Anhaltende lokale Hemmung von Thrombin erhält Mikroarchitektur und Funktion der Nieren nach Einsetzen einer akuten Nierenschädigung

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Ian Vargaset al

Abstrakt

Akute Nierenschädigung(AKI)-Management bleibt hauptsächlich unterstützend, da keine spezifischen Therapeutika, die auf einzelne Signalwege gerichtet sind, in klinischen Studien erfolgreich waren. Hier berichten wir, dass die Hemmung der Thrombin-gesteuerten Gerinnung und Entzündungssignalisierung durch die Verwendung von lokal wirkenden, auf Thrombin gerichteten Perfluorkohlenstoff-Nanopartikeln (PFC NP) die Nierengefäße schützt und verschiedene Entzündungsprozesse, die eine renale Ischämie-Reperfusionsschädigung verursachen, weitgehend moduliert. Jedes PFC-NP wurde mit etwa 13.650 Kopien des direkten Thrombininhibitors PPACK (Prolin-Phenylalanin-Arginin-Chlormethylketon) komplexiert. Mäuse, die nach dem Einsetzen von AKI mit PPACK PFC NP behandelt wurden, zeigten herunterregulierte VCAM-1-, ICAM-1-, PGD2-Prostanoid-, M-CSF-, IL-6- und Mastzellinfiltrate. Mikrovaskuläre Architektur, röhrenförmige Basalmembranen und Bürstensaumkomponenten waren besser erhalten. Die Nicht-Reperfusion wurde reduziert, wie durch reduziertes Einfangen roter Blutkörperchen und Nicht-Häm-Eisen angezeigt.NiereFunktion und Tubulusnekrose verbesserten sich nach 24 Stunden gegenüber der unbehandelten Kontrollgruppe, was auf einen Nutzen für die duale Hemmung von Thrombose und Entzündung durch PPACK PFC NP hindeutet.

Schlüsselwörter: Akute Nierenschädigung; Thrombose; Entzündung; Perfluorkohlenstoff-Nanopartikel; Schiffsschaden

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Akute Nierenschädigung(AKI) ist ein häufiges klinisches Problem bei Jung und Alt mit zunehmender Inzidenz und einer unannehmbar hohen Sterblichkeitsrate, die sich seit Jahrzehnten nicht wesentlich verbessert hat.1,2 Das Syndrom entwickelt sich typischerweise nach einem plötzlichen vorübergehenden Abfall des gesamten oder regionalen Blutflusses zu dasNiereals Folge einer Reihe von Beleidigungen wie Hypotonie, Sepsis, Toxine usw.3 AKI ruft eine komplexe Palette von pathophysiologischen molekularen Akteuren und Signalereignissen in einem Krankheitsprozess hervor, der sich im Laufe der Zeit in Stufen entwickelt.3–6 Selektive und spezifische molekular zielgerichtete Medizin Therapien für AKI gibt es trotz des dringenden medizinischen Bedarfs noch nicht.7 Tatsächlich sind die derzeitigen Behandlungen nach Jahren präklinischer und klinischer Forschungsanstrengungen im Wesentlichen weiterhin unterstützend.

Hier postulieren wir, dass Nanopartikel-basierte therapeutische Interventionen, die auf Thrombin abzielen, das die mikrovaskuläre Integrität und Barrierefunktion aufrechterhalten und gleichzeitig die Entzündungssignalisierung reduzieren kann, den AKI-Ergebnissen zugute kommen werden. Thrombin ist ein wichtiges atherogenes und wundheilendes Molekül, das viele andere entzündliche Moleküle antreibt, die an der Endothelaktivierung nach einer Verletzung beteiligt sind, wie z. B. NF-κB,8 NADPH-Oxidase,⁹

und andere über Protease-aktivierte Rezeptoren (PAR-1) sowohl auf Endothelium als auch auf Makrophagen.10,11 Alle Zelltypen in derNiereerfahrene Veränderungen des Genexpressionsmusters, die eine erhöhte Expression von Verletzungsmarkern und Entwicklungsgenen umfassen, wie von Rudman-Melnick et alNiereVerletzung.12 Darüber hinaus identifizierte eine Nagetierstudie zur Einzelkern-RNA-Sequenzierung bei bilateraler Ischämie-Reperfusions-Nierenverletzung13 eine spezifische proximale Tubulus-Zellpopulation, die entzündungsfördernde und profibrotische Gene nach warmer Ischämie-Reperfusionsverletzung überexprimiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass Entzündungen ein nützliches therapeutisches Ziel darstellen sollten. Obwohl die Bildung fester intravaskulärer Gerinnsel bei AKI ungewöhnlich erscheint, stellten wir weiter die Hypothese auf, dass die Minderung der mikrovaskulären prokoagulatorischen Aktivität durch lokal wirkende starke Antithrombin-Nanopartikelantagonisten14–17 den Blutfluss verbessern, „No-Reflow“ reduzieren und die entzündliche Signalgebung zur Erhaltung abschwächen könnte Nierenfunktion.

