Systematische Identifizierung und Vergleich der exprimierten Profile exosomaler MiRNAs bei Schweinen, die mit dem NADC30-ähnlichen PRRSV-Stamm infiziert sind

Einfache Zusammenfassung:Exosomen spielen eine einzigartige Rolle bei der Virusinfektion, der Antigenpräsentation und der Unterdrückung/Förderung der körpereigenen Immunität. Das Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) ist einer der schädlichsten Krankheitserreger in der Schweineindustrie. Hier verwendeten wir den PRRSV NADC30-ähnlichen CHsx1401-Stamm, um 42-Tage alte Schweine künstlich zu infizieren, Serum-Exosomen zu isolieren und 33 signifikant unterschiedlich exprimierte (DE) exosomale miRNAs zwischen Infektions- und Kontrollgruppen zu identifizieren 18 DE-miRNAs, die mit einer PRRSV-Infektion und -Immunität assoziiert sind, wurden als potenzielle funktionelle Moleküle untersucht, die an der Regulierung der PRRSV-Virusinfektion durch Exosomen beteiligt sind.

Abstrakt:Exosomen sind biologische Vesikel, die von Zellen abgesondert und freigesetzt werden, die als Vermittler der interzellulären Kommunikation fungieren und eine einzigartige Rolle bei der Virusinfektion, der Antigenpräsentation und der Unterdrückung/Förderung der körpereigenen Immunität spielen. Das Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) ist einer der schädlichsten Krankheitserreger in der Schweineindustrie und kann zu Fortpflanzungsstörungen bei Sauen, Atemwegserkrankungen bei Schweinen, verminderter Wachstumsleistung und anderen Krankheiten führen, die zur Schweinesterblichkeit führen. In dieser Studie verwendeten wir den PRRSV NADC30-ähnlichen CHsx1401-Stamm, um 42- Tage alte Schweine künstlich zu infizieren und Serum-Exosomen zu isolieren. Basierend auf der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie wurden 305 miRNAs in Serum-Exosomen vor und nach der Infektion identifiziert, von denen 33 miRNAs zwischen den Gruppen signifikant unterschiedlich exprimiert wurden (13 relativ hochreguliert und 20 relativ herunterreguliert). Die Sequenzkonservierungsanalyse des CHsx1401-Genoms identifizierte 8 konservierte Regionen, von denen insgesamt 16 differentiell exprimierte (DE) miRNAs voraussichtlich an die konservierte Region binden, die den 3 am nächsten liegt0 UTR des CHsx1401-Genoms, einschließlich 5 DE-miRNAs, die an CHsx1401 3 binden können0 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). Weitere Analysen ergaben, dass die Zielgene differentiell exprimierter miRNAs weitgehend an Signalwegen im Zusammenhang mit der exosomalen Funktion und der angeborenen Immunität beteiligt waren und dass 18 DE-miRNAs (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 usw.), die mit einer PRRSV-Infektion und Immunität assoziiert sind, wurden untersucht als potenzielle funktionelle Moleküle, die an der Regulierung der PRRSV-Virusinfektion durch Exosomen beteiligt sind.

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Schlüsselwörter:PRRSV; Serum-Exosom; miRNAs

