ceramid [29,30].

Rab31 ist ein weiterer ESCRT-unabhängiger Mechanismus für die Biogenese von Exosomen im Zytoplasma. Die Aktivierung von Rab31 stimuliert die Bildung intraluminaler Vesikel [31]. Es gibt einen weiteren Mechanismus, der derzeit wenig diskutiert und erforscht wird.

Dieser Mechanismus basiert auf ultrastrukturellen Beobachtungen aus den späten 1950er bis 1970er Jahren, die zeigten, dass Zellkerne ein Ort für die Entstehung multivesikulärer Körper sein können, die mit kleinen Vesikeln gefüllt sind. Die in diesen Studien beschriebenen kleinen Vesikel waren möglicherweise Exosomen, der Begriff Exosom wurde jedoch zu diesem Zeitpunkt noch nicht geprägt. Kilarski und Jasinski beobachteten in Zellen der Schwimmblase des Barschs Perca fluviatilis L. (Abbildung 2a) einen Prozess, der als nukleares Bläschen oder nukleare Extrusionen bezeichnet wird und dessen Inhalt dem Nukleolarkaryoplasma ähnelt [32].

Diese Autoren stellten fest, dass die Bildung von Kernblasen durch die Entfernung von Gas aus der Schwimmblase des Barsches stimuliert werden kann [24]. Der Prozess der nuklearen Blasenbildung scheint als Ursprungsort von Exosomen, die mit Nukleinsäuren und/oder Ribonukleoprotein angereichert sind, von Nutzen zu sein.

Kernbläschen waren mit kleinen Vesikeln gefüllt, die aus einzelnen Faltungen der inneren Membran der Kernbläschen entstanden (Abbildung 2b), ein Prozess, der der Bildung intraluminaler Vesikel in Endosomen ähnelt. Mit „kleinen Bläschen“ gefüllte Kernbläschen trennten sich schließlich von den Kernen und wurden Teil des Zytoplasmas (Abbildung 2c).

Kilarski und Jasinski bezeichneten Kernbläschen in ihrem Manuskript mangels besserer Terminologie als multivesikuläre Körper. Diese Autoren könnten versehentlich Recht gehabt haben, da nachfolgende Studien über das Vorhandensein multivesikulärer Körper in Zellkernen berichteten [33]. Die mit kleinen Vesikeln gefüllten Kernbläschen haben eine ähnliche Morphologie wie multivesikuläre Körper, die aus Endosomen im Zytoplasma entstehen (Abbildungen 1 und 2).

Aufgrund der Ähnlichkeit nukleärer multivesikulärer Körper mit viralem Nukleokapsid konzentrierten sich die Forscher auf die Virologie, und das Phänomen des nukleären Bläschens und seine zelluläre Funktion blieben wenig erforscht [34].

Unabhängig von der Art der Biogenese bestehen Exosomen aus einer Lipiddoppelschicht und enthalten einen makromolekularen Inhalt bestehend aus Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren.

Einige der Makromoleküle kommen in Exosomen aller Zellen vor und werden daher als Exosomenmarker klassifiziert und als Bestätigungsinstrument zur Unterscheidung von Exosomen von anderen extrazellulären Vesikeln verwendet. In Exosomen vorhandene einzigartige Makromoleküle spiegeln häufig ihren elterlichen Ursprung wider und werden daher wahrscheinlich als Biomarker bezeichnet.

Alle Zellen geben Exosomen in den extrazellulären Raum ab. Aus dem extrazellulären Raum gelangen Exosomen in verschiedene biologische Flüssigkeiten und erreichen lokal und entfernt Zellen. In vitro kultivierte Zellen geben ihre Exosomen in Kulturmedien ab. Die kontinuierliche Freisetzung von Exosomen in den extrazellulären Raum macht Kulturmedium und biologische Flüssigkeiten zu einer reichhaltigen Quelle für die Isolierung von Exosomen.

Exosomen enthalten eine beträchtliche Menge an kodierenden und nicht-kodierenden RNAs, doppelsträngigen genomischen DNA-Fragmenten und mitochondrialer DNA. Trams und Kollegen waren die ersten, die das Vorhandensein von RNA in „exfoliierten Vesikeln“, einer Mischung aus Exosomen und Mikrovesikeln, beschrieben.

