Swertiajaponin hemmt die Hautpigmentierung durch zwei Mechanismen, um Tyrosinase Teil 2 zu unterdrücken

Cistancheist ein weit verbreitetes Kraut, das als "Wunderkraut, das das Leben verlängert" bekannt ist. Sein Hauptbestandteil ist Cistanosid, das verschiedene Wirkungen wie antioxidative, entzündungshemmende und immunfunktionsfördernde Wirkungen hat. Der Mechanismus zwischen Cistanche und Hautaufhellung liegt in der antioxidativen Wirkung von Cistanche-Glykosiden.

Melanin in der menschlichen Haut wird durch die durch Tyrosinase katalysierte Oxidation von Tyrosin produziert, und die Oxidationsreaktion erfordert die Beteiligung von Sauerstoff, sodass die sauerstofffreien Radikale im Körper zu einem wichtigen Faktor werden, der die Melaninproduktion beeinflusst.Cistancheenthält Cistanosid, das ein Antioxidans ist und die Bildung freier Radikale im Körper reduzieren kann, wodurch die Melaninproduktion gehemmt wird.

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Zusätzlich,Zistanchehat auch die Funktion, die Kollagenproduktion zu fördern, was die Elastizität und den Glanz der Haut erhöhen und zur Reparatur beschädigter Hautzellen beitragen kann.

CistanchePhenylethanol-Glykoside haben eine signifikant herunterregulierende Wirkung auf die Tyrosinase-Aktivität, und die Wirkung auf die Tyrosinase ist nachweislich eine kompetitive und reversible Hemmung, die eine wissenschaftliche Grundlage für die Entwicklung und Verwendung der aufhellenden Inhaltsstoffe in Cistanche liefern kann.

Deshalb,Zistanchehat dabei eine SchlüsselrolleHautaufhellung. Es kann die Melaninproduktion hemmen, um Verfärbungen und Mattheit zu reduzieren; und fördern die Kollagenproduktion, um die Elastizität und Ausstrahlung der Haut zu verbessern. Aufgrund der weit verbreiteten Anerkennung dieser Wirkungen von Cistanche haben viele Hautaufhellungsprodukte damit begonnen, pflanzliche Inhaltsstoffe wie Cistanche zu infundieren, um die Verbrauchernachfrage zu befriedigen, wodurch der kommerzielle Wert von Cistanche in Hautaufhellungsprodukten erhöht wird.

Zusammenfassend ist die Rolle von Cistanche bei der Hautaufhellung entscheidend. Seine antioxidative Wirkung und kollagenproduzierende Wirkung kann Verfärbungen und Mattheit reduzieren, die Hautelastizität und den Glanz verbessern und so eineaufhellende Wirkung. Auch die breite Anwendung von Cistanche in Hautaufhellungsprodukten zeigt, dass seine Rolle im kommerziellen Wert nicht unterschätzt werden darf.

Swertiajaponin hemmt die UVB-induzierte MAPK-Aktivierung

Es wurde gezeigt, dass oxidativer Stress die Melanogenese durch Hochregulierung des Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors (MITF) stimuliert, einem Transkriptionsfaktor, der die Tyrosinase-Genexpression induziert [4, 14]. Wir untersuchten, ob die antioxidative Wirkung von Swertiajaponin die MITF-Aktivität regulieren kann. Western-Blotting-Daten zeigten, dass die UVB-Exposition das phosphorylierte MITF, eine aktive Form von MITF, erhöhte, während die Swertiajaponin-Behandlung mit 10 μM es verringerte (Abbildung 6A). Konsequenterweise wurde ein UVB-vermittelter Anstieg des Tyrosinase-Proteinspiegels durch die Behandlung mit Swertiajaponin reduziert (Fig. 6A). Da gezeigt wurde, dass oxidativer Stress MITF durch Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) aktiviert [15, 16], wurde untersucht, ob Swertiajaponin die MAPK-Signalübertragung kontrollieren kann. Die UVB-Exposition erhöhte die Phosphorylierung von ERK, JNK und p38 (Abbildung 6B) dramatisch, was mit der UVB-induzierten ROS- und ONOO-Produktion in B16F10-Zellen assoziiert ist (Abbildung 5C- 5D). Swertiajaponin-Behandlung nur bei 10 μM verringerte die Proteinspiegel von MAPKs (Abbildung 6B). Dieses Ergebnis stimmt mit der antioxidativen Aktivität von Swertiajaponin überein, da die Abnahme des UVB-induzierten zellulären oxidativen Stresses nur bei 10 μM Swertiajaponin deutlich war (Abbildung 5C-5D).