1. Einleitung

Das Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) ist ein einzelsträngiges Positivstrang-RNA-Virus mit einer Hüllstruktur, das zur Ordnung Nidovirales, Familie Arteriviridae, Gattung Betaarterivirus gehört [1,2]. Unter dem Gefrierelektronenmikroskop ist es kugelförmig oder ellipsoidförmig mit einem Durchmesser von 50–65 nm [3,4]. Das PRRSV-Genom ist etwa 15 kb lang, hat eine Kappe von 50 und einen PolyA-Schwanz von 30 und enthält mindestens 10 offene Leserahmen (ORFs), die sowohl am 50- als auch am 30-Terminus von nicht translatierten Regionen (UTRs) flankiert werden [5,6] und ist von Nukleokapsidprotein umhüllt und mit einer Lipiddoppelschicht beschichtet, um Viruspartikel zu bilden. Exosomen gehören zu Vesikeln mit einschichtigen Membranstrukturen und haben die gleiche topologische Struktur wie Zellen [7]. Unter dem Elektronenmikroskop ist die Form „becherförmig“ oder „scheibenförmig“ [8,9]. Exosomen können lange Zeit im Kreislaufsystem existieren, und Substanzen in Exosomen können von benachbarten Zellen oder entfernten Rezeptorzellen absorbiert werden und dann die Rezeptorzellen so regulieren, dass sie am Austausch von genetischem Material zwischen Zellen teilnehmen [10,11]. Sie bestehen hauptsächlich aus Membranoberflächensubstanzen und transportierten Inhalten, einschließlich Zelloberflächenrezeptoren, Membranproteinen, löslichen Proteinen, Lipiden, RNA (mRNA, miRNA, lncRNA und virale RNA usw.), genomischer DNA und mitochondrialer DNA [12–14 ]. MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse von 18–25 Nukleotiden (nt) langen, evolutionär konservierten endogenen, nichtkodierenden, einzelsträngigen kleinen RNAs, die den Translationsprozess hemmen, indem sie den Abbau der Ziel-mRNA induzieren oder sich an 30 UTR der Ziel-mRNA binden zur posttranskriptionellen Gen-Stummschaltung und dann zur Regulierung der Genexpression auf der posttranskriptionellen Ebene [15–17]. Es wird geschätzt, dass miRNAs mehr als 60 % der Säugetiergene posttranskriptionell regulieren [18,19]. MiRNAs spielen eine wichtige Rolle in der interzellulären Kommunikation und können auch als potenzielles funktionelles Molekül für die Infektion, Übertragung und Abwehr von Krankheiten und Viren eingesetzt werden [20]. Eine wachsende Zahl von Studien hat gezeigt, dass miRNAs in Körperflüssigkeiten wie Speichel, Urin, Muttermilch und Blut vorhanden sein können und über das Flüssigkeitskreislaufsystem des Körpers wirken [21,22]. Exosomale miRNAs gelten als endogene Regulatoren der Genexpression und des Stoffwechsels und können auf verschiedene pathologische Zustände hinweisen [23,24].

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In den letzten zwei Jahrzehnten wurde gezeigt, dass miRNAs eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Entwicklung von Immunzellen, angeborenen und erworbenen Immunantworten spielen. Es wird berichtet, dass einige andere miRNAs die PRRSV-Infektion auf folgende Weise beeinträchtigen, direkt auf das PRRSV-Genom oder den PRRSV-Rezeptor abzielen oder eine Rolle bei der Regulierung der angeborenen Immunantwort des Wirts spielen. Die miR-26-Familie kann die Virusreplikation erheblich schädigen, und miR-26a kann die Replikation von Typ-1- und Typ-2-PRRSV-Stämmen in porcinen Alveolarmakrophagen (PAMs) hemmen, indem sie das Typ-I-Interferon (IFN) reguliert. Weg, der effizienter ist als miR-26b [25,26]. Es wurde festgestellt, dass miR-30c und miR-125b die angeborene Immunantwort des Wirts modulieren, indem sie auf den Typ-I-IFN-Signalweg bzw. den NF-κB-Signalweg abzielen [27–29]. MiR-23, miR-378 und miR-505 sind antivirale Wirtsfaktoren, die auf PRRSV abzielen und konservative Zielstellen in Typ-2-PRRSV-Stämmen haben [30]. Gleichzeitig wurde festgestellt, dass miR-506 des Wirts die PRRSV-Replikation hemmt, indem es direkt auf den PRRSV-Rezeptor CD151 in MARC{19}}-Zellen abzielt [31]. miR-181 kann auch indirekt die PRRSV-Replikation hemmen, indem es den PRRSV-Rezeptor CD163 in Blutmonozyten und PAMs herunterreguliert [32]. Darüber hinaus können miRNAs die PRRSV-Replikation fördern, indem sie in die grundlegende Zellphysiologie eingreifen. MiR-24-3p und miR-22 zielen während einer PRRSV-Infektion direkt auf 30 UTR von HO-1, um der Hemmung der Hämoxygenase-1 (HO-1) zu entgehen, a Hitzeschockprotein (auch bekannt als HSP32) auf PRRSV [33,34]. Es ist bekannt, dass Schweine anfälliger für PRRSV sind und sich weniger gut gegen das Eindringen dieses Erregers in den Organismus wehren können [35]. In der vorliegenden Studie wurden die angeborene und erworbene Immunität von mit diesem Virus infizierten Schweinen auf molekularer Ebene anhand eines im Feld verbreiteten Stamms untersucht. Ein Serum-Exosomen-Isolierungskit, Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Western Blot (WB) wurden verwendet, um Serum-Exosomen vor und nach der Infektion mit PRRSV zu isolieren und zu identifizieren, gefolgt von einer kleinen RNA-Sequenzierungsanalyse, Identifizierung, und Analyse der Ergebnisse der differentiellen Expression mithilfe bioinformatischer Methoden, um mehrere PRRSV-assoziierte Serum-Exosomen-miRNAs zu erhalten, gefolgt von der Identifizierung der Datenergebnisse mithilfe quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR).