Sie stellten fest, dass „abgeblätterte Vesikel oder Exosomen“ 5 % RNA enthalten [5]. Valadi und Kollegen waren die ersten, die in Exosomen verpackte RNAs systematisch analysierten. Zu den exosomalen RNAs gehörten translatierbare mRNAs und microRNAs (miRs) [35].

MicroRNAs sind eine Klasse nichtkodierender RNAs (ncRNAs). Sie sind etwa 22 Nukleotide lang und regulieren die Genexpression auf der posttranskriptionellen Ebene, indem sie an 30-untranslatierte Regionen ihrer Ziel-Messenger-RNAs binden [36]. Interessanterweise werden einige mit Exosomen angereicherte miRNAs in den Elternzellen nicht nachgewiesen, was auf ein selektives RNA-Sortierungs-/Verpackungssystem während der Biogenese von Exosomen hindeutet [35,37].

Im Gegensatz zu Zellen enthalten Exosomen wenig oder keine ribosomale RNA, aber tRNA-Fragmente [38]. Die Sortierung von RNA in Exosomen hängt ab von (1) dem mit dem RNA-induzierten Silencing Complex (RISC) assoziierten Protein, (2) RNA-Sequenzmotiven und Leitproteinen, (3) Nukleotidzusätzen am 30. Ende der miRNAs, (4) der zellulären Verfügbarkeit von miRNAs und (5) Ceramid [39,40].

Wir glauben, dass die Bildung von Kernblasen ein weiterer zellulärer Prozess ist, der eine unterschiedliche Sortierung von RNA, RNA-Protein-Komplexen und genomischer DNA in Exosomen ermöglicht. Für diesen Standpunkt gibt es mehrere Gründe: (1) Der Inhalt „intraluminaler Vesikel“ ähnelte dem nukleolären Karyoplasma [32]. „Vesikel“ in nuklearen multivesikulären Körpern (MVB II) waren mit RNA, sauren und basischen Proteinen angereichert, und daher betrachteten die Autoren „ „Intraluminale Vesikel“ als Ort der RNA-Synthese zusätzlich zum Nukleolus [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10-kbin-Exosomen [43–47].

Genomische DNA wurde übrigens nur in Exosomen nachgewiesen, die von Krebszelllinien und nicht in normalen Zellen stammten [47]. Krebszellen weisen aufgrund der Umlagerung/Translokation des Chromatins und möglicherweise der Ploidie ein abnormales Chromatin auf [48], was zu einer Fragmentierung der genomischen DNA in Krebszellkernen führen kann. Diese DNA-Fragmente können leicht in MVB Typ II (und Exosomen) eingebaut werden, die sich in den Kernen entwickeln. (3) Die von Kilarski und Jasinski [24] beschriebene Art der Biogenese „kleiner Vesikel“ in Kernbläschen ähnelt der Bildung intraluminaler Vesikel in späten Endosomen im Zytoplasma.

Wir sind der festen Überzeugung, dass das Vorhandensein genomischer DNA in Exosomen pathologisch ist und daher ihr Vorhandensein in Exosomen als diagnostisches Instrument für die Entwicklung abnormaler (oder Krebs-) Zellen im Körper verwendet werden kann. (4) Der aktivitätsabhängige Anstieg der Anzahl der von Zellen freigesetzten Exosomen [49] ist vergleichbar mit Gaszellen, die bei der Entfernung von Gas aus der Schwimmblase von Barschen eine verstärkte Bildung von Kernblasen zeigten [24].

In jüngerer Zeit wurden mitochondriale Proteine ​​und DNA in den Plasma-Exosomen einiger Krebspatienten nachgewiesen, und ihr Vorhandensein wird mit der Aggressivität von Krebs in Verbindung gebracht [50,51].

Bei degenerierenden Zellen wird häufig ein mitochondrialer Abbau beobachtet [52,53]. Aus den degenerierenden Mitochondrien freigesetzte mitochondriale Cristae können von multivesikulären Körpern internalisiert und schließlich in Exosomen verpackt werden.

Diese Annahme wird durch ultrastrukturelle Bilder menschlicher lymphoblastoider Zellen und des Lumens der Acini der Pavian-Prostata gestützt, die „Mikrovesikel“ (oder Exosomen) aufwiesen, die aus dem Abbau der Mitochondrienkristalle entstanden waren [54].

