Synergistische Immunität und Schutz bei Mäusen durch Co-Immunisierung mit DNA-Impfstoffen, die das Spike-Protein und andere Strukturproteine ​​von SARS-CoV kodieren-2

Abstrakt:Das Auftreten neuer Varianten des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS CoV-2) hat zu wiederkehrenden weltweiten Infektionsausbrüchen geführt. Diese stark mutierten Varianten verringern die Wirksamkeit aktueller Impfstoffe gegen die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die nur auf das Spike-Protein (S) des ursprünglichen Virus abzielen. Mit Ausnahme des S von SARS-CoV-2 ist das immunprotektive Potenzial anderer Strukturproteine ​​(Nukleokapsid, N; Hülle, E; Membran, M) als Impfstoff-Zielantigene noch unklar und untersuchungswürdig. In dieser Studie wurden synthetische DNA-Impfstoffe entwickelt, die für vier SARS-CoV-2-Strukturproteine ​​(pS, pN, pE und pM) kodieren, und Mäuse wurden mit drei Dosen durch intramuskuläre Injektion und Elektroporation immunisiert. Bemerkenswert ist, dass die gleichzeitige Immunisierung mit zwei DNA-Impfstoffen, die die S- und N-Proteine ​​exprimierten, höhere neutralisierende Antikörper induzierte und die SARS-CoV-2-Viruslast wirksamer reduzierte als das S-Protein allein bei Mäusen. Darüber hinaus induzierte die pS-Koimmunisierung mit entweder pN oder pE + pM nach drei Immunisierungen eine höhere S-Protein-spezifische zelluläre Immunität und verursachte mildere histopathologische Veränderungen als pS allein nach der Exposition. Die Rolle der konservierten Strukturproteine ​​von SARS-CoV-2, einschließlich der N/E/M-Proteine, sollte im Hinblick auf ihre Anwendungen bei der Impfstoffentwicklung, beispielsweise mRNA-Impfstoffen, weiter untersucht werden.

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Schlüsselwörter: COVID-19; SARS-CoV-2}}; Co-Immunisierung; DNA-Impfstoff; Spike-Protein; Strukturprotein

1. Einleitung

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist die Ursache der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die weltweit Millionen von Infektionen und Todesfällen verursacht und die menschliche Gesundheit und die Weltwirtschaft gefährdet hat . Obwohl wirksame Therapieansätze immer noch nicht verfügbar sind, haben sie rasche Fortschritte gemacht, einschließlich der Anwendung der CAR-T-Zelltherapie und der Nanotechnologie [1,2]. Impfungen sind ein wirksames Mittel zur Bekämpfung der Pandemie, und mehrere Impfstoffe wurden von verschiedenen Gesundheitsbehörden zur Verwendung zugelassen [3,4]. Das Genom des Coronavirus kodiert für vier Hauptstrukturproteine, nämlich die Spike- (S), das Nukleokapsid- (N), die Membran- (M) und die Hüllproteine ​​(E), die für den Virionaufbau und die Unterdrückung der Immunantwort des Wirts verantwortlich sind [5 ]. Das S-Protein besteht aus 1273 Aminosäureresten und enthält zwei Untereinheiten, nämlich S1 und S2. Es vermittelt den Viruseintritt und ist ein Hauptziel für die Entwicklung von Coronavirus-Impfstoffen [6–11]. Allerdings weist das SARS-CoV-2 S-Protein eine hohe Mutationshäufigkeit auf. Es überrascht nicht, dass die Mutation bei SARS-CoV-2, einem RNA-Virus, kontinuierlich und unvermeidlich ist. Seit September 2020 sind fünf besorgniserregende SARS-CoV-2-Varianten (VOC) aufgetaucht, darunter B.1.1.7 (Großbritannien, Alpha), B.1.351 (Südafrika, Beta) und P.1 (Brasilien, Gamma), B.1.617.2 (Indien, Delta) und B.1.1.529 (Südafrika, Omicron) (Andreano und Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Sie alle weisen mehrere Mutationen im Spike-Protein auf [12]. Diese Varianten gefährden die Wirksamkeit aktueller COVID-19-Impfstoffe, die nur auf das Spike-Protein abzielen.

