Strukturelles Design, Synthese und Antioxidationsmittel, Antileishmania, entzündungshemmende und krebsbekämpfende Aktivitäten eines neuartigen Quercetin-acetylierten Derivats

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Abstrakt: Quercetin(Q) ist ein Bioflavonoid mit biologischem Potenzial; jedoch schränken eine schlechte Löslichkeit in Wasser, ein umfangreicher enzymatischer Metabolismus und eine reduzierte Bioverfügbarkeit seine biopharmakologische Verwendung ein. Das Ziel dieser Studie war es, eine strukturelle Modifikation bei der Qby-Acetylierung durchzuführen und so das Quercetinpentaacetat (Q5)-Analogon zu erhalten, um die biologischen Potenziale (antioxidative, antileishmanische, entzündungshemmende und zytotoxische Aktivitäten) in Zellkulturen zu untersuchen. Q5 wurde durch FTIR-, 'H- und 13C-NMR-Spektren charakterisiert. DasAntioxidansDas Potenzial wurde gegen das Radikal ABTS· plus bewertet. Das entzündungshemmende Potenzial wurde durch Messung des entzündungsfördernden Zytokins Tumornekrosefaktor (TNF) und der Produktion von Stickoxid (NO) in peritonealen Makrophagen von BALB/c-Mäusen bewertet. Zytotoxizitätstests wurden mit der AlamarBlue-Methode an den Krebszellen HepG2 (menschliches Leberkarzinom), HL-60 (Promyelozytenleukämie) und MCR-5 (gesunde menschliche Lungenfibroblasten) sowie mit der MTT-Methode für C6-Zellen durchgeführt Kulturen (Rattengliom). Q und Q5 zeigten eine antioxidative Aktivität von 29 Prozent bzw. 18 Prozent, was durch den Ersatz von Hydroxylgruppen durch Acetylgruppen gerechtfertigt ist. Q und Q5 zeigten konzentrationsabhängige Reduktionen der NO- und TNF-Produktion (S<0.05); q="" and="" q5="" showed="" higher="" activity="" at="" concentrations="">40μM when compared to dexamethasone （20 μM）. For the HL-60 lineage, Q5 demonstrated selectivity, inducing death in cancer cells, when compared to the healthy cell line MRC-5（IC50>80 μM）. Schließlich wurde die zytotoxische Überlegenheit von Q5 verifiziert （IC50=11 μM）, das bei 50 μM für 24 h Veränderungen in der Morphologie von C6-Gliomzellen induzierte, die durch eine runde Körperform gekennzeichnet waren (noch nicht in der Literatur berichtet ). Das Analogon Q5 hatte potenzielle biologische Wirkungen und könnte für weitere Untersuchungen gegen andere Zellkulturen, insbesondere neurale, vielversprechend sein.

Schlüsselwörter: Quercetin;Synthese; Quercetinpentaacetat; Antioxidans; Antileishmania; entzündungshemmende;zytotoxische Aktivität

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1. Einleitung

Quercetinist ein Bioflavonoid mit nachgewiesener Wirkung auf die Gesundheit und gut dokumentierten biochemischen Aktivitäten. Diese Verbindung gilt als eines der wirksamsten Antioxidantien unter den Polyphenolen [1-3]. Aufgrund seiner Eigenschaften wurde Quercetin für verschiedene therapeutische Anwendungen getestet, wie zAntioxidans, antiparasitär,Antiphlogistikum, und Anti-Krebs-Aktivitäten [4,5]. Bei parasitären Erkrankungen sind Flavonoide eine hochinteressante Gruppe. Dies liegt an ihrer geringen Wirttoxizität und mehreren Mechanismen, mit denen sie pathologisch veränderte Prozesse während Infektionen modulieren können [6].Flavonoidehaben mehrere Ziele zur Behandlung von Leishmaniose und umfassen Ziele wie Arginase, Ribonukleotidreduktase und Topoisomerase II [7,8].

Quercetinhat mehrere krebsbekämpfende Aktivitäten bei mehreren Arten von soliden Tumoren. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass es in HL-60-Zellen (ausgehend von akuter myeloischer Leukämie (AML)) das Tumorwachstum signifikant reduziert, indem es den intratumoralen oxidativen Stress, die Aktivierung des Signals der extrazellulären regulierten Kinase (ERK) reduziert und nachfolgende Apoptose [9]. Quercetin verbesserte die entzündungsfördernde Reaktion durch Verringerung der IL-6- und TNF-Expression mit positiver entzündungshemmender Aktivität in humanen THP1-Makrophagenpopulationen [10].

Unter den verschiedenen Krebsarten ist das Gliom eine der aggressivsten und hat eine schlechte Prognose. Leider sind die wichtigsten Therapien (chirurgische Entfernung, Strahlentherapie und Chemotherapie) nicht effizient. Das durchschnittliche Gesamtüberleben der Patienten liegt weiterhin bei etwa 14 Monaten [11]. Dennoch haben neue Verbindungen wie Temozolomid [12], Retinoide [13] und Flavonoide [14] Anti-Gliom-Aktivität gezeigt. Die antitumorale Wirkung von Quercetin wurde gegen Zellen des Glioblastoms beschrieben, das das aggressivste der Gliome ist [15].

Abnormale Immunantworten sind an der Auslösung und Entwicklung einer großen Anzahl von Krankheiten beteiligt, darunter Autoimmunerkrankungen, Allergien, Krebs und neurodegenerative Erkrankungen.Flavonoidehaben eine potenzielle immunmodulatorische Aktivität und werden als Alternativen für die klinische Anwendung untersucht. Quercetin kann signifikante immunmodulatorische Wirkungen auf die zelluläre Produktion von Zytokinen ausüben, die aus dem Th-1- und Th-2-Profil und der lymphozytären Proliferation stammen, wodurch die zelluläre Immunität reguliert wird[16]. Darüber hinaus kann Quercetin die Expression von Interleukin-Genen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) unterschiedlich modulieren, wodurch das Th-1-Profil begünstigt wird, das die zelluläre Immunität durch Interferon-gamma (IFN-y), die Verringerung des Th{ {6}}-Profil, das an der humoralen Immunität und Makrophagenaktivierung durch IL beteiligt ist-4 [17].