2. Materialien und Methoden

2.1. Tierversuche

Sechs PRRSV-Antigen- und Antikörper-doppelnegative gesunde 42- Tage alte große weiße Schweine wurden zur Isolierung, Gesundheitsfürsorge und Anpassung an die Umwelt in das Schweinesauberfütterungssystem gegeben. Alle Schweine durften ohne Einschränkungen essen und trinken. Als sie mit den Bedingungen im Isolator vertraut waren, wurden die Schweine nasal mit 2 ml 105 TCID50/ml PRRSV NADC30-wie CHsx1401 geimpft, was von den Vorgängern erwähnt wurde [36,37]. Das Blut der Schweine vor (Kontrollgruppe, n=6) und 7 Tage nach (Behandlungsgruppe, n=6) Virusimpfung wurde zur Serumisolierung aus der vorderen Hohlvene entnommen. Die Zelltrümmer im Serum wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 3000 g entfernt. Alle Tierversuche in unserer Studie wurden von der Tierethikkommission des Instituts für Tierwissenschaften der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften (CAAS) (Peking, China), IAS2022-130, genehmigt.

2.2. Isolierung und Reinigung von Serum-Exosomen

Die Exosomenisolierung und -reinigung wurde mit dem exoEasy Maxi Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland, Kat.-Nr. 76064) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

2.3. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Extrahierte Exosomensuspensionen wurden auf das mit Formvar-Carbo beschichtete Kupfernetz getupft, die Exosomen wurden mit PBS gespült und 3 Minuten lang bei Raumtemperatur einer Standard-Uranylacetat-Färbung unterzogen. Nach mehrminütigem Trocknen bei Raumtemperatur wurde das Gitter sichtbar gemacht und bei 100 kV mit einem Transmissionselektronenmikroskop (HT-7700, Hitachi-High Tech, Tokio, Japan) fotografiert.

2.4. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)

Extrahierte Exosomen wurden mit 1 × PBS verdünnt, indem das Volumen von 10 auf 30 µL geändert wurde. Nachdem die Probe getestet wurde, wurden die Konzentration und Größe der Serum-Exosomen mit einem N30E-Durchfluss-Nanoanalysator gemäß den Anweisungen des Herstellers (NanoFCM, Xiamen, China) analysiert.

2.5. Westlicher Fleck

Die extrahierten Exosomenproben wurden zu RIPA-Lysat gemischt mit Proteaseinhibitor (Invitrogen, Waltham, MA, USA) und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) gegeben, um das Exosomenprotein zu extrahieren, das 30 Minuten lang auf Eis lysiert wurde. Anschließend haben wir gemäß den Anweisungen des Bradford-Kits die Konzentration des Serum-Exosomenproteins quantifiziert. Exosomenproteine ​​wurden einer thermischen Denaturierung unterzogen. Die gleiche Proteinmenge wurde auf einem 12 % SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und dann auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran (Millipore, Burlington, MA, USA) übertragen. Es wurde in TBST mit 5 % Magermilchpulver eingeweicht und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur verschlossen. Wir haben die Membran über Nacht bei 4 °C in den verdünnten Primärantikörper (Anti-CD9-Antikörper, Abcam, Boston, MA, USA, #ab92726; Anti-CD81-Antikörper, Abcam, Boston, MA, USA, #ab109201) getaucht und erholt der primäre Antikörper. Wir tränkten die Membran mit dem verdünnten Sekundärantikörper, inkubierten sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur und gewannen den Sekundärantikörper zurück. Wir legten den gewaschenen PBST-Film auf den Frischhaltefilm, fügten das gleiche Volumen einer gemischten chromogenen ECL a/b-Lösung hinzu und platzierten ihn in den Chemilumineszenz-Imager.

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2.6. Exosomale kleine RNA-Sequenzierung und Datenanalysen