Zu den kritischen Punkten, die gegen die Anwendung direkter Thrombininhibitoren zur Verhinderung einer renalen Ischämie-Reperfusionsschädigung (IRI) sprechen, gehören ihre potenziellen toxischen Nebenwirkungen und das systemische Blutungsrisiko. In Bezug auf Thrombose waren herkömmliche gerinnungshemmende Therapeutika nicht besonders erfolgreich, obwohl lösliches Thrombomodulin renoprotektive Wirkungen ausüben kann,18,19 wie es Protein C20,21 und Antithrombin III aktivieren kann,22 allerdings mit potenziellen Komplikationen durch übermäßige Blutungen.21 Darüber hinaus sind sowohl Warfarin als auch Dabigatran wurde mit Nierentoxizität in Verbindung gebracht.^23,24Die Tatsache, dass diese gerinnungshemmenden Ansätze klinisch noch nicht erfolgreich waren, mindert jedoch nicht den potenziellen Wert von Thrombin als Ziel aufgrund seiner doppelten Funktionen sowohl bei der Gerinnung als auch bei der Entzündung. Obwohl es keine klinische Studie zur VEGF-Behandlung von AKI gibt, hat eine präklinische Studie gezeigt, dass VEGF ein wichtiger Mediator bei der Renoprotektion während AKI ist,25 was unseren vorgeschlagenen hypothetischen therapeutischen Mechanismus der Erhaltung der Nierengefäße zum Schutz der Nierenfunktion während AKI weiter unterstützt.

Wir haben eine stabile, biokompatible und nicht nephrotoxische Perfluorkohlenstoff-Nanopartikel (PFC NP)-Plattform entwickelt, die die Proteaseaktivität von Thrombin hemmt, ohne eine blutende Diathese zu verursachen.14,15 Native PFC NPs sind von der FDA als Blutersatz zugelassen26 und bestehen aus einem flüssigen Perfluorkohlenstoff Kern und einer äußeren Phospholipid-Tensid-Schale und im Durchmesserbereich von ~160-250 nm. In kürzlich durchgeführten vorläufigen AKI-Studien verabreichten wir Anti-Thrombin PFC NP als Vorbehandlung, um zu bestätigen, dass Thrombin ein wertvolles Ziel für die Beschleunigung der Wiederherstellung der Nierenfunktion ist, teilweise durch Erhaltung der mikrovaskulären Integrität und Verringerung der Nicht-Reperfusion bei IRI, wenn es vor der Ischämie-Reperfusion verabreicht wird Verletzung.16 Anti-Thrombin PFC NPS schützt auch Nieren-Allotransplantate vor IRI und zeigt eine deutliche Verringerung des Prozentsatzes parenchymaler tubulärer Nekrose, die mit einer verlängerten Nierenlebensdauer nach der Transplantation einhergeht.27 Es ist jedoch nicht klar, ob dieses Anti-Thrombose-Nanopartikel immer noch wirksam ist nach dem Beginn der AKI, die eine völlig andere Gruppe von Patientenpopulationen darstellt.

Dementsprechend haben wir in der vorliegenden Arbeit versucht, die Verwendung dieses Ansatzes auf etablierte AKI nach IRI auszudehnen, um ihr Potenzial für die klinische Übersetzung aufzuklären. Für den Machbarkeitsnachweis verwenden wir PPACK (Phe[D]-Pro-Arg-Chlormethylketon) als Antithrombin-Einheit für die Konjugation an PFC NP, von dem wir gezeigt haben, dass es der Thrombin-Signalübertragung und der mikrovaskulären Thrombose in Modellen für Atherosklerose und akute Nierenverletzung vorbeugt ( AKI).14–17 PPACK selbst ist ein bekannter direkter und irreversibler Thrombininhibitor, dessen freie Form zu schnell von der Niere ausgeschieden wird, um als therapeutisches Mittel von Wert zu sein.14,15 Hier erläutern wir die frühen pathophysiologischen Reaktionen darauf PPACK PFC NP-Therapie, die entzündliche Signalereignisse sowohl in der Niere als auch systemisch begrenzt, die Nierenmikroarchitektur bewahrt und Gefäßschäden abschwächt. Diese Daten implizieren, dass dieser auf Nanopartikeln basierende therapeutische Ansatz für laufende AKI die Voraussetzungen für die klinische Entwicklung eines Antithrombinmittels schaffen könnte, das lokal begrenzte pleiotrope Wirkungen ausübt und in den frühen Phasen von AKI sicher verabreicht werden kann.

Methoden

Nanopartikel-Formulierung

Perfluorkohlenstoff-Nanopartikel wurden wie zuvor beschrieben formuliert.14 Kurz gesagt, eine Lipidmischung aus 98,5 Molprozent Ei-L- --Phosphatidylcholin und 1,5 Molprozent 1,2-Distearoylsnglycero- 3-Phosphoethanolamin-N-[ Carboxy(polyethylenglycol)-2000] (Natriumsalz) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) wurde in Chloroform:Methanol (3:1) hergestellt, bevor es unter Vakuum getrocknet wurde, um einen Lipidfilm zu bilden. Der Lipidfilm (2 Prozent (Gew./Vol.)) wurde dann mit PFOB (20 Prozent (Vol./Vol.)) (Exfluor Research Corp.) (Glycerin 1,7 Prozent (Gew./Vol.)) (Sigma, St. Louis, MO ) und MilliQ-Wasser, bevor sie 4 Minuten lang bei 20 000 psi auf Eis emulgiert werden (Microfluidics Inc.). Um das Nanopartikel mit PPACK-Konjugation zu funktionalisieren, verwendeten wir die Amin-Carboxyl-Kopplungsmethode. Die Nanopartikel (1 ml) wurden zuerst mit 2 mg EDCI 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimidmethodid (Sigma, St. Louis, MO) für 1 Stunde gemischt , bevor 12,5 mg PPACK (BACHEM, Torrance, CA) über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur zugegeben wurden. Eine Dialyse mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 3000-5000 g/mol (Fisher Scientific, Waltham, MA) wurde durchgeführt, um überschüssiges EDCI und PPACK zu entfernen. Eine detaillierte Formulierungsmethode war in den ergänzenden Materialien enthalten.

