Swertiajaponin hemmt die Hautpigmentierung durch zwei Mechanismen, um Tyrosinase Teil 1 zu unterdrücken

ABSTRAKT

Viele hautaufhellende Verbindungen zielen auf Tyrosinase ab, da sie zwei geschwindigkeitsbestimmende Schritte in der Melaninsynthese katalysiert. Obwohl derzeit viele Tyrosinase-Hemmer zur Hautaufhellung erhältlich sind, werden auch unerwünschte Nebenwirkungen berichtet. Daher wurden zahlreiche Anstrengungen unternommen, um sicherere Tyrosinase-Inhibitoren aus Naturprodukten zu entwickeln. Dementsprechend testeten wir fünfzig Flavonoide, eine Gruppe natürlich vorkommender Antioxidantien und Metallchelatoren, und testeten Swertiajaponin als stärksten Tyrosinase-Inhibitor in zellfreien Experimenten. Swertiajaponin zeigte keine Zytotoxizität in B16F10-, HaCat- und Hs27-Zellen und zeigte in Experimenten mit dem zellfreien System und B16F10-Zellen eine starke antioxidative Aktivität. Es hemmte deutlich die MSH- oder UVB-induzierte Melaninakkumulation in B16F10-Zellen und unterdrückte die Hautpigmentierung in einem menschlichen Hautmodell. Als zugrunde liegende Mechanismen zeigten In-Silico- und Lineweaver-Burk-Plot-Analysen, dass Swertiajaponin direkt an die Tyrosinase-Aktivität binden und diese hemmen kann, indem mehrere Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen mit der Bindungstasche der Tyrosinase gebildet werden. Darüber hinaus zeigten Western-Blotting-Ergebnisse, dass Swertiajaponin die durch oxidativen Stress vermittelte MAPK/MITF-Signalübertragung hemmte, was zu einer Abnahme des Tyrosinase-Proteinspiegels führte. Zusammen unterdrückt Swertiajaponin die Melaninakkumulation, indem es sowohl die Aktivitäts- als auch die Proteinexpressionsniveaus der Tyrosinase hemmt. Somit wäre es ein neuartiges Additiv für aufhellende Kosmetika.

Schlüsselwörter

Swertiajaponin; Melanogenese; Pigmentierung; menschliche Haut; Tyrosinase

EINFÜHRUNG

Die Haut ist ein wichtiger Ort, an dem sich Melaninpigmente ansammeln. Melaninsynthese und -akkumulation treten als Schutzmechanismus gegen ultraviolette (UV) Strahlung auf. Daher haben Menschen mit schwarzer Hautfarbe ein geringeres Risiko für Hautkrebs als Menschen mit heller Haut, da sie vor den mutagenen Wirkungen von UV geschützt sind [1]. Unkontrollierte Melanogenese ist jedoch eng mit Pigmentstörungen wie Melisma, Sommersprossen und senilen Lentigines verbunden [2]. Darüber hinaus führen anormale Veränderungen der Hautfarbe zu ungünstigen kosmetischen Problemen und beeinträchtigen schließlich die Lebensqualität. Daher hat die Verhinderung einer abnormalen Melanogenese erhebliche Aufmerksamkeit für die Entwicklung von hautaufhellenden Kosmetika auf sich gezogen [3–5].

Der Melanozyt ist der Hauptzelltyp, der Melanin in der Epidermis der Haut synthetisiert. Nach der Synthese übertragen Melanozyten Melanin durch die Dendriten auf Keratinozyten, was zu einer Pigmentierung der Haut führt. Melanin kann aus L-Tyrosin durch Hydroxylierungs- und Oxidationsprozesse synthetisiert werden, bei denen eine multifunktionale kupferhaltige Tyrosinase eine zentrale Rolle bei der Melaninsynthese spielt. Tyrosinase katalysiert zwei geschwindigkeitsbestimmende Schritte bei der Melaninsynthese; die Mycophenolathydroxylierung von L-Tyrosin zu 3,4--Dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA) und die Oxidation von L-DOPA zu DOPA-Chinin [6, 7]. Dementsprechend ist die Tyrosinase-Hemmung eine gute Strategie, um die Haut aufzuhellen, aber Zytotoxizität und mangelnde Stabilität haben die Anwendung verschiedener Tyrosinase-Inhibitoren im Bereich medizinischer Produkte und Kosmetik eingeschränkt. Daher wurden unaufhörliche Anstrengungen unternommen, um sicherere Tyrosinase-Inhibitoren mit stärkerer Stabilität und Selektivität aus natürlichen Quellen zu finden.