Die Gesamt-RNA aus den Exosomen wurde mit Trizol gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Anschließend ermittelten wir die RNA-Konzentration und den Wert der optischen Dichte (OD) sowie den Abbau und die Reinheit der RNA mittels 1 %iger Agarosegelelektrophorese. In der Zwischenzeit wurde der Agilent Bioanalyzer 2100 zum Nachweis der Integrität von RNA verwendet. Wir haben die Gesamt-RNA der Exosomen nach Qualitätsprüfung verwendet. Gemäß den Anweisungen des Herstellers haben wir das NEB NEXT Multiplex Small RNA Library Prep Set für Illumina® (Illumina, San Diego, CA, USA) verwendet. Das Kit bereitete eine kleine RNA-cDNA-Bibliothek vor und sequenzierte sie, um 50 nt Single-End-Reads durch die Illumina Novaseq 6000-Plattform zu erzeugen. Alle Verfahren zur Herstellung kleiner RNA-Bibliotheken wurden von Novogene (Peking, China) durchgeführt. Die Daten nach der Qualitätskontrolle wurden mithilfe von Bowtie mit dem Schweine-Referenzgenom (Sus scrofa 11.1) abgeglichen. Bekannte miRNAs wurden durch die Datenbank miRbase (v22.0) [38] (https://www.mirbase.org, abgerufen am 14. Januar 2022), miRdeep2 (v0.0.5) [39] und miRevo (v1.1) identifiziert ) [40] und wurden zur Vorhersage neuer miRNAs verwendet. Gleichzeitig wurde die differentielle Expressionsanalyse für miRNAs von DESeq (v1.24.0) durchgeführt [41], was |fold change| erforderte > 1,6 und p < 0,05. Die Ausrichtung wurde mit MEGA (V11) [42] durchgeführt, gefolgt von einer Einzelbasenbewertung mit PHAST (v1.6.9) [43] und der Bewertung der am stärksten konservierten Regionen von 10 Virusgenen, einschließlich WUH3 (GenBank-Zugangsnummer HM853973), VR2332 ( GenBank-Zugangsnr. U87392), JXA1 (GenBank-Zugangsnr. EF112445), CH-1a (GenBank-Zugangsnr. AY032626), NADC30 (GenBank-Zugangsnr. HN654459), HUN4 (GenBank-Zugangsnr. EF635006), HLJZD 22-1812 (GenBank-Zugangsnr. MN648450), SC/DJY (GenBank-Zugangsnr. MT075480) und Lelystad (GenBank-Zugangsnr. M96262.2). RNAhybrid (V2.0) [44] wurde verwendet, um die Bindung der identifizierten miRNA-Sequenz an die 3 0-UTR des CHsx1401-Virusgenoms vorherzusagen. Miranda (v3.3a) und RNAhybrid wurden zur gezielten Genvorhersage verwendet. Das Clusterprofil [45] R-Paket wurde für die funktionelle Anreicherungsanalyse von Zielgenen durch GO (Gene Ontology) und die Signalweganreicherungsanalyse durch KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) verwendet.

2.7. Validierung der miRNA-Expression durch RT-qPCR

Die Gesamt-RNA wurde aus Serum-Exosomen unter Verwendung von Trizol (Invitrogen, Shanghai, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Die isolierte RNA wurde durch RT-qPCR an Proben (n=6 pro Gruppe) verifiziert. Die cDNA wurde gemäß den Anweisungen des miRNA-1st-Strang-cDNA-Synthesekits (durch Stammschleife) (Vazyme, Nanjing, China) synthetisiert und die Fluoreszenzquantifizierung wurde unter Verwendung von ABI 7500 gemäß durchgeführt Anleitung des miRNA universal SYBR qPCR Mastermix (Vazyme, Nanjing, China). Die verwendeten thermischen Zyklusparameter waren wie folgt: die erste Stufe: 95 ◦C für 30 s; Stufe 2: 95 °C für 5 s, 60 °C für 34 s und 40 Zyklen; Stufe 3: 95 °C für 15 Sekunden, 60 °C für 1 Minute und 95 °C für 15 Sekunden. Primersequenzen von miRNAs, dem U6-Gen, wurden als Referenz verwendet (46) und in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Alle qRT-PCR-Verifizierungen wurden unter Verwendung von drei biologischen Replikaten und mit drei Replikaten für jede Probe durchgeführt. Die relative Häufigkeit der Transkripte wurde mit der 2-Ct-Methode berechnet und SPSS (v22.0) und GraphPad Prism (v8.0) wurden für die Datenanalyse bzw. Kartierung verwendet. p < 0,05 bedeutet, dass der Unterschied statistisch signifikant ist.

3. Ergebnisse

3.1. Relativer Wert von Antigen und Antikörper nach Virusinokulation

Die Ergebnisse der PRRSV-Antigen- und Antikörpertests vor (Tag 0) und nach (Tag 7) der Herausforderung sind in Tabelle 1 aufgeführt. Der serologische Nachweis des PRRSV-Antigens und des Antikörpers vor der Herausforderung war negativ, und das Antigen war negativ positiv nach der Herausforderung, was darauf hinweist, dass die Schweine erfolgreich mit CHsx1401 infiziert wurden.