Das Modell der akuten Nierenschädigung

Erwachsene C57BL/6-Mäuse (n=22) wurden einer bilateralen renalen warmen Ischämie-Reperfusion unterzogen, um eine akute Nierenschädigung zu induzieren. Die Tiere wurden mit einem Cocktail aus Ketamin (85 mg/kg) und Xylazin (13 mg/kg) anästhesiert, bevor sie einer Laparotomie unterzogen wurden, um eine 17-minütige warme Ischämie zu erzeugen. Ein Bauchschnitt in der Mittellinie wurde eingeführt, um sowohl die Nierenarterie als auch die Nierenvene freizulegen. Renale Ischämie wurde durch okklusive Klemmen sowohl an der Arterie als auch an der Vene induziert, um den Blutfluss zur Niere einzuschränken. Das erfolgreiche Stoppen des Nierenblutflusses wurde visuell durch eine Veränderung der Nierenfarbe von rosa nach dunkelviolett bestätigt. Die Körpertemperatur der Mäuse wurde unter Verwendung eines Kleintierheizsystems auf 37 Grad gehalten. Die Klemmen wurden nach 17 Minuten gelöst, um die Wiederherstellung des Nierenblutflusses zu ermöglichen, was durch die Änderung der Nierenfarbe zu Rosa bestätigt wurde. Die Operationswunde wurde dann schichtweise verschlossen und die Tiere wurden überwacht und nach freier Bewegung in den Käfig zurückgebracht. Nach Reperfusion für 2 Stunden eine Einzeldosis PPACK

PFC NP ({{0}},5 ml/kg PFC NP; 0,05 mg/kg PPACK) oder reines (Kontrolle) PFC NP wurde intravenös durch Injektion in die Schwanzvene verabreicht. Da unsere vorherige Studie zeigte, dass eine präventive Einzeldosis von PPACK PFC NP Nierenschutzwirkungen zeigte,16 wendeten wir hier eine Einzeldosisbehandlung nach dem Einsetzen von AKI an, um die Nierenschutzwirkung zu bewerten. Verfahren und Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of South Florida genehmigt.

Gewebeentnahme und -konservierung 24 Stunden nach der Verabreichung der Nanopartikel wurden die Mäuse eingeschläfert und die Nieren zur Analyse entnommen. Vor der Nierenentnahme für histologische und molekulare Untersuchungen wurde Blut durch Herzpunktion für nachgeschaltete Serumanalysen gesammelt, und dann wurde jede Maus systemisch mit normaler Kochsalzlösung (Kat.-Nr.: 23-535435, Fisher Scientific, Waltham, MA) perfundiert, bis Reste zurückblieben Blut wurde aus den Nieren gespült. Um Serum zu gewinnen, wurde Vollblut bei Raumtemperatur 30 Minuten lang geronnen, bevor es bei 2000 × g 10 Minuten lang bei 4 Grad zentrifugiert wurde. Das gesammelte Serum wurde vor den Blut-Harnstoff-Stickstoff- und Zytokin-Bewertungen bei –80 Grad gelagert. Für die histologische Analyse wurden herausgeschnittene Nieren in 10 % Formalin fixiert, bevor das Gewebe verarbeitet, in Paraffin eingebettet und geschnitten wurde. Für Eicosanoide-Bewertungen wurden herausgeschnittene Nieren weiter präpariert, um Cortex und Medulla zu trennen, bevor sie in flüssigem Stickstoff schockgefroren und zur Analyse bei –80 Grad gelagert wurden.

Histologie

Detaillierte histologische Färbe- und Datenanalysemethoden waren in den ergänzenden Materialien enthalten. Die Objektträger wurden vor der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung, Periodic Acid Schiff (PAS)-Färbung (Kat.-Nr.: ab150680, Abcam, Cambridge, MA), Preussisch-Blau-Eisen-Färbung, immunhistochemischer Färbung zur Visualisierung von CD31, VCAM-1, entparaffiniert und rehydriert. und ICAM-1-Expression und Mastzellen-Eosinophilen-Färbung (Kat.-Nr.: 150665, Abcam, Cambridge, MA). Die Färbungsdaten der Kaninchen-IgG-Isotypkontrolle sind in den ergänzenden Abbildungen 2 und 3 dargestellt, um die Spezifität der Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung zu demonstrieren. Alle mikroskopischen Bilder wurden mit denselben Leistungseinstellungen und Digitalisierungsparametern aufgenommen. Mikroskopische Auswertungen wurden mit einem Olympus-Hellfeldmikroskop durchgeführt, das mit einer DP27-Digitalkamera ausgestattet war, um Bilder pathologischer Schnitte bei 20-facher oder 40-facher Vergrößerung aufzunehmen. An allen Bildern wurde eine doppelblinde Datenanalyse durchgeführt.

Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN)

Die BUN-Messungen wurden mit einem kolorimetrischen Harnstoff-Stickstoff (BUN)-Nachweiskit (Kat.-Nr.: K024-H5, Arbor Assays, Ann Arbor, MI) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Herstellung und Analyse von Eicosanoiden

Eicosanoide wurden mit einem modifizierten Extraktionsverfahren extrahiert und wie zuvor beschrieben mit UPLC ESI-MS/MS analysiert.28 Detaillierte Methoden, die für diese Studie verwendet wurden, sind in den ergänzenden Materialien enthalten.

Serum-Zytokin-Bewertung

Ein angepasstes Zytokin-Array wurde von R&D Systems (Minneapolis, MN) gekauft und mit Luminex 200 (Northbrook, IL) gemäß den Anweisungen des Benutzerhandbuchs bewertet.

Statistiken

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt. Die statistische Analyse für jedes Experiment ist in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Zweiseitige t-Tests oder einseitige ANOVA mit Scheffe-Test wurden verwendet. Korrelationsanalysen für ausgewählte Metrikpaare wurden durchgeführt, um einen Pearson'schen r-Wert zu berechnen. Die statistische Signifikanz der Unterschiede wurde bei P < 0,05="">

Ergebnisse

Die Behandlung mit PPACK PFC NP verbessert die Nierenfunktion nach Beginn derakute Nierenschädigung.

Die mikroskopische Untersuchung des allgemeinen Aussehens der Nieren 24 Stunden nach der Behandlung mit Antithrombin (PPACK) PFC NP nach der Reperfusion zeigte eine Besserung der Schädigung bei bestehender AKI (Fig. 1, AB). Die Verletzung nach 24 Stunden war vorwiegend an der kortikomedullären Verbindung der Niere lokalisiert und die proximalen Tubuli waren bevorzugt geschädigt. Das Verletzungsmuster war das einer koagulativen Nekrose. Zum Zeitpunkt 24- Uhr war ein geringfügiges entzündliches Infiltrat vorhanden. Die Quantifizierung der tubulären Schädigung in H&E-gefärbten Schnitten (Abbildung 1, C) ergab, dass mit PPACK PFC NP behandelte Mäuse eine 33,95-prozentige Gesamtreduktion der akuten tubulären Nekrose (ATN) im Vergleich zu NP-behandelten Kontrollmäusen aufwiesen (24,44 ± 1,76 Prozent gegenüber 37.{{ 16}} jeweils ± 4,96 Prozent; P=0.035). Abbildung 1, D zeigt, dass Mäuse, die eine Behandlung erhielten, innerhalb von 24 Stunden eine 44,03-prozentige Reduktion des BUN aufwiesen (110,96 ± 6,21 mg/dL gegenüber 62,10 ± 8,71 mg/dL für Kontroll-NP gegenüber PPACK PFC NP; P=0.0002). . Diese frühen vorteilhaften Ergebnisse spiegeln den Schutz wider, den wir zuvor bei Antithrombin-Vorbehandlungsschemata um 24 Stunden beobachtet haben,16 was darauf hindeutet, dass Thrombin weiterhin eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von AKI über den anfänglichen ischämischen Insult hinaus spielt.

Abbildung 2 veranschaulicht die regionalen Reaktionen von Basalmembran- und Bürstensaumstrukturen auf eine Antithrombinbehandlung basierend auf einer Halbquantifizierung der PAS-Färbung. Abbildung 2, AC zeigt, dass die Behandlung den Prozentsatz der Glomeruli mit intakten Basalmembranen von 51,43 % ± 2,61 % auf 70,00 % ± 3,09 % (P=0.00033) erhöhte. Abbildung 2, DF veranschaulicht den tieferen Schaden, den röhrenförmige Bürstenränder erlitten haben, wo nur eine Minderheit nach 24 Stunden vollständig intakte Bürstenränder behielt. Dennoch verbesserte die Behandlung die Integrität der Pinselränder um 50,79 Prozent (P=0.015). Die Behandlung reduzierte das Gesamtausmaß der Proteinaggregate um 54,09 Prozent (P=0.032) (Abbildung 2, GI), was erwartungsgemäß eine tubuläre Stauung verhindern würde, um die Nierenfunktion aufrechtzuerhalten.

Die Behandlung mit PPACK PFC NP bewahrte die Gefäßintegrität nach dem Einsetzen von IRI

Um das Potenzial von PPACK PFC NP zum Schutz vaskulärer Elemente zu quantifizieren, wurden Nierenschnitte auf CD31 gefärbt.

Fig. 3 veranschaulicht die größere Prävalenz der CD31-Färbung nach 24 Stunden im Kortex und Medulla von Mäusen, die mit PPACK NP behandelt wurden, im Vergleich zu Kontroll-NP (Fig. 3, A und D gegenüber B und E). In kortikalen Regionen umfasste die CD31-Färbung 4,28 % ± 0,62 % der behandelten Tiere gegenüber 1,75 % ± 0,34 % der Kontrolltiere (P=0.0{{ 25}}18), oder eine relative Steigerung von 144,57 Prozent (Abbildung 3, C). In medullären Regionen betrug die CD31-Färbung 3,24 % ± 0,38 % bei mit PPACK NP behandelten Tieren gegenüber 1,91 % ± 0,29 % bei mit NP behandelten Kontrolltieren (P {= 0.0073) oder eine relative Steigerung von 88,81 % (Abbildung 3, F). . Die mikroskopische Beurteilung der Gefäßintegrität zeigte zum Zeitpunkt 24- Std. keine nennenswerte arterioläre Nekrose.