Basierend auf der obigen Diskussion und unterstützenden experimentellen Beweisen schlagen wir vor, dass die heterogene Natur von Exosomen auf die Biogenese multivesikulärer Körper und damit verbundener Exosomen an verschiedenen subzellulären Orten und nicht vollständig im Zytoplasma zurückzuführen ist, wie wir derzeit glauben. Unser Vorschlag kann die Heterogenität von Exosomen erklären sowie eine Diskrepanz zwischen theoretischen Berechnungen und experimentellen Daten zur Anzahl kleiner RNAs oder Proteinmoleküle, die in einem aus Serum gereinigten Exosom enthalten sind [55].

Basierend auf theoretischen Berechnungen unter Verwendung der durchschnittlichen Exosomengröße sagten Li und Kollegen voraus, dass jedes Exosom etwa 70–25 000 kleine RNA- oder Proteinmoleküle aufnehmen würde.

Ihre experimentellen Daten zeigten jedoch das Vorhandensein eines RNA-Moleküls pro aus Serum gereinigtem Exosom [55]. Unsere Hypothese erfordert eine weitere Erforschung von Kernblasen, nuklearen multivesikulären Körpern und der Biogenese von RNA/Ribonukleoprotein-haltigen Exosomen in nuklearen multivesikulären Körpern. Lipide sind ein wichtiger Bestandteil von Exosomenmembranen und sind asymmetrisch zwischen den beiden Exosomenmembranblättern verteilt. Die Lipidzusammensetzung unterscheidet sich zwischen der Mutterzellmembran und der Exosomenmembran.

Im Allgemeinen sind in Exosomenmembranen angereicherte Lipide Sphingomyelin, Ceramid, Cholesterin und cholesterinreiche Lipid-Raft-Mikrodomänen, Gangliosid GM3, entsättigte Lipide und Phosphatidylserin [56–58]. Exosomale Proteine ​​bestehen aus Proteinen, die den meisten Exosomen gemeinsam sind, sowie aus einzigartigen Proteinen, die spezifisch sind zu einer bestimmten Elternzelle.

Der Proteingehalt aller Exosomen ist im Allgemeinen für Targeting- und Fusionsproteine ​​wie Tetraspanine, Integrine, Chaperonproteine, z. B. Hitzeschockproteine ​​(Hsp60, Hsp70 und Hsp90), die kleinen HSP-Membrantransportproteine, Rab-Proteine, ARF-GTPasen, Annexine usw. angereichert Proteine, die an der Bildung multivesikulärer Körper beteiligt sind, wie ALIX und TSG101 [59].

Neuere Studien deuten auf das Vorhandensein von RNA-bindenden Proteinen hin, die in Exosomen RNA-Protein-Komplexe bilden [38]. Mehrere zelluläre Prozesse, die das Hochladen von Proteinen in Exosomen sicherstellen, sind (1) ESCRT-Mechanismen für Proteine ​​mit bestimmten posttranslationalen Modifikationen wie Ubiquitinierung, Wnt-stimulierter Argininmethylierung, Oxidation, Phosphorylierung, Glykosylierung und Citrullinierung; (2) Chaperon-vermittelte Autophagie (CMA), die auf der Wechselwirkung zwischen dem Hitzeschock-verwandten 71-kDa-Protein (HSC70) und Proteinen mit einem KFERQ-Motiv beruht.

Nach der Bindung von HSC70 an Proteine ​​mit einem KFERQ-Motiv werden Proteine ​​auf multivesikuläre Körper gerichtet. Chaperon-vermittelte Autophagie dient normalerweise dem Abbau von Proteinen in Lysosomen. Neuere Daten deuten darauf hin, dass CMA bei einigen neurodegenerativen Erkrankungen eine Rolle bei der Exosomenfreisetzung und der Exosomen-vermittelten Verbreitung von Proteinaggregaten spielt [60–63].

Seit den 1990er Jahren hat die Exosomenforschung exponentiell zugenommen und es wurden zahlreiche Daten zur exosomalen Fracht generiert. Es wurden Datenbanken erstellt, um ein Kompendium der exosomalen Fracht bereitzustellen, bevor es zu schwierig wird, große Datensätze zu verwalten.