3.2. Isolierung und Identifizierung von Serum-Exosomen

Die aus Serum isolierten Vesikel wurden durch TEM entdeckt. Die meisten Vesikel können die konkaven, untertassen- oder scheibenförmigen Exosomen in der Mitte erkennen. Der Membranrand der Exosomen ist sichtbar und die Morphologie ist relativ vollständig (Abbildung 1A, B). Die Nanopartikel-Tracking-Analyse ergab, dass 95,73 % der Exosomen einen Durchmesser von 30–150 nm hatten, hauptsächlich etwa 72,25 nm, mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 76,22 nm, was mit den Größenmerkmalen der Exosomen übereinstimmte (Abbildung 1C). Dieser Größenbereich ähnelte dem durch TEM ermittelten und bestätigte die Identität dieser Vesikel als Exosomen. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die aus den Serumproben isolierten Vesikel positiv für CD9- und CD81-Proteine ​​waren (Abbildung 1D). Die oben genannten Merkmale entsprechen den Exosomen-Identifizierungsstandards, die von der International Society for Extrace Vesicles (ISEV) in MISEV2018 formuliert wurden [47].

Tabelle 1. Antigen und Antikörper von (Tag 0) und (Tag 7) mit Challenge-Virus.

Abbildung 1. Hauptmerkmale von Serum-Exosomen. (A, B) zeigen die morphologischen Eigenschaften von Vesikeln mittels TEM. Die Maßstabsbalken sind 500 nm bzw. 100 nm. (C) NTA zeigt den Durchmesser und die Konzentration der meisten Vesikel. (D) Western Blot zeigte das Vorhandensein der Exosomenmarker CD81 und CD9 in Serum-Exosomen. Hinweis: Bei den „Mix in WB“-Ergebnissen handelt es sich um die gemischte Probensuspension, die mit dem exoEasy Maxi-Kit isoliert wurde

3.3. Kleine RNA-Sequenzierung von Serum-Exosomen

Für jede Stichprobe erreichten die sauberen Daten 0,5 GB und der Basisprozentsatz für Q30 lag über 96,20 %. Die sauberen Messwerte jeder Probe wurden mit dem Referenzgenom des Schweins abgeglichen. Unter den 12 Proben erhielt die Kontrollgruppe 10.920.887, 10.248.696, 10.109.117, 10.655.494, 9.217.285 bzw. 9.782.523 Messwerte. Die Behandlungsgruppe erhielt jeweils 11.889.518, 10.593.504, 10.593.504, 12.846.080, 10.105.325, 11.729.451 und 9.789.542 Messwerte. Im Durchschnitt umfassten 77,96 % der gesamten sauberen Lesevorgänge eine Länge von 19–22 Nukleotiden (nt) (Abbildung 2A). Die Lesevorgänge nach der Qualitätskontrolle machten mehr als 92,59 % der Gesamtlesevorgänge aus. Die verarbeiteten sauberen Lesevorgänge wurden mit dem Referenzgenom des Schweins abgeglichen, und die Kartierungsrate von 12 Bibliotheken auf dem Genom betrug mehr als 92,30 % und die Kartierungsrate betrug 94,98 % (Abbildung 2B). Dies zeigte, dass die konstruierte exosomale miRNA-Bibliothek im Serum von hoher Qualität und für die weitere Analyse geeignet war. Einzelheiten sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt.

Abbildung 2. Übersicht über die kleinen RNA-Transkriptomdaten. (A) Längenverteilung der Lesezahlen von Serum-Exosomenproben (nt=Nukleotide); (B) Rate von 12 Proben, die dem Referenzgenom zugeordnet sind

3.4. Differentielle Expressionsanalyse von miRNAs

Nach quantitativer Analyse der identifizierten miRNA-Expression wurden miRNAs anhand der zuvor in Abschnitt 2.6 beschriebenen Schwellenwerte gescreent. Insgesamt wurden 305 miRNAs vor und nach der Inokulation des Stammes CHsx1401 erhalten (Kontrolle, n=6; Behandlung, n=6). Insgesamt wurden 33 differentiell exprimierte (DE) miRNAs zwischen den beiden Gruppen identifiziert, 13 DE miRNAs wurden hochreguliert und 20 DE miRNAs wurden in der Behandlungsgruppe herunterreguliert (Abbildung 3 und Ergänzungstabelle S3).