Das N-Protein von SARS-CoV-2 bindet über eine 140-aminosäurelange RNA-Bindungsdomäne in ihrem Kern in einer „Perlen-auf-einer-Schnur“-Manier an virale RNA. Es ist unter Coronaviren hoch konserviert und weist eine Sequenzidentität von etwa 90 % mit der von SARS-CoV auf. Darüber hinaus ist es das einzige Strukturprotein im Virion [13]. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle bei der Verpackung viraler RNA in den Ribonukleo-Kapsid-Komplex und ist für die virale RNA-Replikation, den Virion-Zusammenbau und die Freisetzung aus Wirtszellen notwendig [14]. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit des N-Proteins in Coronaviren könnte es als Kreuzschutz-Impfstoffziel vorgeschlagen werden. Wir haben zuvor herausgefunden, dass die gleichzeitige Immunisierung mit zwei DNA-Impfstoffen, die E- und M-Proteine ​​exprimieren, einen teilweisen Schutz gegen SARS-CoV bietet-2, und diese Methode sollte bei der Impfstoffentwicklung in Betracht gezogen werden [15]. Abhängig vom Landschaftsdokument der WHO gibt es normalerweise sieben Strategien für SARS-CoV-2-Impfstoffkandidaten, die weiter in drei Kategorien unterteilt werden können: erstens proteinbasierte Impfstoffe, einschließlich inaktivierter Virusimpfstoffe, virusähnliche Impfstoffe gegen Partikel und Proteinuntereinheiten; zweitens genbasierte Impfstoffe, einschließlich Virus-Impfstoffe, DNA-Impfstoffe und mRNA-Impfstoffe; Drittens eine Kombination aus proteinbasierten und genbasierten Ansätzen, wie zum Beispiel abgeschwächte Lebendvirusimpfstoffe. DNA-Technologien als neuartige genbasierte Impfstoffstrategien können mehrere Impfstoffkandidaten und -strategien während präklinischer Tests schnell vergleichen [16,17]. Theoretisch sind fast alle viralen Proteine ​​potenzielle Immunogene und Impfziele. Nach unserem besten Wissen muss jedoch noch systematisch über die Immunogenität und das Schutzpotenzial synthetischer DNA-Impfstoffe bei der Kodierung von SARS-CoV-2 S-Proteinen und anderen Strukturproteinen berichtet werden. Vier DNA-Impfstoffe, die die SARS-CoV-2 S-, N-, E- und M l-Proteine ​​exprimieren, wurden auf ihre Immunogenität und Schutzwirkung bei Mäusen untersucht, um die immunologischen Wirkungen von S in Kombination mit anderen Strukturproteinen zu untersuchen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Zellen

Huh7.5-Zellen und menschliche embryonale Nieren-293T-Zellen wurden während der gesamten Studie bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen wurden in DMEM-Medium (HyClone, Logan, UT, USA), ergänzt mit 10 % FBS (GEMINI Co., Shanghai, China) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Gibco, New York, NY, USA), kultiviert. Alle Zelllinien erwiesen sich als negativ hinsichtlich einer Mykoplasmenkontamination.

2.2. Konstruktion von DNA-Impfstoffen, die SARS-CoV-2 S/N/E/M kodieren

Das für das SARS-CoV-2 S/N-Protein kodierende Gen, das eine N-terminale Kozak-Sequenz (GCCACC) gefolgt von einem Initiationscodon (ATG) enthält, wurde unter Verwendung eines für Säugetiere optimierten Codons (GenScript Co., Nanjing) synthetisiert , China). Anschließend wurde es über EcoRI- und XbaI-Verdau in den Expressionsvektor pcDNA3.1 (+) kloniert und als pS/pN (DNA-Impfstoffe) bezeichnet (Abbildung 1A). Das pE/PM-Protein wurde wie zuvor beschrieben konstruiert und identifiziert [15]. Die Impfstoffe wurden mit endotoxinfreien Maxiprep-Kits (Qiagen, Peking, China) hergestellt und die Sequenzen wurden mittels Sanger-DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Expression des S/N-Proteins wurde mittels Western Blot und Anti-S- (Sino Biological, Peking, China)/Anti-N-Antikörpern, verdünnt im Verhältnis 1:1000, bestätigt. Diese Experimente wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [15,18].

Abbildung 1. Design und Expression rekombinanter DNA-basierter SARS-CoV-2 S/N-Protein-Impfstoffkonstrukte. (A) Schematische Darstellung der rekombinanten DNA-basierten Impfstoffe, die SARS-CoV-2 Spike- (PS), Nukleokapsid- (pN), Hüll- (pE) und/oder Membranproteine ​​(PM) kodieren. (B) Die Zielproteinexpression in DNA-Impfstoffen wurde durch die Western-Blot-Analyse von 293T-Zellen validiert, die mit den pS/pN/pE/pM-Plasmiden transfiziert wurden.