Das Auftreten von roten Blutkörperchen (RBC) in mikroskopischen Bildern unterschied sich zwischen PPACK NP- und Kontroll-NP-behandelten Mäusen nach 24 Stunden (Abbildung 4). Da die Mäuse systemisch perfundiert wurden, um Blut in perfundierbaren Nierengebieten auszuwaschen, zeigte das Vorhandensein von RBCs entweder eine Aggregation in schlecht perfundierten mikrovaskulären Leitungen oder eine interstitielle Extravasation oder möglicherweise beides an. In Glomeruli (Fig. 4, AB) wurden RBCs innerhalb von Gefäßbüscheln, aber selten in Bowman's Kapsel nach 24 Stunden beobachtet. Die Behandlung reduzierte die glomeruläre RBC-Prävalenz um 40,78 Prozent (P=0.007) (Abbildung 3, C). Im Medulla (Abbildung 4, DE) war es nicht möglich, basierend auf H&E-Färbungen eine definitive Lokalisation für Erythrozyten zuzuweisen, aber die Behandlung reduzierte die Gesamtprävalenz der Erythrozyten um 34,92 Prozent (P=0,049) (Abbildung 4, F) .

Um die Folgen der RBC-Ablagerung und des Einfangens weiter abzugrenzen, wurde eine Nicht-Häm-Eisenfärbung mit Preußischblau durchgeführt. Eisenfärbungen waren sowohl in glomerulären als auch in tubulären Zellstrukturen positiv. Die Behandlung reduzierte die Prävalenz von Eisen sowohl im Cortex (44,23 % Reduktion; P=0.022) (Abbildung 5, AC) als auch im Medulla (50,50 % Reduktion; P=0.006) (Abbildung 5, DF ) bei 24 h, konsistent mit der Wirkung einer Antithrombinbehandlung auf das RBC-Trapping.

Die Behandlung mit PPACK PFC NP reduzierte lokale und systemische Entzündungen nach dem Einsetzen von AKI

Um die Rolle von Thrombin bei der Aufrechterhaltung der endothelialen Aktivierung und der lokalen Entzündung in der Niere aufzuklären, haben wir sowohl ICAM-1 als auch VCAM-1 quantifiziert. Die VCAM-1-Expression im Kortex wurde durch die PPACK-Behandlung nicht verändert (Abbildung 6, AC). Die VCAM- 1-Expression im Medulla war jedoch nach der Behandlung um 65,25 Prozent (P= 0.011) erheblich herunterreguliert (Abbildung 6, DF). Eine verstärkte Expression von endothelialem ICAM-1 wurde sowohl im Cortex als auch im Medulla von NP-behandelten Kontrollmäusen beobachtet (Fig. 7, B und E). ICAM-1 wurde durch die Behandlung um 36,89 Prozent (P=0.0083) im Kortex (Abbildung 7, AC) und um 31,17 Prozent (P=0.030) im Medulla (Abbildung 7) herunterreguliert , DF).

Um die Rolle von Thrombin bei der Regulierung entzündlicher bioaktiver Lipide in der frühen Entwicklung von AKI zu beschreiben, führten wir lipidomische Assays an Geweben durch, die nach 24 h getrennt von Cortex und Medulla extrahiert wurden. Die ergänzenden Tabellen 2 und 3 listen die spezifischen molekularen Assays, die Nierenregion und die Subjekttypen (behandeltes AKI, unbehandeltes AKI oder normal ohne AKI) auf. Ergänzende Tabelle 4 listet die durchschnittliche prozentuale Veränderung gegenüber der gesunden normalen Grundlinie für jedes Lipid in der Rinde und im Medulla auf. Im Allgemeinen zeigten sowohl kortikale als auch medulläre Regionen eine abweichende Expression fast aller bewerteten bioaktiven Lipide im Vergleich zu normalen Nieren (Ergänzungstabellen 2 und 3), und fast alle Signallipide tendierten nach der Antithrombintherapie zu einer Verschiebung in Richtung normaler Werte. Als vereinfachtes Maß für die regionale Entzündung (Ergänzungstabelle 4) betrug die durchschnittliche prozentuale Veränderung für alle Lipide 65,13 Prozent und 38,60 Prozent für den Kortex und 136,42 Prozent und 90,76 Prozent für das Medulla in den Kontroll-NP- bzw. PPACK-NP-Gruppen, was darauf hinweist, dass die Entzündung in Medulla übertraf die für Kortex gemäß Lipidom-Assays.