Die geringe Wasserlöslichkeit, der umfangreiche Metabolismus und der enzymatische Abbau begrenzen die Bioverfügbarkeit und reduzieren die biopharmakologische Verwendung von Quercetin als Therapeutikum[13]. Ein interessanter Ansatz zur Überwindung der geringen Bioverfügbarkeit von Polyphenolen, um ihre In-vivo-Aktivität zu testen und zu erforschen, ist die chemische Modifikation des Naturstoffs, wodurch die Löslichkeit erhöht und der Stoffwechsel verlangsamt wird. Daher werden viele Synthesewege untersucht, wie z. B. Acetylierung, Addition von Aminen und Bromierung, Modifikation zu Oximen und Komplexierung mit Hydrazinen [18-20].

In dieser Studie führen wir eine strukturelle Modifikation in Quercetin durch, mit dem Ziel, das Analogon Quercetinpentaacetat (Q5) zur Bewertung des antioxidativen Potenzials, der entzündungshemmenden Aktivität und der Hemmung des Wachstums von Krebszellen, Hepatokarzinom (HepG2) und Promyelozytenleukämie zu erhalten (HL-60) und Ratten-Gliom (C6)-Zellen.

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1.Synthese und Charakterisierung

Für die Synthese des analogen Quercetins (3,3', A',5,7-Pentaacetat) wurde der Ansatz der Totalacetylierung verwendet, der an die in der Literatur gefundenen experimentellen Bedingungen angepasst wurde [21]. Auf diese Weise bleibt Essigsäureanhydrid als Acylierungsmittel und Pyridin als Katalysator erhalten.

Das erhaltene Produkt (Q5), ein gelber Feststoff, war dadurch gekennzeichnet, dass es Schmelzpunkte im Bereich von 178-186 Grad aufwies, was mit den Literaturdaten kompatibel ist[18]. Zusätzlich zeigte die vergleichende Analyse des FTIR zwischen Quercetin und dem Produkt das Fehlen von Absorptionsbanden bei 3400 cm-1, die für Quercetin-Hydroxylgruppen charakteristisch sind, und durch das Auftreten von Banden um 1600-1650 cm-', was auf Carbonylester hinweist , die den Ersatz von Hydroxylgruppen durch Acetylgruppen demonstriert: IR (KBr)v(cm-1):1761,1652,1615, 1505, 1442,1377,1208,1176,1121,1085,1012,892,837,691 und 600 (Abbildung 1). Die Spektren wurden mit den in der Literatur beschriebenen verglichen [21].

Kernmagnetische Resonanzanalysen (NMR) des Quercetins (Q) und des erhaltenen Produkts (Q5) zeigten eine vollständige Acetylierung mit dem Verschwinden von Singuletts, die für Hydroxylgruppen über 9 ppm im H-NMR-Spektrum charakteristisch sind (ergänzende Abbildungen S1, S2 und S{ {4}}S6) und das Auftreten von großen und charakteristischen Methylsignalen in den aliphatischen Bereichen des Spektrums zwischen 2 und 3 ppm. Für das 13C-NMR-Spektrum (ergänzende Abbildungen S3 und S7-S9) zeigte das erhaltene Produkt einen Anstieg der repräsentativen Signale der Estercarbonyle nahe 170 ppm und das Auftreten von Signalen zwischen 20 und 21 ppm entsprechend der Chemikalie Verschiebungen der fünf aliphatischen Kohlenstoffe von Methylen, bestätigt durch die Integration der Signale. Die Spektren wurden mit den in der Literatur beschriebenen verglichen [22].

Biasuttoet al. [23] waren Pioniere bei der Untersuchung von Vorstufen auf Esterbasis, um die Bioverfügbarkeit von Quercetin zu erhöhen. Basierend auf ihren Studien haben Mattarei et al. [21] förderten die vollständige Acetylierung von Quercetin und erhielten das Q5-Derivat in hoher Ausbeute (79-97 Prozent). Vor kurzem haben Mohajeri et al. [24] erzielten eine Ausbeute von 85 Prozent beim Erhalt von Analog Q5 unter Erhitzen (180 Grad für 6 h). In der vorliegenden Studie war die Synthese von Q5 effizient, und wir erhielten eine gemäß den in der Literatur beschriebenen Daten ordnungsgemäß charakterisierte Verbindung.

2.2. Antioxidans ABTS· plus Radikalaktivität

Die vergleichende Analyse der antioxidativen Aktivität von Q und Q5 zeigte, dass Quercetin (Q) beim Abfangen des Radikals ABTS* plus aktiver war als O5 (29 Prozent bzw. 18 Prozent), mit IC50-Werten (in μM). von 188,850±0,003 und 379,560±0,004 für Q bzw. Q5.

Die antioxidative Aktivität von Flavonoiden steht in direktem Zusammenhang mit ihrer molekularen Struktur. Es gibt zwei Mechanismen, durch die phenolische Verbindungen ihre antioxidativen Funktionen ausüben können: Wasserstoffatomübertragung und Elektronenabgabe [25]. Die überlegene antioxidative Aktivität von Quercetin kann dem erheblichen Beitrag von Hydroxylgruppen und ihren Wasserstoffatomen zugeschrieben werden, die im Q5-Analogon durch Acetylgruppen ersetzt werden, wodurch die Fähigkeit zur Wasserstoffspende oder zum Abfangen freier Radikale durch synthetische Moleküle verringert wird.