2.3. Immunisierung und Herausforderung

Weibliche BALB/c-Mäuse (Charles River Laboratories, Frankreich) im Alter von 6 Wochen wurden im National Institute of Occupational Health and Poison Control in einer Umgebung mit 21 °C und kontrollierter Luftfeuchtigkeit und 12-stündigen Licht-/Dunkelzyklen gehalten. In der Zwischenzeit wurden Futter und Wasser nach Belieben zur Verfügung gestellt und alle Tierversuche wurden vom Ausschuss für Ethik von Tierversuchen des Chinesischen Zentrums für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten (China CDC) genehmigt. Die Forschung entsprach den einschlägigen ethischen Vorschriften.

Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen eingeteilt und an den Tagen 0, 21 und 42 über intramuskuläre Injektion plus Elektroporation (35 mg/50) mit pS/pN allein oder mit pS + pN oder pS + pE + PM co-immunisiert mL) (Abbildung 2) [19,20]. Kurz gesagt, DNA-Impfstoffe wurden in den Tibialis anterior (TA)-Muskel injiziert und sofort mit Strom unter Verwendung einer 5 mm voneinander entfernten Zwei-Nadel-Array-Elektrode (ECM830; BTX) mit Nadeln gepulst. Für die Analyse der humoralen Immunantwort wurden Seren der Mäuse gesammelt und die Milzen der Mäuse verarbeitet, um die zelluläre Immunantwort zu messen (Abbildung 2).

Abbildung 2. Schematische Darstellung der Immunisierung und der SARS-CoV-2-Herausforderung. Zeitlicher Verlauf der Impfung, der Provokation und der Blut-/Gewebeentnahme. BALB/C-Mäuse wurden zufällig in Gruppen eingeteilt.

SARS-CoV-2-Challenge-Experimente wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [15,21]. Kurz gesagt, die Mäuse wurden anästhesiert und dann intranasal mit 2,5 × 108 PFU Ad5-hACE2 in einem Gesamtvolumen von 45 µL transduziert. Fünf Tage nach der Transduktion wurden die Mäuse anästhesiert und dann intranasal mit 1 × 105 TCID50 SARS-CoV-2 (Wuhan/IVC HB-02/2019) in einem Gesamtvolumen von 50 µL Kochsalzlösung provoziert Puffer. Die gesamte Arbeit mit lebendem SARS-CoV-2 in Mausmodellen wurde in Laboratorien der Tierbiosicherheitsstufe 3 (ABSL-3) durchgeführt.

2.4. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA) wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [15]. Kurz gesagt, S (gekauft von Sino Biological)/N-Proteine ​​(ein Geschenk von Song), verdünnt in Carbonatpuffer (0,1 M, pH 9,6), wurden auf 96-well EIA/RIA-Platten (Thermo) aufgetragen Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) über Nacht bei 4 ◦C. Die Platten wurden mit 200 µL 10 % Ziegenserum in PBS bei 37 °C für 2 Stunden blockiert, gefolgt von fünfmaligem Waschen mit PBST. Anschließend wurden in 2 % Ziegenserum in PBS seriell verdünnte Serumproben zugegeben und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt von fünf Wäschen mit PBST. HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG-Ab (1:5000) wurde 1 Stunde lang bei 37 °C zugegeben. In jede Vertiefung wurden insgesamt 100 µL TMB-Substrat gegeben und mit 50 µL 2M H2SO4 gequencht. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm mit SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hongkong, China) gemessen.

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2.5. Pseudovirus-Infektions- und Neutralisierungsexperimente

Der Pseudovirus-Neutralisationstest wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [21,22]. Zuvor wurde ein Plasmid konstruiert, das das angestammte Virus-S-Protein exprimiert [22]. Das Spike-Protein-Gen der Omicron-Variante SARS-CoV-2 (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) wurde synthetisiert (ein Geschenk von Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) unter Verwendung eines für Säugetiere optimierten Codons und in den pcDNA3.1-Vektor kloniert, wie zuvor beschrieben [22]. Kurz gesagt, Plasmide, die einen Luciferase-Reporter exprimieren, und Plasmide, die das S-Protein exprimieren, wurden mit dem X-treme GENE HP DNA-Transfektionsreagenz in HEK 293T-Zellen co-transfiziert. Die Zellkultur wurde 6 Stunden nach der Transfektion aufgefrischt und der Pseudovirus-haltige Überstand wurde nach 48 Stunden geerntet und bei –70 °C gelagert. Im Pseudovirus-Neutralisationstest wurde dann eine gleiche Serum-Virus-Mischung mit 37 Volumina des Pseudovirus-haltigen Überstands inkubiert und dann dem verdünnten Serum zugesetzt. ◦C für 1 Stunde. Das Kulturmedium der Huh7.5-Zellen wurde dann durch 100 µL der Serum-Virus-Mischung ersetzt und 12 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Parallel dazu wurden Zellen getestet, die nur mit SARS-CoV-2-Pseudoviren kultiviert wurden. Anschließend wurden die Medien durch DMEM (2 % FBS) ersetzt und die Inkubation erfolgte 48 Stunden lang bei 37 °C. Anschließend wurde das Luciferase-Signal mit dem Bright-Glo Firefly-Luciferase-Kit (Promega) gemessen.