Obwohl nach der Behandlung für fast alle Lipidspezies Auflösungstrends offensichtlich waren, erfüllten die meisten keine statistische Signifikanz. Bemerkenswert in diesen Assays war jedoch die signifikante Reaktion von PDG2, die im Cortex (Abbildung 8, A) (P=0.012) um 47,62 Prozent und im Medulla (Abbildung 8, B) um 50,21 Prozent abnahm ( P=0.0249). Basierend auf dieser Beobachtung quantifizierten wir die Prävalenz von infiltrierenden Mastzellen, die eine bekannte prominente Quelle für entzündliche PID2 sind. Abbildung 8, CE zeigt an, dass die Antithrombinbehandlung den Mastzellengehalt im gesamten Nierenabschnitt um 54,27 Prozent (P=0,002) nach 24 Stunden reduziert hat. Dies steht im Einklang mit der beobachteten Reduktion von VCAM-1 und ICAM-1 (Abbildungen 6 und 7) als aktivierte Mastzellen, die LFA-1 (Lymphozytenfunktions-assoziiertes Antigen 1) und VLA (sehr spät Antigen) ligieren gewebespezifische Adhäsionsmoleküle für die Transmigration in entzündete Gewebe.29,30 Darüber hinaus wurden Mastzell-assoziierte Chemokine/Zytokine wie M-CSF und IL-6 gleichzeitig durch Anti-Thrombin-Nanopartikel herunterreguliert. Nach der Behandlung mit PPACK NP waren M-CSF und IL -6 im Serum im Vergleich zu um 36,60 Prozent (P=0 0,0448) bzw. 27,44 Prozent (P=0 0,0454) reduziert die unbehandelte Kontrollgruppe (Abbildung 8, F).

Aus dem Datensatz ergaben sich mehrere interessante Korrelationen in Bezug auf Mastzelleninfiltration, Gefäßschädigung und Nierenfunktion für die gesamten kombinierten Gruppen behandelter und unbehandelter Tiere sowohl in der Kortex- als auch in der Medullaregion. Es bestand eine indirekte Beziehung zwischen BUN und CD31 (r=0.75, P=0.000009), was darauf hinweist, dass eine Verschlechterung des Nierenversagens mit einer größeren vaskulären Beeinträchtigung verbunden war (ergänzende Abbildung 1, A). Es bestand eine direkte Beziehung zwischen Mastzellzahlen und BUN (r=0.71, P=0.004), was auf eine fortschreitende Abnahme hinweist

der Nierenfunktion in Verbindung mit Mastzellinfiltration (ergänzende Abbildung 1, B). Es wurde eine indirekte Beziehung zwischen der Mastzellzahl und CD31 (r=0.59, P=0.002) beobachtet, was darauf hinweist, dass sich die Gefäßschädigung mit zunehmender Mastzellinfiltration verschlimmerte (ergänzende Abbildung 1, C). Schließlich wurde eine direkte Beziehung zwischen der Mastzellzahl und der globalen ICAM-1-Expression (r=0.54, P=0.008) beobachtet, was mit der Erwartung übereinstimmt, dass hochregulierte vaskuläre Adhäsionsmoleküle dies tun würden Mastzell-Homing zu verletzten Geweben fördern (Ergänzende Abbildung 1, D). Eine noch engere direkte Beziehung betraf die medulläre VCAM-Expression und die Mastzellzahlen (r=0.69, P=0.009; Daten nicht gezeigt).

Diskussion

Trotz jahrzehntelanger Bemühungen um ein effektives Management vonakute Nierenschädigung, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 Anti-Thrombin-Einheiten an Stellen mikrovaskulärer Thrombose und PAR-1-Aktivierung (zusätzliche Beschreibung in den ergänzenden Materialien), eine Amplifikationsstrategie, die nicht durch die 1:1-Stöchiometrie herkömmlicher freier Mittel erreicht werden kann, die Thrombin hemmen, einschließlich PPACK.

Der vorliegende Datensatz zeigt, dass eine akute renale Ischämie-Reperfusionsschädigung 2 Stunden nach der Reperfusion nicht vollständig ist und Thrombin ein hochwertiges Ziel in geschädigten Geweben nach der Reperfusion bleibt. Frühere Bemühungen von Molitoris-Mitarbeitern und anderen unterstützen die anhaltenden Bemühungen, sichere Methoden zur direkten Hemmung von Thrombin bei AKI zu entwickeln.^18,31–33Aus unserer früheren Arbeit zur Vorbehandlung von AKI mit PPACK PFC NP wissen wir, dass Anti-Thrombin-Nanopartikel eine nachhaltige Überwachung gegen lokal aktiviertes Thrombin bieten, das die Gefäßintegrität aufrechterhält, das No-Reflow-Phänomen deutlich um ~50 Prozent dämpft und die Nierenfunktionsstörung schnell umkehrt bis 24 hrs.16 Zusammen mit den vorliegenden Daten ist klar, dass Anti-Thrombin-Nanopartikel noch lange nach der Reperfusion Zugang zu geschädigtem, aber lebensfähigem Nierengewebe erhalten, um zusätzlichen vaskulären und tubulären Schäden vorzubeugen. Frühere Berichte, dass PAR-1-Knockout-Mäuse eine verringerte renale Ischämie-Reperfusionsschädigung erleiden, stimmen auch mit unserer Strategie einer starken und anhaltenden pharmakologischen Hemmung der PAR-1-Aktivierung bei AKI über Thrombinhemmung überein.³⁴