In der wissenschaftlichen Literatur wurden keine Daten gefunden, die über die antioxidative Aktivität der Q5-Verbindung berichten. Ach, et al. [26] bewerteten Quercetinesterpräparate und ihre antioxidativen Aktivitäten und zeigten, dass Quercetin die höchste radikalfangende Aktivität unter den getesteten Proben hatte. Daher ist der hohe Beitrag der Hydroxylgruppen zur antioxidativen Aktivität von Quercetin essentiell [27].

2.3. Antileishmania-Aktivität

In order to evaluate the activity of the compound(O and O5)against the promastigote forms of the two Leishmania species, the 50% inhibitory concentration(IC50)was calculated from the cell viability assay in axenic culture. For Leishmania braziliensis, Q and Q5 had ICs0 values>100 μM im Vergleich zu Amphotericin B （IC501,1 μM±0,1）. Zusätzlich wurden die Wirkungen von Q5 auf die Promastigotenformen von L. amazonenses bewertet, und diese Verbindung zeigte einen niedrigeren IC50-Wert （75,1 ± 4,7 μM）für diese Art im Vergleich zu L. brasiliensis.

Tasdemiret al. [8] verglichen die antitrypanosomalen und antileishmanialen Aktivitäten von Flavonoiden und ihren Analoga (abgeleitet von Quercetin) und stellten fest, dass sie potente und wirksame Antiprotozoenmittel gegen Amastigotenformen von L. donovani (IC50=1.0ug mL -l). Für promastigote Formen von L.amazonensis, Fonseca und Silva et al.[27] fanden IC50=31.4 uM in Kulturen, die innerhalb von 48 h mit Quercetin behandelt wurden. Darüber hinaus berichteten sie über einen vollständigen Zellwachstumsstopp mit 96 μM Quercetin in 96 h, was eine zufriedenstellende Antileishmanial-Dal-Aktivität zeigte. Cataneoet al. [28] bewerteten die Anti-Promastigoten-Wirkung von Quercetin (bis zu 192 μM） gegen L. brasiliensis, in Peritonealzellen von Makrophagen. In Promastigoten-Kulturen von L. major zeigten Quercetin und sein Analogon Quercetin-Pentaacetat eine konzentrationsabhängige Wirkung （IC 50 =2,5±0,92 und 2,85±0,99 μM bzw. 【24】.

Einige Autoren haben gezeigt, dass Quercetin den Tod von L. amazonensis-Promastigoten durch eine Dysfunktion der Mitochondrienmembran verursacht, die aus der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies [27,28] und anderer Ziele wie Arginase [7], Ribonukleotidreduktase [8,29] und Topoisomerase resultiert II[30]. Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse weisen darauf hin, dass andere Tests für die getesteten Verbindungen (Q und Q5) in Betracht gezogen werden sollten, wobei in silico-Tests zur Untersuchung von Zielen in Betracht gezogen werden sollten, die an den beobachteten Todesmechanismen beteiligt sein könnten.

2.4. Entzündungshemmende und zytotoxische Aktivitäten

Dann konzentrierten wir uns auf die Bewertung der biologischen Aktivität des neuen Derivats. Zuerst wurden nicht-toxische Konzentrationen von Q und Q5 in peritonealen Makrophagen bestimmt, die von BALB/c-Mäusen erhalten wurden. Die CCs0-Werte zeigten keine Zytotoxizität bei Konzentrationen gleich oder weniger als 80 μM (Abbildung 2A, D). Dexamethason war in der getesteten Konzentration (20 μM) nicht zytotoxisch. Darauf aufbauend wurden nachfolgende Tests bei Konzentrationen durchgeführt, die 80 μM nicht überstiegen.

Die immunmodulatorische Aktivität von Q und Q5 wurde untersucht, um die Wirkungen von Verbindungen auf die proinflammatorische Mediatorsekretion zu bestimmen. Die immunmodulatorischen Wirkungen der Verbindungen (Q und Q5) wurden anfänglich in Kulturen von peritonealen Makrophagen durch die Produktion von Stickoxid bewertet. Wie erwartet erhöhte die Makrophagenaktivierung mit LPS PLUS IFNy die Nitritproduktion (Abbildung 2B, E). Die Behandlung mit Quercetin hemmte konzentrationsabhängig die Nitritproduktion (S<>

Die Pentadactylverbindung (Q5) zeigte keine ähnliche Aktivität bei 20 μM. Interessanterweise war die Aktivität bei den höchsten getesteten Konzentrationen (40 und 80 μM) für beide Verbindungen signifikant. Bei der höchsten getesteten Konzentration (80 &mgr;M) waren die Wirkungen der Verbindungen ähnlich denen, die in Kulturen von aktivierten Makrophagen beobachtet und mit 20 &mgr;M Dexamethason behandelt wurden. Die Verbindungen waren bei den getesteten Konzentrationen (20, 40 und 80 μM) nicht zytotoxisch für peritoneale Makrophagen.

Zur besseren Charakterisierung derAntiphlogistikumWirkung der Verbindungen (O und O5), das entzündliche Zytokin TNF wurde durch das Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)-Verfahren quantifiziert. Makrophagen-Stimulation unter Verwendung von LPS plus INF-y induzierte einen deutlichen Anstieg der TNF-Produktion. Die Behandlung mit Q und Q5 reduzierte die Produktion von TNF signifikant (S<0.05) in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 2c,="">

Die Reduktion von Entzündungsfaktoren durch Quercetin wird vielfältig beschrieben, einschließlich der Modulation von Th-2-Entzündungsprofilen im Zusammenhang mit dem Schutz bei neuralen Erkrankungen [31,32]. Die entzündungshemmende Wirkung von Quercetin ist in der Literatur gut beschrieben [33,34]. Es gibt jedoch nur wenige Studien, die das entzündungshemmende Potenzial des O5-Analogons belegen. Diese Studie bestätigt die Ergebnisse von Chen et al. [35], die die Rolle von Q und O5 bei der Hemmung der durch LPS induzierten NO-Produktion in einer konzentrationsabhängigen Weise ohne nachteilige zytotoxische Wirkungen für die RAW 264.7-Makrophagenlinie nachwiesen. Darüber hinaus zeigte diese Studie die beispiellose Wirkung von Q5 bei der Hemmung des entzündungsfördernden Zytokins TNF.