3.5. Funktionelle Anreicherungsanalyse von miRNA-Zielgenen

Insgesamt 7283 Zielgene wurden von 33 DE-miRNAs vorhergesagt, und die Funktionen der Zielgene konzentrierten sich hauptsächlich auf die positive Regulierung der MAPK-Kaskade, den Lipidstoffwechselprozess, die Regulierung der intrazellulären Signaltransduktion, die ERK1- und ERK2-Kaskade usw. (Abbildung 4A). ). Im Hinblick auf die molekularen Funktionen konzentrieren sich die unterschiedlich exprimierten miRNA-Zielgene hauptsächlich auf die regulatorische Aktivität des GTP-Enzyms, die Kinaseaktivität, die regulatorische Aktivität der Nukleosidtriphosphatase und andere Funktionen im Zusammenhang mit der Signaltransduktion und dem Energiestoffwechsel (Abbildung 4B). Darüber hinaus sind die Zielgene unter den Zellkomponenten hauptsächlich an den biologischen Funktionen von supramolekularen Polymeren, Golgi, Autophagosomen, Zelloberfläche, frühen Endosomen usw. beteiligt (Abbildung 4C). Die Funktionen dieser Komponenten stehen in engem Zusammenhang mit der Bildung von Exosomen, was auch die Genauigkeit der Sequenzierung erklärt. Die Analyse der Anreicherung des KEGG-Signalwegs zeigte, dass die Zielgene in Bezug auf Endozytose, den MAPK-Signalweg, den Rap1-Signalweg, den Sphingolipid-Signalweg und den PI3K-Akt-Signalweg signifikant angereichert waren (p < 0.05) (Abbildung 5A). ). Gleichzeitig wurden die angereicherten Pfade klassifiziert und analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass der KEGG-Signalweg des Zielgens hauptsächlich bei der Verarbeitung von Umweltinformationen, menschlichen Krankheiten und biologischen Systemen angereichert war (Abbildung 5B).

Abbildung 3. Differenzielle Expression von miRNAs in Exosomen. (A) Vulkandiagramm von miRNAs zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen; (B) hierarchische Cluster-Heatmap von DE-miRNAs zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen.

Abbildung 4. GO-Funktionsanreicherungsanalyse von DE-miRNAs-Zielgenen. (A) Biologischer Prozess der DE-miRNAs-Zielgene; (B) molekulare Funktionen von DE-miRNAs-Zielgenen; (C) Zellbestandteile von DE-miRNAs-Zielgenen

Abbildung 5. KEGG-Signalweganreicherungsanalyse von Zielgenen. (A) Deutlich angereicherter KEGG-Signalweg mit Zielgenen von DE-miRNAs; (B) Klassifizierung signifikant angereicherter KEGG-Pfade.

3.6. Targeting-Vorhersage der exosomalen miRNA im Serum und des PRRSV CHsx1401-Genoms

Gemäß dem PhastCons-Score einer einzelnen Base nach dem Alignment durch PHAST wurden insgesamt acht am stärksten konservierte Segmente (schwarze Bänder über der Peak-Karte) unter den Virusgenomen erhalten (Abbildung 6). Durch die Vorhersage der an das konservierte Segment gebundenen miRNAs wurde festgestellt, dass insgesamt 31 DE-miRNAs an das konservierte Segment binden. Darunter werden in der konservierten Region (14.644–15.020 nt), die den 30 UTR (14.870–15.020) des CHsx1401-Genoms am nächsten liegt, voraussichtlich 16 DE-miRNAs daran binden, darunter 5 miRNAs (ssc-miR-34 c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 und ssc-miR-6529), die an die 30 UTR von CHsx1401 binden können. Von diesen miRNAs wurde nach der Infektion nur ssc-miR-223 hochreguliert, während andere miRNAs nach der Infektion herunterreguliert wurden. Einzelheiten finden Sie in der Ergänzungstabelle S4.

Abbildung 6. Konservierte Segmente im Genom des Stammes CHsx1401, vorhergesagt von PHAST

3.7. Screening von DE-miRNAs im Zusammenhang mit der Exosomenfunktion und PRRSV

Durch funktionelle Anreicherungsanalyse von Zielgenen wurde eine Vielzahl unterschiedlich exprimierter miRNAs gefunden, die mit der Funktion von Exosomen und PRRSV zusammenhängen. Darunter sind 11 DE-miRNAs wie ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 und ssc-miR-320 an der Exosomenaufnahme beteiligt, und ihre Zielgene konzentrieren sich hauptsächlich auf die Ras-Genfamilie, die Annexin-Familie und die ADP-Ribosylierungs-Genfamilie. Achtzehn DE-miRNAs, darunter sscmiR-10b, ssc-miR-124a und ssc-miR-128, sind an immunbezogenen Signalwegen beteiligt, und ihre Zielgene sind hauptsächlich im MAPK konzentriert Genfamilie, PIK3-Genfamilie und Proteinphosphatase-Genfamilie. Während 11 DE-miRNAs an der Virusinvasion beteiligt sind, sind die zugehörigen Zielgene hauptsächlich in der MAPK-Genfamilie und der Proteinphosphatase-Genfamilie konzentriert. Darüber hinaus mehrere unterschiedlich exprimierte miRNAs, wie z. B. neuartige _102. Sechs DE-miRNAs, darunter ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-7137-3p und ssc-miR{{ 25}} werden in der Exosomenfunktion, der PRRSV-Virusinvasion und immunbezogenen Signalwegen co-exprimiert, wie in Abbildung 7 dargestellt. Einzelheiten sind in der Ergänzungstabelle S5 aufgeführt.