Um Verbindungen für bessere und sicherere Aufhellungseffekte für die Haut zu finden, haben wir fünfzig natürlich verfügbare Flavonoide auf ihre hemmende Wirkung auf Tyrosinase getestet und Swertiajaponin als den stärksten Tyrosinase-Hemmer gescreent. Wir haben seine Wirkung auf die Hautpigmentierung unter Verwendung von Zell- und menschlichen Hautmodellen mit verschiedenen biologischen Assays und In-silico-Analysen weiter untersucht.

Cistanche ist ein weit verbreitetes Kraut, das als "Wunderkraut, das das Leben verlängert" bekannt ist. Sein Hauptbestandteil ist Cistanosid, das verschiedene Wirkungen wie antioxidative, entzündungshemmende und immunfunktionsfördernde Wirkungen hat. Der Mechanismus zwischen Cistanche und Hautaufhellung liegt in der antioxidativen Wirkung von Cistanche-Glykosiden.

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Melanin in der menschlichen Haut wird durch die durch Tyrosinase katalysierte Oxidation von Tyrosin produziert, und die Oxidationsreaktion erfordert die Beteiligung von Sauerstoff, sodass die sauerstofffreien Radikale im Körper zu einem wichtigen Faktor werden, der die Melaninproduktion beeinflusst. Cistanche enthält Cistanosid, das ein Antioxidans ist und die Bildung freier Radikale im Körper reduzieren kann, wodurch die Melaninproduktion gehemmt wird.

Darüber hinaus hat Cistanche auch die Funktion, die Kollagenproduktion zu fördern, was die Elastizität und den Glanz der Haut erhöhen und zur Reparatur geschädigter Hautzellen beitragen kann.

Cistanche Phenylethanol Glycoside haben eine signifikant herunterregulierende Wirkung auf die Tyrosinase-Aktivität, und die Wirkung auf Tyrosinase ist nachweislich eine kompetitive und reversible Hemmung, die eine wissenschaftliche Grundlage für die Entwicklung und Verwendung der aufhellenden Inhaltsstoffe in Cistanche liefern kann.

Daher spielt Cistanche eine Schlüsselrolle bei der Hautaufhellung. Es kann die Melaninproduktion hemmen, um Verfärbungen und Mattheit zu reduzieren; und fördern die Kollagenproduktion, um die Elastizität und Ausstrahlung der Haut zu verbessern. Aufgrund der weit verbreiteten Anerkennung dieser Wirkungen von Cistanche haben viele Hautaufhellungsprodukte damit begonnen, pflanzliche Inhaltsstoffe wie Cistanche zu infundieren, um die Verbrauchernachfrage zu befriedigen, wodurch der kommerzielle Wert von Cistanche in Hautaufhellungsprodukten erhöht wird.

Zusammenfassend ist die Rolle von Cistanche bei der Hautaufhellung entscheidend. Seine antioxidative Wirkung und kollagenbildende Wirkung kann Verfärbungen und Mattheit reduzieren, die Hautelastizität und den Glanz verbessern und so einen Whitening-Effekt erzielen. Auch die breite Anwendung von Cistanche in Hautaufhellungsprodukten zeigt, dass seine Rolle im kommerziellen Wert nicht unterschätzt werden darf.