Die erhaltenen Daten zeigen die Erhaltung der Wirkungen auf das halbsynthetische Molekül (O5); jedoch kann die Dosierung anderer Faktoren, wie z. B. des Zytokins IL-10, eine Perspektive bei der Bewertung dieser Profile sein. Daher kann Q5 als potenzielles Molekül für zukünftige In-vitro- und In-vivo-Tests angesehen werden, die auf eine zusätzliche therapeutische Alternative mit entzündungshemmender Aktivität abzielen.

Die Zytotoxizität der getesteten Verbindungen (Q und Q5) wurde bei 20, 40 und 80 uM unter Verwendung der kolorimetrischen AlamarBlue-Methode in einer gesunden Zelllinie (MRC-5, menschliche Lungenfibroblasten) und in zwei verschiedenen Krebszelllinien bewertet , HepG2 (humanes hepatozelluläres Karzinom) und HL-60 (humane Promyelozytenleukämie), wie in Fig. 3 gezeigt. Doxorubicin war das Standardarzneimittel, das als positive Kontrolle verwendet wurde.

Wie in Abbildung 3 gezeigt, zeigte Quercetin (Q) für HepG2-Zellen keine signifikante zytotoxische Aktivität bei der höchsten untersuchten Konzentration (80 μM) und sein Pentaacetat-Analogon (Q5) zeigte eine reduzierte Aktivität (IC{{4 }}.9μM）. Für die Krebszelllinie HL-60 erwies sich Quercetin als nicht sehr aktiv (IC50=51,3 uM); interessanterweise war Q5 jedoch signifikant aktiver als Quercetin mit einem IC50 von 33,6 uM. Das Standardarzneimittel Doxorubicin hatte IC50-Werte im Bereich von 0,1 bis 0,2 uM für Krebszelllinien, die signifikante zytotoxische Wirkungen gegen die gesunde Zelllinie MRC-5 (Tabelle 1) zeigten, was bei den Verbindungen (Q und Q5) nicht beobachtet wurde. .

For the HL-60 cell line, the Land O5presented values of 51.3 and 33.6 μM, respectively, in agreement with Massi et al.[17]. Regarding cytotoxicity in non-tumor cells, O and Q5 presented IC50 values >80 μM, was ein selektives Profil gegenüber der Krebszelllinie zeigt. Nur wenige Studien haben die Aktivität des Quercetin-O5-Analogons in Krebszelllinien gezeigt. Die Q5-Aktivität in einer HeLa-Tumorzelllinie wurde jedoch von Danihelovået al. [22], die zeigten, dass acetylierte Ester von Quercetin die wirksamsten zytotoxischen Derivate waren. Es wurden keine Daten zur zytotoxischen Rolle von Q5 in Zellen der HepG2-Linie gefunden. In der Literatur wurde nur eine Studie gefunden, die zeigte, dass das tetraacetylierte Quercetin-Analogon durch die Aktivierung von Caspase-3 eine signifikante Wirkung auf die Hemmung von Zellen der HL-60-Linie hatte und die Apoptose förderte [36].

Ein kolorimetrisches Verfahren MTT-Assay wurde verwendet, um auf die Zytotoxizität in C6-Zellkultur zuzugreifen. Quercetin und Q5 induzierten eine Abnahme der MTT-Absorption bei 57{{1{0}} nm, was die mitochondriale Dehydrogenaseaktivität darstellt und auf eine Abnahme der Zelllebensfähigkeit in C6-Zellen hindeutet. Wie in Abbildung 4 gezeigt, konnte die Quercetin-induzierte Zytotoxizität in C6-Zellen in Konzentrationen von mehr als 25 μM für 72 Stunden (Abbildung 4A) auftreten, während 0.78 μM Q5 für 72 Stunden die Lebensfähigkeit der Zellen verringern konnte (Abbildung 4B ). Es wurde beobachtet, dass 50 μM Quercetin(O) und O5 die Zelllebensfähigkeit auf 41,3 Prozent ± 2,9 Prozent bzw. 47,5 Prozent ± 1,2 Prozent verringerten, verglichen mit der Kontrollgruppe (100,0 Prozent ± 6,4 Prozent) (Abbildung 4A, B). . In mit DMSO (0,05 Prozent) behandelten C6-Kulturen wurden im Vergleich zu unbehandelten Zellen keine signifikanten Veränderungen der Zelllebensfähigkeit sichtbar gemacht.

Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen untersuchten wir dann die morphologischen Wirkungen der Verbindungen Q und Q5 (50 μM) auf die C6-Zellen nach 24, 48 und 72 Stunden der Behandlung unter Verwendung von Lichtmikroskopie. Quercetinpentaacetat (Q5) bei 50 μM induzierte Veränderungen in der Morphologie von C6-Gliomzellen innerhalb der ersten 24 h, mit einer sichtbaren Verringerung der zytoplasmatischen Verlängerungen im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 5). Nach 48-stündiger Behandlung mit Q5 nahmen die Zellen eine abgerundete Morphologie an, die durch eine Retraktion des Zellkörpers und eine formlose Membran gekennzeichnet war (was in der wissenschaftlichen Literatur nicht berichtet wurde), im Gegensatz zu Quercetin, das während dieser Behandlungsdauer einen morphologischen Aspekt aufwies ähnlich wie Fibroblasten [37]. Alle anderen morphologischen Veränderungen wurden in Zellen unter anderen Behandlungsbedingungen sichtbar gemacht.