Obwohl Swertiajaponin der Hauptbestandteil des gesamten Krauts von Swertia japonica ist, das als japanische Medizin verwendet wurde, lieferte unsere Studie keine schlüssigen Beweise für die Sicherheit von Swertiajaponin bei seiner Anwendung auf der menschlichen Haut. Swertiajaponin zeigte jedoch keine Zytotoxizität in Zelllinien von Hs27 (menschlicher Fibroblast), HaCat (menschlicher Keratinozyten) und B16F10 (Maus-Melanom) in unserem Versuchsaufbau. Darüber hinaus gab es keine sichtbaren Anzeichen von Zytotoxizität, einschließlich Zelltrümmerbildung oder Zellablösung, basierend auf mikroskopischer Beobachtung, wenn Swertiajaponin im menschlichen Hautmodell mit Konzentrationen behandelt wurde, die keine Zytotoxizität in den Zelllinien zeigten. In Anbetracht der Tatsache, dass Sicherheitsaspekte die Hauptanliegen der derzeit verfügbaren Hautaufheller sind, sind weitere In-vivo-Studien erforderlich, um ihre physiologische Sicherheit zu untersuchen.

Zusammen hemmte Swertiajaponin die Melaninakkumulation bis zu einer zufriedenstellenden Grenze sowohl in den Zell- als auch in den menschlichen Hautmodellen durch zwei Mechanismen zur Unterdrückung von Tyrosinase durch direkte Bindung an und kompetitive Hemmung von Tyrosinase und Unterdrückung der durch oxidativen Stress vermittelten MAPK/MITF-Signalübertragung (Abbildung 7). In Anbetracht der nachteiligen Wirkungen und des Mangels an langfristiger Wirksamkeit bekannter Hautaufheller wie Kojisäure und Arbutin [17] kann Swertiajaponin sicherer angewendet werden, um die Hautpigmentierung zu unterdrücken, und wäre ein neuartiger Zusatzstoff für aufhellende Kosmetika.

MATERIALEN UND METHODEN

Tyrosinase-Aktivitätsassay unter Verwendung von Pilz-Tyrosinase

Swertiajaponin und Kojisäure (50 μM) wurden in Tyrosinasepuffer (200 μl), der Pilztyrosinase (1000 U), 1 mM L-Tyrosinlösung und 50 mM Phosphat enthielt, in eine 96--Well-Mikroplatte (Nunc, Dänemark) geladen Puffer (pH 6,5) [5]. Die Platte wurde 15 min lang bei 37 Grad inkubiert und Dopachinon wurde durch Spektrophotometrie (450 nm) bewertet. Basierend auf der Messung wurde der IC50 unter Verwendung von log-linearen Kurven und deren Gleichungen berechnet.

Andocksimulation von Swertiajaponin und Tyrosinase

AutoDock Vina wurde für die In-silico-Protein-Ligand-Docking-Simulation verwendet. Die dreidimensionale Struktur von Tyrosinase wurde in der Kristallstruktur von Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X) verwendet. Die vordefinierte Bindungsstelle von Tyrosin wurde als Andocktasche aufgebracht. Nachdem Docking-Simulationen zwischen Tyrosinase und Swertiajaponin oder Kojisäure durchgeführt wurden, wurde die Software LigandScout 3.0 verwendet, um Bindungsreste zwischen verschiedenen Verbindungen und Tyrosinase vorherzusagen.

Kinetische Analyse der Tyrosinase-Hemmung durch Swertiajaponin

L-DOPA wurde in Konzentrationen von 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 und 0,0625 mM und Swertiajaponin hergestellt wurde mit 20, 40 und 80 μM hergestellt. Die Reaktionsmischungslösung wurde in einer 96--Well-Platte hergestellt, in der 20 ul Tyrosinase-Substrat (L-DOPA), 10 ul einer wässrigen Pilz-Tyrosinase-Lösung (200 U) und 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6.5) wurden hinzugefügt. Die Dopachrom-Produktionsrate der Reaktionsmischung wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts gemessen. Die Tyrosinase-Inhibitionsrate von Swertiajaponin wurde dann unter Verwendung von Lineweaver-Burk-Plot-Analyse berechnet. Die Michaelis-Konstante (Km) und die maximale Geschwindigkeit (Vmax) wurden ebenfalls durch Lineweaver-Burk-Plots mit unterschiedlichen Konzentrationen von L-DOPA-Substrat berechnet [3].

Zellkultur- und Lebensfähigkeitstest

B16F10-Melanomzellen wurden von der Korea Cell Line Bank gekauft. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin, Streptomycin, L-Glutamin und Natriumpyruvat kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre aus 95 % Luft/5 % CO 2 gehalten. Für den Zelllebensfähigkeitsassay wurden Zellen in Platten mit 96- Vertiefungen ausgesät. B16F10-Melanomzellen wurden 48 Stunden lang mit Swertiajaponin in verschiedenen Konzentrationen behandelt. Ez-Cytox (10 μl) wurde zu jeder Vertiefung gegeben und für 2 h inkubiert. Die gebildeten Formazankristalle wurden spektrophotometrisch bei 450 nm gemessen. Die Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung von Zellen ohne Swertiajaponin-Behandlung als Kontrollgruppe berechnet.