2.6. SARS-CoV-2-Neutralisierungstest

In diesem Experiment wurde SARS-CoV-2 (Wuhan/IGC-HB-02/2019) verwendet. Kurz gesagt, die Seren wurden ausgehend von einer Ausgangsverdünnung von 1:10 zweifach verdünnt, mit einem gleichen Volumen (10–15 pfu/Vertiefung) lebenden SARS-CoV-2 gemischt und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden sie zu den ausgesäten Vero-Zellen gegeben. Nach 48-stündiger Inkubation bei 37 °C wurde ein zytopathischer Effekt (CPE) beobachtet und 100 µL des Kulturüberstands wurden für die Nukleinsäureextraktion und Echtzeit-Fluoreszenz-Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR) geerntet. Die mittlere Neutralisationsdosis (ND50) wurde nach der Reed-Munch-Methode berechnet [15].

2.7. IFN-ELISpot-Assay

Die Peptidpools, die das gesamte S/N/E/M-Protein als aufeinanderfolgende 15-mere mit einer Überlappung von 10 Aminosäuren umfassen, wurden von Scilight Biotechnology, LLC synthetisiert. Pro Fläschchen waren etwa 2,5 mg jedes gereinigten Peptids im Peptidpool vorhanden. Das Experiment wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [18]. Kurz gesagt, 96-Well-Platten (BD ELISPOT Set, USA) wurden mit Anti-IFN-Capture-Ab beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden die Platten mit dem kompletten Kulturmedium blockiert. Splenozyten wurden geerntet, nachdem die Mäuse an den Tagen 35 und 120 eingeschläfert worden waren. Frische Einzelzellsuspensionen aus jeder Gruppe wurden mit 5 × 106 pro Vertiefung ausplattiert und Peptide wurden hinzugefügt. Die Platten wurden dann 22 Stunden lang bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert und mit einem ELISpot-Plattenlesegerät (Biosys, So. Pasadena, CA, USA) detektiert. Eine Spot-Forming Unit (SFU) stellt ein T-Zellen-sezernierendes IFN- dar.

2.8. Bewertung des Schutzes bei Mäusen nach der SARS-CoV-2-Herausforderung

Die Experimente wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [15,21]. Kurz gesagt, die Lungen wurden entnommen, nachdem die Mäuse eingeschläfert worden waren. Die Hälfte der Gewebe wurde für die Nukleinsäureextraktion, Echtzeit-Fluoreszenz-RT-PCR und TCID50 verwendet. Die andere Hälfte wurde zur pathologischen Untersuchung an das College of Veterinary Medicine der China Agricultural University geschickt.

2.9. Statistische Analyse

Ungepaarte t-Tests, Zwei-Wege-ANOVA-Tests und Dunnetts Mehrfachvergleichstest wurden mit GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC) durchgeführt. p-Werte < 0.05 wurden als statistisch signifikant angesehen (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Ergebnisse

3.1. Charakterisierung von DNA-Impfstoffen

Die E- und M-Proteinspiegel wurden mittels Western Blot nachgewiesen. Wir haben die Expression der kodierten S/N/E/M-Proteine ​​von SARS-CoV-2 in HEK-293T-Zellen, die mit pS/pN/pE/pM-Plasmiden transfiziert waren, mittels Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti gemessen -S/Anti-N-Antikörper und ein Anti--6 x His-Antikörper in den Zelllysaten. Die Banden entsprachen in etwa dem vorhergesagten Molekulargewicht der Proteine ​​S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) und M (22–25 kDa) (Abbildung 1B).

3.2. Robuste und nachhaltige Anti-S- und/oder Anti-N-IgG-Produktion, induziert durch pS- und/oder pN-DNA

Impfstoffe Serum wurde von BALB/c-Mäusen nach 35, 56, 96 und 120 Tagen gesammelt (Abbildung 2). Anti-S/Anti-N-IgG-Spiegel wurden mittels ELISA nachgewiesen. Das Ausmaß der durch pS oder pN induzierten S- oder N-spezifischen IgG-Reaktion war im Serum nach der ersten und zweiten Auffrischimpfung erhöht. Die Anti-S- und Anti-N-IgG-Titer waren in der pS + pN-Gruppe höher als in den anderen Gruppen; Der Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant (Abbildung 3A, B). Es wurden keine robusten E/M-Protein-spezifischen Antikörperreaktionen festgestellt, was mit den Ergebnissen einer früheren Studie übereinstimmt (Daten nicht gezeigt) [15].