Die Hydroxyl-Substitution durch die Acetylgruppen kann eine verbesserte zelluläre Absorption der Quercetin-Analoga fördern, was verschiedene biologische Tests begünstigt, insbesondere in Krebszellen [38,39]. Bispo da Silvaet al. [40] zeigten durch die Behandlung von C6-Zellen mit den Flavonoiden Rutin und Quercetin eine signifikante Verringerung des Anteils adhärenter C6-Zellen mit einem dünneren und bipolaren morphologischen Phänotyp im Vergleich zu Kontrollkulturen. Die Behandlung von C6-Zellen mit Flavonoiden hemmte die Migrationseigenschaften lebensfähiger C6-Zellen nach 24 h Behandlung. Unter Kontrollbedingungen zeigte Mikroglia einen runderen Phänotyp; Nach der Behandlung mit Rutin erwarben mehr als 50 Prozent der Zellen einen verzweigten, multipolaren Phänotyp und die anderen den amöboiden Phänotyp, was beide auf eine Aktivierung hinweist.

Studien weisen darauf hin, dass Quercetin in die Regulation von Signaltransduktionswegen der Zelle eingreift, die mit dem Zelltod durch Apoptose und in den Stadien der Zellzyklusprogression verbunden sind [41,42]. Santoset al. [14] deuteten auf eine potenzielle Verringerung des Wachstums menschlicher GL-15-Glioblastomzellen hin. Biet al. [43] eine dosisabhängige Induktion der Autophagie von U87- und U251-Human-Glioblastomzellen sichtbar.

Die erhaltenen Ergebnisse bestätigen Danihelova et al. [22], bei denen die in das Quercetin-Molekül eingefügten Acetylgruppen eine Verbesserung der Antikrebsaktivität förderten. Darüber hinaus zeigten sie einen größeren Tropismus für Krebszellen, insbesondere für Zellen neuraler Abstammungslinien. Diese Studie ist in Bezug auf das O5-Analogon bei der Behandlung von C6-Gliomzellen beispiellos. Dell'Albani et al. [44]zeigten eine bessere Wirkung von Acylderivaten von Quercetin in Kulturen von menschlichen Gliomstämmen U373-MG und murinem Gliom 9L, was auf Todeswege durch Apoptose hinweist. Die Modifikation der Zellmorphologie zu einem abgerundeten Profil kann sich auf Todesmechanismen wie Apoptose beziehen, die allgemein Quercetin [45-47] zugeschrieben wird. In Zukunft könnten Tests mit gesunden Nervenzellen helfen, diese Hypothese aufzuklären.

3. Materialien und Methoden

3.1.Reagenzien und Materialien

Alle Reagenzien (Quercetin, Pyridin, Essigsäureanhydrid, Tricolorisocyanursäure, Dichlormethan, 2,4-Dinitrophenylhydrazin, Hydroxylaminhydrochlorid, Natriumacetat, Petrolether, Schwefelsäure, Kaliumpersulfat und Nitrat) waren analysenrein und im Handel erhältlich (Ouimex, Merck, Brasilien, und Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Für die Vorbereitung aller Standardlösungen und Proben wurde Reinstwasser (mit einem spezifischen Widerstand von 18 MOcm-I) aus dem Wasseraufbereitungssystem Milli-Q Plus (Millipore, Molsheim, Frankreich) verwendet. Alle Laborglasgeräte wurden in einer 10-prozentigen （ o/ø） HNO3-Lösung für 24 h, mit Reinstwasser gespült und bei Umgebungstemperatur getrocknet.

3.2. Synthese und Charakterisierung

Das Strukturanalogon wurde danach erhaltenQuercetinmolekulare Modifikation aus dem zugänglicheren und reproduzierbareren Syntheseweg (Penta-Acetylierung). Wir haben die Prinzipien der grünen Chemie mit der Minimierung des Substanzverbrauchs angewendet. Das Pentadactyl-Analog (Q5) wurde nach der molekularen Modifikation von Quercetin auf einem Syntheseweg erhalten, der Essigsäureanhydrid als Acylierungsmittel und Pyridin als Katalysator verwendet.

Die Mischung, die Quercetin (300 mg, 1 Eg.), Essigsäureanhydrid (0,80 ml, 20 Eg.) und Pyridin (7,5 ml) enthielt, wurde unter magnetischem Rühren bei Raumtemperatur gehalten. Nach 24-stündigem Rühren wurden 250 ml Dichlormethan zum Reaktionsmedium gegeben. Dann wurde die Reaktion mit 10 Prozent HCl (3 × 100 ml), verdünnter NaOH (3 × 50 ml) und Wasser (3 × 100 ml) gewaschen; über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet; gefiltert; und eingedampft, im Rotationsverdampfer (Fisatom, Minas Gerais, Brasilien)[21]. Die O5-Menge und die erhaltene Ausbeute betrugen 280 mg bzw. 54 Prozent.

Die Strukturmodifikationsreaktion des Quercetin-Moleküls wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung einer Mischung aus Hexan und Ethylacetat (1:1) als Lösungsmittel überwacht. Zur physikalisch-chemischen Charakterisierung wurde der Schmelzpunkt verwendet. Fourier Transform Infrared (FTIR)-Tests nach der Attenuated Total Reflection (ATR)-Methode wurden mit einem FTIR Spectrum 100S-Modell (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) durchgeführt, wobei die Scanspektren im mittleren Infrarot (4000 to 600 cm-1).