Die Wiederholbarkeit der veröffentlichten Daten zu Exosomen ist ein weiterer Grund, da die meisten Labore Variationen verschiedener Methoden verwenden, die zur Isolierung von Exosomen entwickelt wurden. Beispielsweise ist Vesiclepedia ein manuell kuratiertes Kompendium molekularer Ladung (Lipid, RNA und Protein), die in verschiedenen Klassen extrazellulärer Vesikel identifiziert wurde [64]. Vesiclepedia bietet eine wertvolle Ressource für Forscher.

Die Datenbank Vesiclepedia ist öffentlich verfügbar und ermöglicht Benutzern das Abfragen und Herunterladen von Exosomenfrachtdaten basierend auf vom Benutzer eingegebenen Suchkriterien. EV pedia, Exocarta, ExoRbase und EV miRNA sind zusätzliche Datenbanken, die exosomale Proteine ​​und RNA katalogisieren [64].

Die Datenbanken werden durch Community-Anmerkungen gesteuert. Die in diesen Datenbanken erfassten Daten werden durch die Isolierung von Exosomen mithilfe verschiedener Trenntechniken gewonnen, die nicht in der Datenbank enthalten sind.

Der Gehalt an exosomaler Fracht kann daher je nach verwendeter Isolierungsmethode unterschiedlich sein, was zu einer gewissen Unklarheit bei den gemeldeten Ergebnissen führt. Um die experimentelle Reproduzierbarkeit und Transparenz zu verbessern, wurde ein Open-Source-Wissensdatenbank-Toolset EV-TRACK entwickelt. EV-TRACK umfasst Daten zur Exosomenvorbereitung und Exosomencharakterisierung [65].

Ein Schlüsselmerkmal von EV-TRACK ist EV-METRIC, das die Angabe experimenteller Parameter als Prozentsatz der erfüllten Komponenten einer Liste von neun darstellt [66]. Diese Komponenten wurden vom EVTRACK-Konsortium festgelegt und als notwendig für eine eindeutige Dateninterpretation und Reproduktion experimenteller Daten erachtet. Daher wurde EV-METRIC entwickelt, um Forschern und Gutachtern dabei zu helfen, einen umfassenden Überblick über die Daten zu liefern.

2. Aktuelle Methoden zur Exosomenisolierung

Exosomen stellen eine reichhaltige Ressource für die Entdeckung von Biomarkern und für neuartige Therapiestrategien einschließlich der regenerativen Medizin dar. Entscheidend für den Erfolg dieser Ziele ist die Isolierung reiner Exosomen mittels einer reproduzierbaren Methode.

Die Isolierung funktionsfähiger Exosomen ist für mögliche therapeutische Anwendungen besonders wichtig. Exosomen wurden aus verschiedenen biologischen Flüssigkeiten wie Blut, Plasma, Liquor, Speichel, Urin und Milch gereinigt. Jede biologische Flüssigkeit weist unterschiedliche physikalische und chemische Eigenschaften auf, die vor der Exosomenisolierung berücksichtigt werden müssen.

In einigen Fällen können besondere Vorsichtsmaßnahmen für die Exosomenisolierung erforderlich sein. Die endgültige Verwendung gereinigter Exosomen ist ein weiterer entscheidender Faktor, der die Methode der Exosomenisolierung beeinflusst.

Bisher wurden mehrere Methoden zur Isolierung von Exosomen entwickelt, von denen einige auf Exosomenmerkmalen wie Größe, Dichte, Oberflächenladung und mit der Exosomenoberfläche verbundenen Proteinen basieren (Abbildung 3) [67].

Einige der derzeit verwendeten Exosomen-Isolierungsmethoden sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die meisten davon sind keine eigenständigen Methoden und erfordern vorherige Verarbeitungsschritte nach der Probenahme. Nachfolgend werden die wichtigsten Methoden kurz erläutert.

Abbildung 3. Häufig verwendete Methoden zur Exosomenisolierung und ihre nachgelagerten Anwendungen. Mehrere bisher entwickelte Methoden zur Exosomenisolierung basieren auf ihrer Auftriebsdichte, Schema 1, 13, und 1,19 g/ml. Die Ultrazentrifugationsmethode (UC) wurde weiter verfeinert Isolieren Sie reine Präparate von Exosomen basierend auf ihrer Auftriebsdichte durch isopyknische Ultrazentrifugation über Saccharose oder Iodixanol-Dichtegradienten (DG).