Abbildung 3. B-Zell-Reaktionen auf SARS-CoV-2 in BALB/c-Mäusen. (A) Serum-IgG-Bindungsendpunkttiter für die SARS-CoV-2 S- (A) und N-Proteine ​​(B). (C) Neutralisationstiter wurden auf der Grundlage eines pseudotypisierten SARS-CoV-2-Virussystems bestimmt. (D) Anti-SARS-CoV-2-Neutralisationstiter wurden unter Verwendung eines SARS-CoV-2-Virus bestimmt. (E) Neutralisationstest basierend auf einem pseudotypisierten SARS-CoV-2 Omicron-Virussystem. Dargestellt sind die Hemmverhältnisse für die Seren aus den Gruppen „Mock“ (blau), „pS“ (rot), „pS + pN“ (grün), „pS + pE + pM“ (rosa) und „pN“ (orange). Fehlerbalken stellen das SEM dar, und die p-Werte wurden mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA und der Post-hoc-Analyse von Sidak berechnet, wobei * p < 0.05

3.3. Hohe Konzentrationen an neutralisierenden Antikörpern, hervorgerufen durch Co-Immunisierung mit pS- und pN-Impfstoffen

Die neutralisierenden Titer seriell verdünnter Serumproben wurden mithilfe des pseudotypisierten SARS-CoV-2-Virus bestimmt. Die höchsten Konzentrationen an neutralisierenden Antikörpern (nAbs) wurden in der pS + pN-Gruppe beobachtet, wobei die reziproken EC50-Titer im geometrischen Mittel 2988 (am Tag 35) und 3578 (am Tag 56) erreichten (Abbildung 3C). Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem Lebendvirus-Mikroneutralisationstest (MN) beobachtet, wobei die nAbs-Spiegel in der pS + pN-Gruppe an den Tagen 56 und 96 höher waren als die in der S-Gruppe (p < 0,05; Abbildung 3D). Darüber hinaus waren die nAbs-Werte in der pS + pN-Gruppe am 56. Tag (zweite Auffrischung) deutlich höher als am 35. Tag (p < 0,05; Abbildung 3D).

Die neutralisierende Aktivität jedes Impfschemas gegen die SARS-CoV-2-Omicron-Variante wurde anhand der pseudotypisierten Plattform und Serumproben weiter bestimmt. Das Neutralisationsprofil gegen das Omicron-Virus an den Tagen 35 und 56 war ähnlich dem gegen das Ahnenvirus (Abbildung 3E), was darauf hindeutet, dass die PS + pN-Behandlung eine kreuzneutralisierende Wirkung hatte.

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3.4. Durch DNA-Impfung induzierte T-Zell-Reaktionen

Wie zuvor beschrieben, wurden die T-Zell-Reaktionen gegen die SARS-CoV-2 S/N/E/M-Antigene mit IFN-ELISpot geschätzt, wie zuvor beschrieben [15]. Wie erwartet induzierten sowohl das PS + pN- als auch das pS + pE + pM-Regime am 12. Tag 0 signifikant höhere Mengen an IFN + T-Zellen, die für das S-Protein spezifisch sind, als am 35. Tag (p < 0). 05; Abbildung 4A). Darüber hinaus war die Anzahl der für das N-Protein spezifischen IFN + T-Zellen am Tag 120 (zweiter Boost) deutlich höher als am Tag 35 in der pS + pN-Gruppe (p < 0,05; Abbildung 4B). Schließlich war die Anzahl der für das M-Protein spezifischen IFN + T-Zellen am Tag 120 (zweiter Boost) in beiden Gruppen signifikant höher als am Tag 35 (p < 0,05; Abbildung 4D).

Abbildung 4. T-Zell-Reaktionen auf einzelne Strukturproteine ​​von SARS-CoV-2 in BALB/c-Mäusen. (A) T-Zell-Antworten wurden unter Verwendung von IFN-ELISpot in Splenozyten gemessen, die 20 Stunden lang mit überlappenden Peptidpools stimuliert wurden, die das SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, und (D) M-Proteine. Balken stellen den Mittelwert ± SD dar. Statistische Analysen wurden unter Verwendung einer Zwei-Wege-ANOVA und des Post-hoc-Tests von Sidak durchgeführt, wobei * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 und **** p < 0,0001.