Die Probe (Masse ~5,0 mg) wurde auf den ATR-Kristall gelegt und mit Hilfe einer manuellen mechanischen Presse einem Druck von ungefähr 20 N ausgesetzt. FTIR-Spektren wurden mit der OriginPro8-Software OriginLAB4 (www.originlab.com, Zugriff am 10. September 2021) verfolgt. Kernmagnetische Resonanz(NMR)-Spektren wurden in einem Spektrometer Bruker Avance 131500 MHz (Uster, Schweiz) -500 MHz für 1 H-NMR und 125 MHz für 13 C-NMR unter Verwendung von DMSO als Lösungsmittel aufgenommen. Chemische Verschiebungen wurden im ppm-Maßstab (ug/ml) ausgedrückt, und Chloroform (CHCla) wurde als interne Referenz verwendet.

NMR-Spektren wurden mit der Software TopSpin⑤4.0 (Bruker Biospin, Coventry, UK) verarbeitet und mit Literaturdaten verglichen [38]. Die NMR-Daten waren: 'H NMR(500 MHz, CDCl3)2.34(6H,s,-OCOCH3);2.35(3H,s,-OCOCH3);2.35(3H,s, -OCOCH3);2.44(3 H, s,-OCOCH3);6.88(1H,d,J=2.5Hz);7.34(1H,d,J=2.0 Hz);7.36(1H,d,J=8.5);7.70 （1Hd, J=2.0Hz）;7.73（1H,dd,J1=8.5 Hz,J 2=2.0Hz）;13CNMR (125 MHz, CDCl3)δ 170.04;169.24;167.86;167.79;156.87;154.28;150.43;144.40;142.22;127.78;126.82;54.01;123.93;123.93;123.93 ;113.89;108.96;21.16;21.02;20.65; und 20.49.

3.3. Antioxidans ABTS* plus Radikalaktivität

Die ABTS* plus Sequestrationsaktivität wurde aus der von Dorman und Hiltunen[48] beschriebenen Methode adaptiert. Kaliumpersulfat und ABTS (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) wurden in destilliertem Wasser gelöst, um eine Endkonzentration von 2,45 mM bzw. 7 mM zu bilden. Die ABTS-Lösung wurde hergestellt, indem beide Lösungen im Verhältnis 1:1 zugegeben und anschließend die Lösung bei Raumtemperatur für 16 h im Dunkeln inkubiert wurde.

Die resultierende intensiv gefärbte Lösung wurde vor der Verwendung mit Ethanol im Spektrophotometer auf eine Extinktion von {{0}},7 ± 0,05 nm bei 734 nm eingestellt. Wir verwendeten 30 μl der Proben oder Trolox (Sigma Aldrich⑧, St. Louis, MO) als Referenzstandard in verschiedenen Konzentrationen (5, 10, 25, 50, 75 und 100 μM) und wurden zu 3 ml der Probe hinzugefügt ABTS*-plus-Lösung und 6 min lang auf Reaktion warten. Die Extinktion wurde bei 734 nm gegen eine Blindprobe (Ethanol) gemessen. Die Abfangkapazität von ABTS· plus wurde wie folgt berechnet:

ABTS* plus Scavenging-Effekt ( Prozent ){{0}} (1- A0/A1)×100;

wobei A0 die Extinktion der Kontrolle und A1 die Extinktion der Probe oder des Standards ist. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt. IC5so-Werte wurden berechnet und als Mittelwert ± Standardabweichung in μM ausgedrückt.

3.4. Antileishmania-Aktivität

Lamazonensis (MHOM/BR88/BA-125Leila-Stamm) und Lbraziliensis (MHOM/BR88/BA-3456)-Promastigoten (1 × 10 Grad pro Well) wurden in einer 96-Well-Platte kultiviert Schneider-Medium (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA), ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (FBS; GIBCO) und 50 ug mL-' Gentamicin (Life, Carlsbad, CA, USA) und einer Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen unterzogen（ 100 μM; sechs Verdünnungen 1∶2） von Q5. Die Parasiten wurden für 72 h bei 26 Grad inkubiert. Dann wurden 20 μl/Vertiefung AlamarBlue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) über 2 h zugegeben. Das Ablesen wurde in einem Spektrophotometer unter Verwendung von Wellenlängen von 570 und 600 nm durchgeführt. Die Berechnung der axenischen Kulturhemmung erfolgte anhand der unbehandelten Kontrolle [49].

3.5. Entzündungshemmende und zytotoxische Aktivitäten

3.5.1.Drogen

Dexamethason (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA), ein synthetisches Glucocorticoid, wurde als Positivkontrolle in immunmodulatorischen Assays verwendet. Doxorubicin (Doxorubicin-Hydrochlorid, Labor IMA SAIC, Buenos Aires, Argentinien) wurde als Referenzmedikament gegen Krebs verwendet. Alle Verbindungen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO; PanReac, Barcelona, ​​Spanien) gelöst und in einem Zellkulturmedium zur Verwendung in den Assays verdünnt. Die Endkonzentration von DMSO betrug in allen Experimenten weniger als 1 Prozent.

3.5.2.Tiere

4-10 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden vom Vivarium des Goncalo Moniz Institute/FIOCRUZ-BA (IGM, Salvador, Bahia, Brasilien) bereitgestellt, wo sie in Käfigen mit maximal fünf Mäusen gehalten wurden. Alle Käfige wurden in einem akklimatisierten Raum bei 21 Grad ± 1 Grad in einem 12--h-Hell/Dunkel-Zyklus mit Wasser und Futter nach Belieben während des gesamten Versuchszeitraums gehalten. Die Tierversuche wurden von der Ethik- und Tierverwendungskommission des Instituts Goncalo Moniz/FIOCRUZ-BA (IGM-018/15) genehmigt.