RESULTATE UND DISKUSSION

Swertiajaponin ist der stärkste Tyrosinase-Hemmer von fünfzig Flavonoiden

Von verschiedenen natürlichen Verbindungen ist bekannt, dass Flavonoide, eine Gruppe natürlich vorkommender Antioxidantien und Metallchelatoren, die Tyrosinase-Aktivität aufgrund ihrer Fähigkeit, Kupfer-Flavonoid-Komplexe zu bilden, unterdrücken [8, 9]. Wir haben fünfzig kommerziell erhältliche Flavonoide verwendet, um zu testen, ob sie eine inhibitorische Aktivität gegen Pilztyrosinase haben. Kojisäure, ein bekannter Tyrosinase-Inhibitor, wurde als positive Kontrolle verwendet, um bessere Tyrosinase-Inhibitoren zu screenen (Abbildung 1A-1B). Als Ergebnis zeigte Probe Nummer 40 (Swertiajaponin) (Abbildung 1C) die stärkste hemmende Aktivität gegen Tyrosinase als die anderer Flavonoide (Abbildung 1A -1 B und ergänzende Abbildung 1). Als die inhibitorische Aktivität durch ein konzentrationsabhängiges Experiment weiter untersucht wurde, betrug der IC50-Wert von Kojisäure 41,26 μM und der von Swertiajaponin 43,47 μM (Abbildung 1D), was darauf hinweist, dass die Tyrosinaseaktivitätshemmung von Swertiajaponin mit der auf Kojisäure basierenden vergleichbar ist bei Reagenzglasexperimenten.

Swertiajaponin zeigt in vitro keine Zytotoxizität

Swertiajaponin gehört zur Familie der Flavonoid-C-Glykoside. Es enthält eine Kohlenhydrateinheit, die C-glykosidisch an eines der Flavonoid-Rückgrate gebunden ist (Abbildung 1C). Es wurde als eine Verbindung berichtet, die im ganzen Kraut von Swertia japonica vorkommt [10]. Obwohl einige Studien berichteten, dass Swertia japonica in Japan klinisch als Heilmittel für gastrointestinale Symptome verwendet wird [11], liegen nur wenige Studien über die biologischen Funktionen von Swertiajaponin vor. Daher haben wir seine Auswirkungen auf die Melanogenese weiter untersucht. Da Zytotoxizität ein Hauptproblem bei synthetischen Tyrosinase-Inhibitoren ist, haben wir getestet, ob Swertiajaponin Zelltoxizität unter Verwendung mehrerer Zelllinien zeigte, darunter HaCat (menschliche Keratinozyten), B16F10 (Mausmelanom) und Hs27 (menschliche Fibroblasten). Swertiajaponin zeigte in diesen Zelllinien keine Zytotoxizität (Abbildung 2A-2C).

Swertiajaponin hemmt die Melanogenese in B16F10-Zellen

Wir untersuchten seine Wirkung auf die Melanogenese unter Verwendung von B16F10-Zellen, die mit Kojisäure oder Swertiajaponin vorbehandelt wurden, gefolgt von einer UVB- oder MSH-Exposition, den stärksten melanogenen Induktoren. Wie erwartet erhöhte die UVB- oder MSH-Exposition die Melaninspiegel in B16F10-Zellen deutlich (Abbildung 2D-2F), und die Swertiajaponin-Behandlung reduzierte den zellulären Melaningehalt dosisabhängig nach der UVB- oder MSH-Exposition (Abbildung 2D{{10 }}F). In Zellstudien scheint die antimelanogene Wirkung von Swertiajaponin stärker zu sein als die von Kojisäure (Abbildung 2E- 2F). In ähnlicher Weise war die Farbe des vor der MSH-Behandlung mit Swertiajaponin vorbehandelten Zellpellets im Vergleich zu den MSH-behandelten Zellen aufgehellt (Fig. 2D), was anzeigt, dass Swertiajaponin die UVB- oder MSH-induzierte Melanogenese hemmt.

Swertiajaponin hemmt die Melanogenese in einem menschlichen Hautmodell

Um zu bestätigen, dass Swertiajaponin die Hautpigmentierung beim Menschen unterdrückt, haben wir eine lebensfähige, dreidimensionale, rekonstituierte menschliche Epidermis kultiviert, die aus menschlichen Melanozyten und Keratinozyten besteht, von denen bekannt ist, dass sie mit der Zeit eine spontane Melanogenese durchlaufen [12]. Wir haben das menschliche Hautmodell 1 h mit Swertiajaponin vorbehandelt und 5 d im Erhaltungsmedium kultiviert. Im Vergleich zu Tag 1 war das menschliche Hautmodell an Tag 5 dunkler und die Behandlung mit Swertiajaponin verhinderte dies konzentrationsabhängig (Abbildung 3A-3B). In ähnlicher Weise zeigte die Fontana-Masson-Färbung, dass Swertiajaponin die Melaninspiegel in der Epidermis deutlich reduzierte ( 2C ), was darauf hindeutet, dass Swertiajaponin die Pigmentierung in der Epidermis verringertmenschliches Hautmodell.