Abbildung 7. DE-miRNAs im Zusammenhang mit der Aufnahme von Exosomen, der PRRSV-Invasion und der Immunität

3.8. QRT-PCR-Assay von DE-miRNAs zwischen den beiden Gruppen

Fünf DE-miRNAs wurden zufällig zur Verifizierung ausgewählt. Den qRT-PCR-Ergebnissen zufolge nahm die Expression von ssc-miR-19a und ssc-miR-32 in der Behandlungsgruppe zu, während ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}} und ssc-miR-34c zeigten in der Kontrollgruppe eine höhere Expression, was mit den Sequenzierungsdaten übereinstimmt (Abbildung 8).

Abbildung 8. Fünf DE-miRNAs, validiert durch qRT-PCR

4. Diskussion

PRRSV ist immer noch ein hartnäckiger Krankheitserreger in der globalen Schweineindustrie, der weltweit enorme wirtschaftliche Verluste verursacht. Gegenwärtig werden Impfungen hauptsächlich zur Vorbeugung und Bekämpfung von PRRSV eingesetzt, wobei der modifizierte Lebendvirusimpfstoff (MLV) am häufigsten eingesetzt wird [48]. Obwohl dieser Impfstoff PRRS-Ausbrüche und -Inzidenz wirksam reduzierte, erhöhte er auch die genetische Variation und Diversität des Virus erheblich und führte zu einer viralen Rekombination zwischen Wild- und Lebendimpfviren im Feld [49,50]. In den letzten Jahren hat die Ausbreitung und Prävalenz des rekombinanten Virus NADC30-ähnlichen PRRSV-Stamms in China zu mehreren Ausbrüchen des reproduktiven und respiratorischen Syndroms bei Schweinen geführt. Die Ähnlichkeit zwischen CHsx1401 und NADC30, die in dieser Studie verwendet wurden, blieb bei 92,2–99,1 %. Seitdem hat es sich in China zu einem epidemischen Stamm entwickelt. Exosomen kommen als Vermittler der Zellkommunikation häufig in verschiedenen Körperflüssigkeiten vor und bieten einzigartige Vorteile bei der Diagnose und Behandlung von Krankheiten [51,52]. Früheren Berichten zufolge spielen Exosomen eine wichtige Kommunikationsrolle bei der Antigenpräsentation [53], der Immunantwort [53,54], der Virusreplikation [54], Krebs [55], neurodegenerativen Erkrankungen [56], Angiogenese [57] und Tumorzellen Migration [58] und Invasion [59] und haben einen hohen Forschungswert.

In dieser Studie wurde Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie verwendet, um das miRNA-Expressionsprofil von Serum-Exosomen zu erstellen, und 33 DE-miRNAs wurden identifiziert. Wie wir alle wissen, kann die vom Wirt kodierte miRNA an das virale Genom binden und dann die Replikation, Synthese und Freisetzung des Virus regulieren, um Infektionen zu begrenzen und den pathologischen Prozess zu beeinflussen [15]. Auch bei Tieren wurde wiederholt über Studien zu miRNAs berichtet, die auf das virale Genom abzielen. gga-miR-454 und gga-miR-130b bei der infektiösen Schleimbeutelerkrankung von Hühnern können auf das virale Genom abzielen, um die Virusreplikation zu hemmen, während gga-miR-21 direkt auf das virale Protein VP1 abzielt, um es zu hemmen virale Proteintranslation [60,61]. In PRRSV-Studien bindet ssc-miR-181 spezifisch an eine hochkonservierte Region stromabwärts des viralen Genoms ORF4 und hemmt die PRRSV-Replikation stark [62]. In dieser Studie erreichte der Expressionsunterschied von ssc-miR-181 zwischen den beiden Gruppen kein signifikantes Niveau. In unserer Studie wurden die Genome von neun verschiedenen PRRSV-Viren mit denen des Stammes CHsx1401 verglichen und die acht am stärksten konservierten Segmente identifiziert. Es wurde vorhergesagt, dass 31 DE-miRNAs an die 8 am stärksten konservierten Segmente von CHsx1401 binden könnten und 16 DE-miRNAs an die konservierten Sequenzen nahe der 30 UTR von CHsx1401 binden könnten. Darunter 5 DE-miRNAs (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 und ssc-miR{{ 36}}) können gleichzeitig an den CHsx1401 30 UTR binden. Darüber hinaus wurde vorhergesagt, dass die hochregulierte Expression von ssc-miR-223 an das 30-UTR-Ziel des PRRSV-Genoms bindet. Die Ergebnisse zeigten, dass die konservierten Sequenzen des Virusgenoms eine Schlüsselrolle bei seiner Pathogenität spielen könnten und dass die miRNAs, die an die konservierten Sequenzen zwischen den Genomen verschiedener PRRSV-Stämme binden können, eine wichtige Bedeutung bei der Kontrolle der Pathogenität des Virus haben könnten. Frühere Studien haben gezeigt, dass einige unterschiedlich exprimierte miRNAs mit PRRSV in Zusammenhang stehen und sogar direkt an der Regulierung von PRRSV beteiligt sind, darunter ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30]. , ssc-miR-124a [64], let-7f-5p [65], ssc-miR-744 [66] und ssc-miR{{57 }}a [67].