3.5.3. Zellen

HL-60 (humane akute Promyelozytenleukämie) und HepG2 (humanes hepatozelluläres Karzinom) wurden von der American Type Culture Collection – ATCC (Rockville, ML, USA) bezogen, verwendet. Um die Selektivität von Quercetin(O) und dem O5-Derivat auf die Proliferation von Nicht-Krebszellen zu beurteilen, wurde die ebenfalls von ATCC erhaltene MRC-5-Linie (menschliche Lungenfibroblasten) verwendet. Zelllinien wurden in Zellen gezüchtet Kulturflaschen (75 cm³, 250 ml Volumen) unter Verwendung von RPMI 1640-Kulturmedium (GibcoTM), ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (GibcoM) und 50 ug/ml Gentamicin (GibcoTM). Die Zellen wurden in Inkubatoren mit einer Atmosphäre von 5 Prozent gehalten CO, bei 37 Grad und täglich überwacht. Alle Zelllinien wurden unter Verwendung eines Hoechst-Färbe-Mycoplasma-Nachweiskits (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) auf Mykoplasmen getestet. Die C6-Zelllinie stammte von Gliatumoren der Ratte, die durch n-Nitrosomethylharnstoff induziert wurden [50]. Diese Gliomzellen wurden wie von de Oliveira et al. [51]. Die Zellen wurden bei 37 Grad in einem befeuchteten Inkubator bei 5 Prozent CO2 inkubiert. C6-Zellen wurden auf Zellkulturschalen (100- mm Ø, TPP) in DMEM-Medium, ergänzt mit 100 UI/ml Penicillin G, 100 ug/ml Streptomycin, 7 mM Glucose, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Pyruvat, gezüchtet. und 10 Prozent fötales Kälberserum. Das Kulturmedium wurde alle 2 Tage gewechselt. Vierundzwanzig Stunden vor den Behandlungen wurden C6-Zellen in Petrischalen mit 35 mm Durchmesser oder 96--Well-Platten mit einer Dichte von 3,5 × 10* Zellen/Well ausgesät.

Alle Zelllinien wurden mit dem Mycoplasma Stain Kit (Sigma-Aldrich) auf Mykoplasmen getestet, um die Verwendung kontaminationsfreier Zellen zu validieren. Die Zelllinieninformationen sind in der Datenbank „Cell Bank of Rio de Janeiro (BCRJ)“ enthalten: HepG2-Zelle (Code: 0291), HL-60-Zelle (Code: 0104) und C6-Zelle (Code: 0057) .

3.5.4. Test auf zytotoxische Aktivität

Um die Zytotoxizität der getesteten Verbindungen (Q und Q5) auf HL-60- (humane akute Promyelozytenleukämie) und HepG2-Zellen zu beurteilen, wurde das kolorimetrische Verfahren von Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) verwendet. Alamar Blue (Resazurin) ist ein Indikator, der als Reaktion auf Stoffwechselaktivität eine kolorimetrische Veränderung und ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Resazurin wird von stoffwechselaktiven Zellen zu Resorufin reduziert. Die oxidierte Form ist blau (nicht fluoreszierende/nicht lebensfähige Zelle), und die reduzierte Form ist rosa (fluoreszierend/lebensfähige Zelle). Die Reduktion von Resazurin zu Resorufin spiegelt die Zelllebensfähigkeit wider [52].

Im Assay wurden die Zellen in {{0}}Well-Platten mit einer vordefinierten Dichte von 0,3 × 1{{10}} Grad Zellen/ml für Zellen von verteilt die HL-60-Linie und 0.7× 10 Zellen/ml für Zellen der HepG2-Linie. Die Verbindungen wurden in einer Reihe von acht Konzentrationen (80 bis 0,62 &mgr;M) zugegeben, mit Ausnahme von Doxorubicin, das in Konzentrationen im Bereich von 0,003 bis 5 &mgr;M verwendet wurde. Die Negativkontrolle erhielt die gleiche Menge DMSO (0,025 Prozent). Die Platten wurden für 72 h in einem Ofen bei 37 Grad und 5 Prozent CO2 inkubiert. Nach diesem Zeitraum wurden 20 μl/Vertiefung Alamar Blue zugegeben und die Platten weitere 4 h inkubiert. Die Platten wurden unter Verwendung eines Spektrophotometers (Spectramax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) bei Wellenlängen von 570 und 600 nm gelesen.

Die Lebensfähigkeit der C6-Zellen wurde unter Verwendung des von Hansen et al. beschriebenen kolorimetrischen Verfahrens bestimmt. [53]. Das MTT (3-4,5-Dimethylthiazol-2-yl,25-Diphenyltetrazoliumbromid) wurde bei Raumtemperatur in einer Konzentration von 5 mg/ml in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst Temperatur, und die Lösung wurde weiter sterilisiert, indem sie durch einen 0,2- mm-Filter geleitet und bei 4 Grad im Dunkeln gelagert wurde. In dem Assay wurden die Zellen in 96-Well-Platten mit einer vordefinierten Dichte von 3,5 × 10* Zellen/ml für die C6-Zelllinie verteilt. Die Verbindungen wurden in einer Reihe von acht Konzentrationen (80 bis 0,39 uM) zugegeben.

MTT wurde jeder Vertiefung in einer Endkonzentration von 2 mg/ml zugesetzt, und die Zellen wurden 2 h lang inkubiert. Danach wurden die Zellen mit 20 Prozent (w/ø) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 50 Prozent (o/ø) Dimethylformamid (DMF)-Lösung (pH 4,7) in einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur lysiert [54,55] . Die Extinktion wurde mit einem Spektrophotometer-Mikroplattenlesegerät (570 nm), Thermo ScientificFlash Varioskan (Version 3001, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finnland) gemessen. Für jede Konzentration wurden acht Wiederholungen verwendet. Die Zelllebensfähigkeit wurde als Prozentsatz der Extinktion bei 570 nm ausgedrückt, und die Kontrolle wurde als 100 Prozent übernommen. Nach den Behandlungen wurde die Zellmorphologie durch Lichtmikroskopie unter Verwendung eines optischen Mikroskops (invertiertes Mikroskop Eclipse TS100, Nikon Instruments, Tokio, Japan) bewertet und unter Verwendung einer Digitalkamera (Coolpix S4300, Nikon Instruments, Tokio, Japan) fotografiert.