Swertiajaponin kann an Tyrosinase binden und diese inaktivieren

Als nächstes untersuchten wir die Mechanismen, die den Swertiajaponin-vermittelten anti-melanogenen Wirkungen zugrunde liegen, unter Verwendung von B16F10-Zellen. Da Swertiajaponin die Tyrosinase-Aktivität in den zellfreien Experimenten unter Verwendung von Pilz-Tyrosinase (Abbildung 1B) unterdrückte, stellten wir die Hypothese auf, dass es direkt an Tyrosinase bindet und diese deaktiviert. Um dies zu testen, wurde eine Protein-Ligand-Docking-Simulation durchgeführt, um die Bindungsaffinität mit AutoDock Vina vorherzusagen. Die vorhergesagte Bindungsaffinität zwischen Tyrosinase und Kojisäure war -5,4 kcal/mol und die Affinität zwischen Tyrosinase und Swertiajaponin war -6,3 kcal/mol (Abbildung 4A und 4C), was darauf hindeutet, dass Swertiajaponin binden kann zu Tyrosinase mit stärkerer Affinität als Kojisäure. Um den Bindungsmodus zwischen Verbindungen und Tyrosinase weiter zu untersuchen, wurde eine Pharmakophoranalyse unter Verwendung der LigandScout 3.1-Software durchgeführt. Während Kojisäure hauptsächlich über Wasserstoffbrückenbindungen mit dem ASN260- oder GLU256-Rest der Tyrosinase (Abbildung 4B) an Tyrosinase binden kann, bildet Swertiajaponin mehrere Wasserstoffbrückenbindungen mit HIS85-, ASN81-, ASN260-, HIS244- und ARG268-Resten der Tyrosinase und hydrophobe Wechselwirkungen mit MET257, VAL248 und PHE264-Rest von Tyrosinase (Fig. 4D), was wahrscheinlich die höhere Bindungsaffinität von Swertiajaponin zu Tyrosinase erklärt.

Da eine vordefinierte Bindungsstelle von Tyrosin als Docking-Tasche in der Protein-Ligand-Docking-Simulation verwendet wurde [3], ist es wahrscheinlich, dass Swertiajaponin mit Tyrosin kompetitiv an Tyrosinase bindet. Um dies zu untersuchen, wurde eine Lineweaver-Burk-Analyse durchgeführt. Mit steigender Konzentration von Swertiajaponin stiegen auch die Km-Werte, während die Vmax-Werte konsistent waren (Abbildung 4E-4F), was darauf hindeutet, dass Swertiajaponin ein kompetitiver Tyrosinase-Inhibitor ist.

Swertiajaponin ist ein Antioxidans, das die UVB-induzierte MITF/Tyrosinase-Signalgebung unterdrückt

Obwohl der IC50-Wert von Swertiajaponin dem von Kojisäure im zellfreien Experiment ähnlich ist, ist die tatsächliche Hemmung der Melanogenese in den mit Swertiajaponin behandelten Zellen größer als in den mit Kojisäure behandelten Zellen, was darauf hinweist, dass die direkte Bindung an Tyrosinase möglicherweise nicht vorhanden ist der einzige Mechanismus, der Swertiajponin zugrunde liegt, vermittelte Hemmung der Melanogenese. Es ist gut dokumentiert, dass die biologischen Funktionen von Flavonoiden mit ihrer antioxidativen Wirkung zusammenhängen [13]. Daher untersuchten wir, ob Swertiajaponin oxidativen Stress durch Abfangtests mit zellfreiem reaktivem Sauerstoff (ROS) und Peroxynitrit (ONOO-) reguliert. Swertiajaponin zeigte starke ROS- und ONOO-Beseitigungsaktivitäten, vergleichbar mit Trolox und Penicillamin, gut bekannten ROS- bzw. ONOO-Inhibitoren (Abbildung 5A-5B). Wir haben weiter getestet, ob die antioxidative Aktivität von Swertiajaponin auch in B16F10-Zellen nach UVB-Exposition gezeigt wurde. Die UVB-Exposition erhöhte die ROS- und ONOO-Produktion signifikant, während Swertiajaponin sie konzentrationsabhängig verringerte, was darauf hindeutet, dass Swertiajaponin ein Antioxidans ist (Abbildung 5C-5D).

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