3.5. Synergistischer Schutz durch Co-Immunisierung mit pS/pN oder pS/pE/pM

Anschließend bewerteten wir die Schutzwirkung von DNA-Impfstoffen anhand von hACE2-Mäusen, die nach der Exposition mit dem angestammten SARS-CoV-2-Virus immunisiert wurden. Nach der Herausforderung zeigten die Mäuse in der Scheingruppe einen allmählichen Gewichtsverlust. Im Gegensatz dazu zeigten die entweder mit pS oder pS+ immunisierten Mäuse unmittelbar nach der Infektion einen leichten Gewichtsverlust, gefolgt von einer Erholung (Abbildung 5A). In den mit pS, pS + pN oder pS + pE + pM geimpften Mäusen wurde kein lebendes Virus nachgewiesen. Darüber hinaus reduzierte die pS + pN-Impfung die viralen RNA-Kopienzahlen im Vergleich zu denen, die mit der pS-Impfung allein erhalten wurden, erheblich (p=0.0228; Abbildung 5B). Darüber hinaus zeigte die Lungenhistopathologie, dass Mäuse sowohl in der Schein- als auch in der pN-Gruppe fokale Entzündungsherde, Pleuraeinstülpungen, Alveolarkollaps, ein hohes Maß an entzündlicher Zellinfiltration und hämorrhagische Bereiche aufwiesen. Im Vergleich dazu zeigten Mäuse, die entweder mit pS + pN oder pS + pE + pM behandelt wurden, mildere histopathologische Veränderungen und niedrigere INHAND-Werte nach der Exposition als die andere Gruppe (Abbildung 5C).

Abbildung 5. Schutzwirkung der Immunisierung nach der Herausforderung mit dem lebenden SARS-CoV-2-Virus. (A) Mäuse wurden drei Tage nach der Belastung täglich gewogen (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM), n=4). (B) Infektiöser SARS-CoV-2-Titer in Lungenhomogenaten am Tag drei nach der Exposition, bestimmt über den TCID5{{10}}-Assay und die RNA-Kopienzahl. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließender Dunnett-Mehrfachvergleichskorrektur ermittelt (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 und **** p < 0,0001). (C) Histopathologische Analyse der Lunge mittels H&E-Färbung.

4. Diskussion

In dieser Studie induzierte die gleichzeitige Immunisierung mit zwei DNA-Impfstoffen, die die S- und N-Proteine ​​exprimieren, hohe Mengen an nAbs und war hochwirksam bei der Reduzierung der SARS-CoV-2-Viruslast bei Mäusen. DNA-Impfstoffe, die das S-Protein exprimierten, induzierten nach drei Immunisierungen erhöhte S-Protein-spezifische zelluläre Immunitätsniveaus, wenn Mäuse gleichzeitig mit N/E- und M-Proteinen immunisiert wurden, und milderten die histopathologischen Veränderungen nach der Exposition. Nach unserem besten Wissen ist dies der erste Bericht, der die synergistische Verbesserung der Immunität und des Schutzes bei Mäusen aufzeigt, die einen DNA-Impfstoff verwenden, der das S-Protein kodiert, wenn sie mit DNA-Impfstoffen kodiert werden, die andere Strukturproteine ​​von SARS-CoV{{8 kodieren }}.

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In mehreren Studien wurden immundominante B-Zell-Epitope in N-Antigen-Regionen beobachtet. N-basierte Impfstoffe können normalerweise keine nAbs induzieren, wahrscheinlich weil das N-Protein nicht auf der Virusoberfläche angezeigt wird. Bemerkenswert ist, dass die gleichzeitige Immunisierung mit den S- und N-Proteinen höhere nAb-Spiegel gegen das Vorfahren- und Omicron-SARS-CoV-2-Virus hervorrief als die anderen Gruppen. Erhöhte nAb-Reaktionen sind mit einer besseren Virusclearance und Schutzwirkung verbunden. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die pS + pN-Behandlung bei der Reduzierung der SARS-CoV-2-Viruslast nach der Infektion wirksamer war als die pS-Behandlung allein. In einer früheren Studie wurde berichtet, dass Hamster, die mit einem Impfstoff immunisiert wurden, der die M- und N-Proteine ​​gleichzeitig exprimiert, vor schwerem Gewichtsverlust und Lungenpathologie geschützt waren und nach der SARS-CoV-2-Exposition deutlich reduzierte Virustiter im Oropharynx und in der Lunge aufwiesen. was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt [23]. Leider kann die Verringerung der Virustiter nicht spezifisch dem M- oder N-Protein zugeschrieben werden, und die nAb-Spiegel wurden in dieser Studie nicht bewertet. Eine SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoffstudie berichtete, dass die S + N-Koimmunisierung eine verstärkte S-spezifische CD8+-T-Zell-Reaktion und eine neutralisierende Antikörperaktivität induzierte, was einen besseren Schutz in der Lunge gegen das Delta bot Variante im Vergleich zu S allein, was mit den Ergebnissen dieser Studie übereinstimmt [24]. Eine andere Studie berichtete, dass das N-Protein des übertragbaren Gastroenteritis-Coronavirus die Synthese neutralisierender Antikörper förderte, wenn Schweine-TGEV-IMMUNE-Zellen mit einer Kombination aus S- und N-Proteinen in vitro stimuliert wurden, und dieser Effekt könnte durch die Reaktion der Helfer-T-Lymphozyten erklärt werden das N-Protein [25].