3.5.5. Makrophagen-Kultur

Makrophagen aus peritonealem Exsudat (2 × 10 5 Zellen/Vertiefung) wurden in Platten mit 96- Vertiefungen in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 Prozent PBS und 50 &mgr;g/ml Gentamicin, in dreifacher Ausführung, stimuliert oder nicht mit LPS (500 ng/ml) und inkubiert IFN-y （5 ng/mL） und behandelt oder nicht mit unterschiedlichen Konzentrationen von Verbindungen (20, 40 und 80 uM). Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 Grad und 5 % CO2 für 4 24 h gehalten. Nach diesem Zeitraum wurden die Kulturüberstände zur Zytokin- und Stickoxiddosierung gesammelt. In einigen Assays wurde zur Beurteilung der Zytotoxizität der Überstand durch Medium plus 10 Prozent Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und die Platten ersetzt wurden für weitere 4 h inkubiert. Die Spektrophotometerablesung wurde bei 570 und 600 nm durchgeführt.

3.5.6. TNF-Dosierung

Die TNF-Messung wurde aus Zellkulturüberständen unter Verwendung der Sandwich-ELISA-Technik unter Verwendung von Development System-Kits Duoset ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MI, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. ELISA-Platten (NUNC – IMMUNO PLATE Maxisorp Surface) wurden mit 5 0 μl/Vertiefung des Fangantikörpers in einer Konzentration von 2 ug/ml sensibilisiert, 1x in PBS verdünnt und 16 h bei 4 Grad inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit 1 × PBS/0.05 % Tween 20 gewaschen und mit 100 μl/Vertiefung 1 × PBS und 0,05 % Tween 20 und 0,1 % Rinderalbumin für 2 h blockiert .

Dann 50 μl/Well Proben, eine Blindprobe und eine Standardkurve von Rekombinanten, die in Tris-Salzlösungspuffer (20 mM Trix in der Basis und 150 mM NaCl) verdünnt sind 0,1 Prozent Rinderalbumin und 0,05 Prozent Tween 20 wurden für 2 h bei Raumtemperatur zugegeben. Der Standard wurde ausgehend von der Anfangskonzentration von 2000 pg/ml mit 11 doppelten Verdünnungen seriell verdünnt (1:2). Die Platte wurde dreimal mit PBS/0,05 % Tween gewaschen und mit 50 μl des Detektionsantikörpers (biotinyliert) in einer Konzentration von 400 ng/ml für einen Zeitraum von 2 h inkubiert.

Die Platte wurde dreimal mit PBS/{{0}},05 Prozent Tween gewaschen und für 20 min mit 1:200 verdünnter Avidin-Peroxidase inkubiert. Die Entwicklung wurde durch Zugabe von TMB-Substrat (Thermo Fisher) durchgeführt und mit 0,05 M Phosphorsäure unterbrochen. Die Ablesung der Reaktion wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) mit einem 450-nm-Filter bestimmt. Die Analysen wurden unter Verwendung der Software Softmax 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) durchgeführt.

3.5.7. Stickoxiddosierung

Die Produktion von Nitrit in Makrophagenüberständen wurde durch die Quantifizierung seines oxidativen Produkts, Nitrit, nach der Griess-Methode abgeschätzt [50]. Die Extinktion wurde in einem Spektrophotometer (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) mit einem 570-nm-Filter bestimmt. Die Analysen wurden mit Softmax Software 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) durchgeführt und die Ergebnisse wurden in μM Nitrit ausgedrückt, basierend auf einer Standardkurve von Natriumnitrit mit einer Anfangskonzentration von 400 μM.

3.6. Statistische Analyse

Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz der Vergleiche zwischen den Gruppen in den Studien wurde der einfache ANOVA-Test, gefolgt vom Mehrfachvergleich nach Bonferroni, verwendet. Die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn p<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" graphpad="" prism="" version="" 5.01="" program="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

4. Schlussfolgerung

Die Bedingungen und Reaktionen der Synthesemedien von Quercetin-Analoga zeigten Effizienz bei der Gewinnung einer ordnungsgemäß charakterisierten Verbindung gemäß den in der Literatur beschriebenen Daten. Die vergleichende Analyse der antioxidativen Aktivität von Q und Q5 zeigte, dass Quercetin (O) beim Abfangen des Radikals ABTS* plus aktiver war als O5 (29 Prozent bzw. 18 Prozent). Das reduzierte antioxidative Potenzial zeigte keine Beeinträchtigung der immunmodulatorischen und antitumoralen Aktivitäten. Die in dieser Studie vorgeschlagenen chemischen Modifikationen verstärkten die antiproliferative Wirkung und hielten die entzündungshemmende Aktivität, aber nicht die zytotoxische Aktivität in gesunden getesteten Zellen aufrecht.

Das vorhandene acetylierte Derivat (Q5) verbesserte die Zytotoxizität in hepatozellulären Krebszellen (HepG2), Promyelozytenleukämie (LH-60)-Zellen und insbesondere in Gliom (C6)-Zellen. Die gehandelten Ratten-Gliom-C6-Zellen zeigten ein morphologisch beispielloses Muster des Zelltods. Q5 bei 50 μM für 24 h induzierte Veränderungen in der Morphologie der C6-Gliomzellen, die durch eine runde Körperform gekennzeichnet waren (was in der wissenschaftlichen Literatur nicht berichtet wurde), im Gegensatz zu Quercetin, das eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie aufwies.

Weitere Untersuchungen müssen durchgeführt werden, um die Wirkungen von acetylierten Derivaten von Quercetin, insbesondere in neuronalen Zellen, besser zu verstehen. Diese Studie ermöglichte zum ersten Mal die Anwendung von strukturell modifiziertem Quercetin in neuralen Zellen für potenzielle neuroprotektive Wirkungen.

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