Der Schutz der Nierengefäßstrukturen (Abbildung 3), des Bürstensaums und der Basalmembran (Abbildung 2), der durch Antithrombin PFC NP bereitgestellt wird, in Übereinstimmung mit unseren früheren Daten, die zeigen, dass die Antithrombintherapie eine 2-fache Verbesserung der Perfusion in kortikomedullären Regionen hervorruft AKI16 bestätigt einen aufkommenden Nutzen der Verbesserung der renalen Mikroangiopathie. Obwohl die genaue Art der Schädigung der peritubulären Kapillaren und Venolen zu diesen frühen Zeitpunkten nach der Reperfusion noch nicht vollständig aufgeklärt wurde, werden eine erhöhte Gefäßpermeabilität und eine Aktivierung der endothelialen proapoptotischen Caspase -3 sowie die Verminderung des Signals beschrieben für CD31 (PECAM),35 das die Integrität der Endothelverbindung reguliert.36 Die CD31-Synthese und -Expression an Zellverbindungen werden durch entzündliche Zytokine herunterreguliert, die von aktivierten Mastzellen (TNF- und IFN-) exprimiert werden und die Gefäßpermeabilität erhöhen.^37,38Darüber hinaus wird die Gewebefaktorinduktion durch Thrombin durch PAR-1-Aktivierung durch CD31 reguliert, und CD31-Knockout-Mäuse zeigen eine erhöhte tubuläre epitheliale und endotheliale Apoptose, eine erhöhte Fibrinablagerung und eine Gewebefaktorexpression.³⁹Dementsprechend kann die Fähigkeit von PPACK PFC NP, die CD31-Expression aufrechtzuerhalten, entscheidend sein, um die laufende Aktivierung der Gerinnungskaskade zu begrenzen und die Endothelintegrität aufrechtzuerhalten.

In der Extensionsphase von AKI besteht ein lokaler Zusammenhang zwischen Entzündung und Gerinnung, der die äußere medulläre Kapillarperfusion einschränkt und eine verlängerte regionale Ischämie/Hypoxie verursacht, die dann die Reparatur und Regeneration von tubulären Zellen beeinträchtigt.4 Eine anhaltende Abnahme der Anzahl von Mikrogefäßen im inneren Streifen der äußeren Medulla bei AKI zeigt an, dass die Gefäßschädigung andauert und die VEGF-Signalgebung unterdrückt wird.^40–42Darüber hinaus gibt es reichlich Beweise dafür, dass eine vaskuläre Verdünnung eine chronische Hypoxie hervorruft, die zu einer fortschreitenden tubulointerstitiellen Fibrose führt.⁴³Im akuten Ratten-Ischämie-/Verletzungsmodell sind die proximalen Tubuli besonders empfindlich gegenüber Hypoxie, die sich durch Abplatzen der Tubuluszellen und sogar durch totalen Zerfall manifestiert, was zu einer übermäßigen Sterblichkeit führt chronisches Nierenleiden.⁴⁶

Unsere Daten bestätigen auch, dass Gefäßschäden das Einfangen von roten Blutkörperchen und Nicht-Häm-Ablagerungen fördern (Abbildungen 4 und 5), die eine chronische Nierenerkrankung verschlimmern können.⁴⁷die aber einer Antithrombintherapie zugänglich ist. Die Gewebeeisenquelle sowohl in den glomerulären als auch in den tubulären Zellen (Abbildung 5) stammt zweifellos aus dem Abbau der roten Blutkörperchen in diesen Gebieten als Folge von Blutungen und/oder mikrovaskulärer Thrombose, was mit dem Bild einer vaskulären Beeinträchtigung übereinstimmt, die durch eine Antithrombintherapie gemildert wird. Dementsprechend können Ansätze, die die vaskuläre Integrität erhalten, einen entscheidenden ersten Schritt zur Aufrechterhaltung der Versorgungsleitungen für Nährsubstrate darstellen, die eine schnellere Heilung beschädigter röhrenförmiger Strukturen erleichtern.

Interessanterweise scheint PPACK PFC NP Gefäßstrukturen frühzeitig zu schützen und verschiedene Entzündungsmarker (Abbildungen 6 und 7; Ergänzungstabellen 2-4) sowohl im Kortex als auch im Medulla abzuschwächen. In traditionellen experimentellen Studien von AKI wird angenommen, dass der Kortex aufgrund geringerer metabolischer Anforderungen widerstandsfähiger gegen Schäden ist als die Medulla, dennoch scheinen endotheliale Aktivierung und pathophysiologische Entzündung weit verbreitet zu sein, wie unsere lipidomischen und histochemischen Assays belegen. Darüber hinaus stimmt die breite Ablagerung von Nicht-Häm-Eisen als Nebenprodukt des Abbaus eingeschlossener roter Blutkörperchen sowohl im Kortex als auch im Medulla – und seine Milderung durch Antithrombin-Nanopartikel – mit einem allgemeinen Entzündungs- und Schädigungsmuster überein, selbst wenn der Kortex mehr beweisen kann vorübergehend und milder betroffen als die Medulla im Verlauf der Erkrankung.