Immundominante CD4+/CD8+-T-Zell-Epitope in N-Antigen-Regionen wurden bereits zuvor identifiziert. Mehrere Studien haben berichtet, dass Impfstoffe, die auf dem SARS-CoV-2 N-Protein basieren, wirksam zelluläre Immunantworten auslösen. Die S + N-Gruppe zeigte nach drei Immunisierungen erhöhte S-Protein-spezifische zelluläre Immunitätswerte. In einer SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoffstudie wurde berichtet, dass kombinatorisches S + N im Vergleich zu S allein eine verstärkte S-spezifische CD8+-T-Zell-Reaktion induzierte, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt [24]. Eine andere Studie berichtete, dass T-Zell-Reaktionen auf S- und N-Antigene nach der Dual-Antigen-hAd5 S + N-Prime-Impfung allein denen von zuvor mit SARS-CoV-2- infizierten Patienten entsprachen, und in silico-Vorhersagemodellen von T-Zellen Die Epitop-HLA-Bindung deutete darauf hin, dass T-Zell-Reaktionen auf den hAd5 S + N-Impfstoff ihre Wirksamkeit gegen die B.1.351-Variante behalten. Darüber hinaus zeigte Plasma von zuvor mit SARS-CoV-2-infizierten Patienten eine höhere Bindungsaffinität zu Zellen, die das Dual-Antigen-S-Fusion + N-ETSD-Konstrukt exprimieren, als zum hAd5 S-Fusion allein, was weiter darauf hindeutet, dass die Immunogenität des Der S+N-Doppelantigen-Impfstoff ist besser als der S-Einzelantigen-Impfstoff [26].

Das lebende Virus wurde in der Lunge nicht nachgewiesen und der Gewichtsverlust nach der Exposition wurde in den Gruppen pS, pS + pN und pS + pE + pM abgemildert, während die pN-Behandlung den Virustiter nicht wirksam reduzierte. Diese Ergebnisse unterstreichen die Unentbehrlichkeit und Wirksamkeit des S-Proteins als Impfstoffziel. Bemerkenswert ist, dass die gleichzeitige Immunisierung mit pS und pN bessere Auswirkungen auf die Virusclearance hatte als pS oder pN. Die pS + pE + pM-Gruppe zeigte weniger histopathologische Veränderungen in der Lunge, was mit den Ergebnissen unserer vorherigen Studie übereinstimmt [15]. Die S + N-Gruppe wies im Vergleich zu der mit S/N allein immunisierten Gruppe niedrige virale RNA-Kopien in der Lunge, einen geringeren Gewichtsverlust und eine schnelle Erholungszeit nach der SARS-CoV-2-Provokation auf, was mit dem übereinstimmte Ergebnisse dieser Studie. Allerdings konnte keine der Gruppen neutralisierende Antikörpertiter nachweisen, was durch Unterschiede in der Impfstoffvielfalt und den Versuchstieren erklärt werden könnte [26]. In einer SARS-CoV-2-Adenovirus-Vektorimpfstoffstudie wurde berichtet, dass der S-Impfstoff nur bei gleichzeitiger Immunisierung mit einem N-Impfstoff einen akuten Hirnschutz bot [27]. In einer anderen Studie wurden Tri: ChAd-, Bi: ChAd- und Mono: ChAd-Impfstoffe entwickelt, die die Proteine ​​S1/N/RdRp, N/RdRp bzw. S1 exprimieren, und sie in einem B.1.351-Tiermodell getestet. In den Mono: ChAd-Lungen wurde eine ausgedehnte makroskopische Pathologie beobachtet, wohingegen die Bi: ChAd- und Tri: ChAd-Lungen nahezu frei von dieser Pathologie zu sein schienen [28].