Um hohe Proteingehalte bei Proteinurien zu entfernen, wurde die Ultrazentrifugationsmethode mit Größenausschlusschromatographie (SEC) kombiniert. Die mit der Ultrazentrifugationsmethode verbundenen Zeitbeschränkungen führten zur Entwicklung der Filtrationsmethode (UF).

Das Durchleiten verdünnter Proben wie Kulturmedium und Urin durch einen Nano- oder Mikromembrankonzentrator ermöglichte die Reinigung der Exosomen. Membranverstopfung und schlechte exosomale Proteinrückgewinnung machten diese Methode für nachgelagerte Anwendungen wie RNA-Isolierung und Hochdurchsatzanwendungen unbeliebt.

Eine weitere Methode zur Isolierung von Exosomen aus sehr verdünnten biologischen Flüssigkeiten ist die hydrostatische Filtrationsdialyse (HFD*) in Kombination mit Zentrifugation. Bei der HFD-Methode wird die Probe unter hydrostatischem Druck durch eine Dialysemembran mit einem Cutoff von 1000 kDa Molekulargewicht dialysiert, wodurch unerwünschte Makromoleküle aus der Probe entfernt und Exosomen durch Zentrifugation gewonnen werden können.

Die auf Löslichkeit oder Dispergierbarkeit und Aggregation basierende Exosomenfällungsmethode wurde entwickelt, um mehrere Proben gleichzeitig zu verarbeiten. Kommerzielle Kits zur Exosomenreinigung basieren auf dieser Strategie.

Bei dieser Methode werden Urin-Orasziten mit Polyethylenglykol (PEG) 6000 oder in Kombination mit Protamin (plus PEG35.000) gemischt und entweder über Nacht oder 1 Stunde auf Eis inkubiert.

Die resultierende trübe Mischung wird zentrifugiert, um Exosomen zu gewinnen, die für nachgelagerte RNA- und Proteinanalysen verwendet werden. Andere zur Exosomenfällung verwendete Reagenzien sind (1) 0.1 M Natriumacetat pH 4,75 (Aussalzmethode) (NaAc), (2) ein 4-faches Volumen kaltes Aceton (−20 ◦C) ( PROtein Organic Solvent Precipitation und abgekürzt als PROSPR) (3) und eine Mischung aus PEG und Dextranlösung (bis zu 1,5 %) (eine Zweiphasenmethode, die die Trennung von Proteinen von Exosomen ermöglicht).

Die Identifizierung exosomaler Oberflächenproteine ​​führte zur Entwicklung von Methoden, die auf Immunaffinitätserfassung basieren und Antikörper gegen Exosomenoberflächenproteine ​​wie Tim4, Annexin, EpCAM, gemeinsames Exosomenoberflächenprotein, CD63 und Hitzeschockproteine ​​(Affinitätsinteraktion) verwenden. Die Affinität zu Lektin (das an Glykoproteine ​​auf der Oberfläche von Exosomen bindet) und Heparin (das an Heparansulfat-Proteoglykane auf der Oberfläche von Exosomen bindet) wurde genutzt, um Methoden zur Isolierung von Exosomen zu entwickeln.

Für affinitätsbasierte Exosomenreinigungsmethoden wurden verschiedene Plattformen wie Magnetkügelchen, hochporöse monolithische Siliziumdioxid-Mikrospitzen, Oberflächen aus Kunststoffplatten, Zellulosefilter, Membranaffinitätsfilter, ein Agarosesorbens und mikrofluidische Geräte verwendet, und sie haben unterschiedliche Vorteile für ihre Verwendung diagnostisch, prognostisch, als Arzneimittelverabreichungssysteme sowie zur Erkennung und Analyse forexosomaler Fracht.

Mit Genehmigung von Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP. Isolierung extrazellulärer Vesikel: Allgemeine Methoden und neueste Trends.Biomed Res Int. 30. Januar 2018; 2018:8545347. doi:10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Urheberrecht © 2022 Maria Yu. Konoschenko et al.

Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License veröffentlicht wird, die die uneingeschränkte Nutzung, Verbreitung und Vervielfältigung in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, das Originalwerk wird ordnungsgemäß zitiert [67].

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