Die überraschend frühe Reaktion der Mastzelleninfiltration innerhalb von 24 Stunden (Abbildung 8) deutet auf eine wichtige Rolle für Entzündungszellen neben traditionellen Spielern wie Neutrophilen und Makrophagen hin. Mastzellen werden typischerweise als Mediatoren allergischer Reaktionen angesehen, aber es gibt eine Fülle von Literatur bezüglich ihrer pathophysiologischen Implikationen bei akuten und chronischen Nierenschäden.^48–52 Obwohl Neutrophile frühzeitig auf Gewebeverletzungen reagieren, kommen Makrophagen erst später im Entzündungsprozess ins Spiel, was darauf hindeutet, dass Mastzellen in der frühen Phase von AKI eine wichtige Rolle spielen. Tatsächlich haben Danelli et al. gezeigt, dass die Degranulation von Mastzellen früh bei AKI auftritt und dass die Depletion von Mastzellen zum Zeitpunkt der AKI-Induktion, aber nicht 48 Stunden später, eine langfristige vorteilhafte Wirkung auf die Nierenfunktion, Atrophie und Fibrose verleiht.⁵³Zu ähnlichen Schlussfolgerungen kamen Tong et al. bei Verfahren mit Cromolyn-stabilisierten Mastzellen, die vor der Reperfusion durchgeführt wurden.54 Summers hat gezeigt, dass Mastzellen-defiziente Mäuse (KitW-sh/W-sh) weniger ischämische Schäden erleiden als Wildtypen und das Sie entwickeln reduzierte Leukozyten-Chemoattraktoren.⁵⁵

Mastzellen exprimieren Protease-aktivierte Rezeptoren Mastzellen exprimieren Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs), die durch Thrombin aktiviert werden können, um eine Vielzahl von vorgeformten Chemokinen, Zytokinen und bioaktiven Lipiden zu degranulieren und freizusetzen.56–58 Thrombin verursacht auch die Adhäsion von Mastzellen an die Matrix Proteine ​​(z. B. Fibronectin) und Interleukin-Expression (z. B. IL-6) durch PAR- 1-Wechselwirkungen.⁵⁹Nach Thrombinhemmung beobachteten wir verringerte PGD2-Spiegel, die mit einer relativen Depletion von Mastzellen vereinbar sind, da PGD2 ein hauptsächliches bioaktives Eicosanoid ist, das von Mastzellen bei allergischen Reaktionen sezerniert wird VCAM-1 nach der Behandlung mit Antithrombin-Nanopartikeln steht im Einklang mit einer reduzierten Mastzellinfiltration, da sie LFA-1 und VLA exprimieren und Adhäsionsmoleküle verwenden, um ins Gewebe einzudringen.^29,30

Eine spezifische pathogene Rolle für PGD2 selbst in der Entwicklung von renalem IRI wurde bisher unseres Wissens nicht beschrieben, aber es dient als klarer Biomarker für die Mastzellaktivierung.⁵²Bei Lungenentzündungen wurde gezeigt, dass PDG2 die proinflammatorische Zytokinexpression von Makrophagen durch seine Rezeptoren (DP1 und DP2) verstärkt, die dann den Neutrophileneinstrom aktivieren.61 Unsere Beobachtung von erhöhtem M-CSF und IL-6 (Abbildung 8) bei AKI die durch PPACK PFC NP über Mastzellsuppression herunterreguliert werden, würde mit einem solchen mutmaßlichen Mechanismus übereinstimmen. Da jedoch bekannt ist, dass Mastzellen eine Vielzahl von Faktoren freisetzen, die potenziell schädlich für die Nierenfunktion sind,51,52 könnte eine beliebige Anzahl verantwortlicher Determinanten Gegenstand zukünftiger Studien zur Kontrolle durch Thrombinhemmung oder andere molekular zielgerichtete Mittel sein. Dementsprechend könnten Eingriffe, die die frühe Anziehung und Degranulation von Mastzellen verzögern, einen hohen Schutz für die Gefäßintegrität und die Nierenfunktion bieten, wie sich in den vorliegenden Daten durch die lokale Thrombinhemmung manifestiert.

Einschränkungen

Diese Studien waren nicht darauf ausgelegt, die anhaltenden Vorteile der Thrombinhemmung aufzuklären, da das AKI-Modell auf einen frühen Schutz gegen IRI und verwandte Mechanismen ausgerichtet ist. Ob der langfristige Nutzen einer Einzeldosis von Antithrombin-Nanopartikeln das Fortschreiten einer chronischen Nierenerkrankung begrenzen könnte, geht über den Rahmen des vorliegenden Berichts hinaus und würde ein anderes experimentelles Modell und eine andere Hypothese erfordern. Darüber hinaus wird das zeitliche Gelegenheitsfenster zum Erreichen einer funktionellen Wiederherstellung durch Hemmung von Thrombin in der Verlängerungsphase von AKI hier nicht angesprochen, ist aber ein Thema von Interesse für zukünftige Studien. Inwieweit die hauptsächlichen vorteilhaften Wirkungen der lokalen Thrombinhemmung bei AKI auf die Unterdrückung der Mastzellaktivierung zurückzuführen sind, bleibt eine Vermutung, wäre aber in späteren detaillierten mechanistischen Studien überprüfbar. Obwohl die signifikanten linearen Korrelationen zwischen Mastzellzahlen, CD31 und BUN nicht unbedingt Ursache und Wirkung begründen, unterstützt ihre Übereinstimmung eine starke Beziehung zwischen Mastzellen und Gefäßschäden in den frühen Stadien der Nieren-IRI. Schließlich ist die Verwendung von PPACK als Anti-Thrombin-Einheit nur ein Beispiel für einen konjugierbaren therapeutischen Inhaltsstoff, der sicher und lokal auf einer Nanostruktur abgegeben werden kann, um die Thrombin-Signalgebung zu unterdrücken.Referenzen

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