Darüber hinaus hatten ungeimpfte Tiere eine hohe Viruslast in der Lunge, wohingegen die Tri:ChAd-Behandlung die Viruslast signifikant um 3,5 Logs reduzierte. Im Vergleich dazu reduzierten sowohl Bi:ChAd- als auch Mono:ChAd-Impfstoffe die Viruslast nur mäßig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Schutzwirkung des S/N-Doppelantigen-Impfstoffs gegen Varianten möglicherweise besser ist als die des S-Einzelantigen-Impfstoffs, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt [28]. Einige Studien haben berichtet, dass N-Protein-immunisierte Mäuse nach einer SARS-CoV-Infektion eine schwere Lungenentzündung entwickeln [29–31]. Frühere Studien haben auch berichtet, dass die Immunisierung mit einem Adenovirus-Vektorimpfstoff, der das Maus-Hepatitis-Virus-N-Protein exprimiert, Mäuse vor tödlichen Infektionen schützt, was zeigt, dass das N-Protein eine schützende Wirkung haben könnte [32]. Darüber hinaus wies die mit dem CRT/N-DNA-Impfstoff immunisierte Gruppe nach der Exposition einen deutlich reduzierten Virustiter auf, wobei ein Vacciniavirus das SARS-CoV-N-Protein exprimierte [33].

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

Eine Studie zum S-Protein zeigte, dass der kombinierte DNA/Protein-Impfstoff sowohl humorale als auch zelluläre Immunität besser induzierte als der DNA/Protein-Impfstoff allein [8]. Impfstoffe, die nur auf das S-Protein abzielen, haben eine geringere Wirksamkeit beim Schutz vor leichtem bis mittelschwerem COVID-19 gezeigt, das durch neu auftretende Varianten verursacht wird. Die Rolle konservierter SARS-CoV-2-Strukturproteine, einschließlich der N/E/M-Proteine, verdient Aufmerksamkeit bei der Entwicklung und Anwendung von Impfstoffen, da impfstoffinduzierte T-Zell-Reaktionen gegen konservierte Epitope im Allgemeinen von Mutationen nicht beeinflusst werden . Eine Studie berichtete, dass SARS-genesene Patienten (n=23) auch 17 Jahre nach dem Ausbruch von 2003 noch über langlebige Gedächtnis-T-Zellen verfügten, die auf das SARS-CoV-N-Protein reagierten und eine starke Kreuzreaktivität mit dem SARS-CoV zeigten. {15}} N-Protein, was die Verwendung des N-Proteins als kreuzschützendes Impfstoffziel weiter bestätigt [34]. Diese Studie zeigte, dass die pS/pN-Koimmunisierung mit höheren nAb-Reaktionen, einer besseren viralen Clearance und verbesserten zellulären Immunantworten verbunden war und im Vergleich zu pS allein einen besseren Schutz nach der SARS-CoV-2-Exposition bieten könnte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass SARS-CoV-2-Varianten viele Tierarten infizieren, und bei einigen Wildtieren und Haustieren wurde eine Übertragung von Mensch zu Tier beobachtet [7]. Daher benötigt der veterinärmedizinische SARS-CoV-2-Impfstoff mehr Aufmerksamkeit. Darüber hinaus kann die Nanotechnologie ein wirksames Instrument zur Optimierung von Impfstoffen sein und verdient mehr Aufmerksamkeit [2].

Diese Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens haben wir die DNA-Impfstrategie nur bei BALB/c-Mäusen beobachtet, und zukünftige Studien sollten die immunogenen Wirkungen dieser Impfschemata in anderen Tiermodellen untersuchen. Zweitens ist zusätzliche Forschung erforderlich, um die molekularen Mechanismen vollständig zu verstehen, die den verstärkten nAb- und S-spezifischen CD8-T-Zell-Antworten zugrunde liegen, die durch die Koimmunisierung mit den S- und N-Proteinen induziert werden, und um dieses Wissen zur Optimierung von COVID zu nutzen.-19 Impfstoffdesign. Schließlich verdient die Funktion von N-Protein-spezifischen Antikörpern weitere Untersuchungen.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

Zusammenfassend bewertete diese Studie das immunschützende Potenzial der Koimmunisierung mit den SARS-CoV-2 S-, N-, E- und M-Proteinen. Mehrere Impfstoffe, die nur auf das S-Protein abzielen, haben eine verringerte Schutzwirkung auf die neu auftretenden Variantenstämme. Unsere Ergebnisse werden den Grundstein für die Entwicklung eines kreuzreaktiven COVID-19-Impfstoffs legen, um aktuelle und neu auftretende SARS-CoV-2-Varianten zu kontrollieren und potenzielle -Coronavirus-Pandemien zu verhindern.

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