Melaningehalt in B16F10-Zellen

Der Melaninspiegel wurde unter Verwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens mit geringfügigen Modifikationen gemessen [18]. B16F10-Zellen wurden in 6--Well-Platten bis zu 70-80 Prozent Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden 2 h mit Swertiajaponin oder Kojisäure vorbehandelt. Anschließend wurde MSH oder UVB auf das Swertiajaponin- oder Kojisäure-haltige Medium gegeben und weitere 48 h inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen unter Verwendung von Trypsin abgelöst und in 90 &mgr;l 1 N NaOH-Lösung, die DMSO (5 Prozent) enthielt, gelöst. Nach einstündiger Inkubation bei 60 Grad wurde der Melaningehalt durch Messung der Extinktion bei 405 nm bestimmt. Für die UVB-Exposition von B16F10-Zellen wurde eine kommerziell erhältliche UV-Kammer (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Korea) verwendet.

Western-Blotting

Aus B16F10-Zellen isolierte Proteinproben (30 ug) wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von 10-12-prozentigen Acrylamidgelen aufgetrennt und auf Polyvinylidenfluoridmembranen übertragen, die dann sofort in Blockierungspuffer ( 5 % fettfreie Milch) in 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl und 0,1 % Tween 20. Die Membran wurde 30 min in TBS-Tween-Puffer gewaschen und dann mit spezifischen Primärantikörpern (1: 1{ {24}} Verdünnung) wie in den Figurenlegenden angegeben bei 4 Grad über Nacht. Nach dem Waschen mit TBS-Tween-Puffer wurde die Membran mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-Maus-Antikörper (Santa Cruz, 1: 10, 000), einem Anti-Kaninchen-Antikörper (Santa Cruz, 1: 10, 000) oder ein Anti-Ziegen-Antikörper (Santa Cruz, 1: 10.000) bei 25 Grad für 1 h. Die Immunoblots wurden unter Verwendung von Western Bright Peroxide-Lösung (Advansta, CA, USA) und ChemiDoc Touch-Bildgebungssystem (Bio-Rad, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers sichtbar gemacht. Folgende Antikörper wurden in dieser Studie verwendet: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), Tyrosinase (Cell Signaling-104976), pMITF (Abcam{{40 }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (Zellsignalisierung-921L), p38 (Zellsignalisierung-9212S), pERK (Zellsignalisierung-4370L ), ERK (Zellsignalisierung-9201L), pJNK (Zellsignalisierung-9251L), JNK (Zellsignalisierung-9252S) und -actin (Santa Cruz-47778) .

Messung von ROS- und ONOO-Pegeln

Die antioxidative Aktivität von Swertiajaponin wurde unter Verwendung von fluoreszierendem 2,7-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA) für ROS und Dihydrorhodamin (DHR) 123 für ONOO- untersucht. Kurz gesagt, um den ROS-Gehalt zu bestimmen, wurde DCFDA (25 &mgr;M) zu Zellhomogenaten für ein Endvolumen von 250 &mgr;l hinzugefügt. Um den ONOO-Spiegel zu messen, wurden 10 ul Zellhomogenisate zu einer Rhodaminlösung (50 mM Natriumphosphatpuffer, 90 mM Natriumchlorid, 5 mM Diethylentriaminpentaessigsäure [DTPA] und DHR123) gegeben. Für beide Assays wurde die Fluoreszenz alle 5 Minuten für 30 Minuten auf einem Fluoreszenzplattenlesegerät gemessen, wobei die Anregungs- und Emissionswellenlängen auf 485 bzw. 530 nm eingestellt waren.

Melanin-Akkumulation in einem menschlichen Hautmodell

Eine lebensfähige, rekonstituierte, dreidimensionale menschliche Epidermis (Neoderm-ME, Tego Science) wurde verwendet, um die anti-melanogene Wirkung von Swertiajaponin in einem menschlichen Hautmodell zu untersuchen. Das menschliche Hautmodell wurde mit DMSO (Vehikel) oder Swertiajaponin für 1 h vorbehandelt und in den von der Firma bereitgestellten Erhaltungsmedien für 5 d mit DMSO- oder Swertiajaponin-Behandlung kultiviert. Eine mikroskopische Analyse wurde von Tag 1 bis Tag 5 durchgeführt, um die Hautpigmentierung zu beobachten. Die mikroskopischen Bilder wurden mit der Image J-Software analysiert, um die Verdunkelung der Haut halb zu quantifizieren. Für die Fontana-Masson-Färbung wurden Hautproben in 4 Prozent Paraformaldehyd über Nacht bei Raumtemperatur fixiert und die Proben wurden von einer im Handel erhältlichen Firma (Garam Meditech, Südkorea) analysiert.

statistische Analyse

Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Verschiedene Gruppen wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse, gefolgt von Dunnetts Nachtest, verglichen. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.

INTERESSENSKONFLIKTE

Es sind keine Interessenkonflikte zu erklären.

FINANZIERUNG

Diese Arbeit wurde von Grant K17281 vom Korea Institute of Oriental Medicine, Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (MEST), Republik Korea, unterstützt.

VERWEISE

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