PRRSV kann der Abwehr des Wirts entgehen, indem es die angeborene Immunantwort stört. Dieser Prozess wird durch viele Signalwege reguliert, einschließlich des MAPK-Signalwegs, des PI3K-Akt-Signalwegs, der Autophagie, des Chemokins und des TNF-Signalwegs. Derzeit umfasst der MAPK-Signalweg drei Hauptwege: ERK1/2, JNK und p38-Weg. Die Aktivierung der MAPK-Kaskade kann die Apoptose der Wirtszelle fördern, das Virus dabei unterstützen, der Immunabwehrreaktion des Wirts zu entkommen, und die PRRSV-Replikation fördern [68]. Darüber hinaus kann die Aktivierung von c-Jun N-terminalen Kinasen (JNKs) und p38 auch die Freisetzung des Entzündungsfaktors IL-10 fördern [68–70] und die Entzündungswirkung verstärken. PRRSV kann nicht nur Apoptose induzieren, sondern auch Autophagie induzieren, was die PRRSV-Replikation fördern kann. Die Aktivierung von PI3K/Akt ist für den Viruseintritt und die Förderung der Virusreplikation notwendig, und PRRSV-aktiviertes Akt hemmt die Apoptose der Wirtszelle, indem es den JNK-Signalweg negativ reguliert [71]. TNF kann zusammen mit anderen Entzündungsfaktoren eine wichtige Rolle bei der Induktion und Regulierung der Entzündungsreaktion spielen, die TNF-Expression wird jedoch durch die negative Regulierung der PRRSV-Replikation beeinflusst [72]. In der vorliegenden Studie wurden miRNAs (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ {24}}a-5p usw.), die auf diesen Signalwegen angereichert sind, sind an der PRRSV-induzierten Apoptose, Autophagie und Entzündung beteiligt und stehen in engem Zusammenhang mit der viralen Immunantwort, der Immunumgehung und der Replikation.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

Die Zellplasmamembran ist reich an einer Vielzahl von Lipid-Rafts, und Sphingolipid- und cholesterinreiche Sphingolipide (Sphingomyelin und Glykosphingolipide) sind Schlüsselmoleküle von Lipid-Rafts. Die Erkennung von Lipiden durch einige Proteine ​​des Virus kann eine notwendige Voraussetzung für das Eindringen des Virus sein [73]. Hüllviren fügen im Stadium des Viruseintritts virale Hüllglykoproteine ​​in Lipidflöße ein, interagieren mit Rezeptoren in Lipidflößen oder wechseln von ihrem natürlichen Zustand in eine aktivierte Form, um die Internalisierung/Fusion von Viren zu initiieren oder zu fördern, wie z. B. HSV, SARS-Coronavirus usw Ferkelepidemie-Durchfallvirus [73,74]. Frühere Studien ergaben, dass die Entfernung von Cholesterin von der Oberfläche von MARC-145-Zellen die PRRSV-Infektion deutlich reduzierte, was zeigt, dass die Hemmung der PRRSV-Infektion spezifisch durch die Entfernung von zellulärem Cholesterin vermittelt wurde. Der Abbau von Cholesterin in der Zellmembran hemmte den Viruseintritt, insbesondere die Virusanheftung, und -freisetzung erheblich [75]. Der Sphingolipid-Metabolismus kann die Membranstruktur und -adhäsion regulieren, was bei der PRRSV-Virusinvasion von großer Bedeutung ist. Die Endozytose war die bedeutendste Bereicherung in dieser Studie. Endozytose ist ein wichtiger Mechanismus der Exosomenaufnahme durch Zielzellen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Aufnahme von Exosomen ein energieintensiver und vom Zytoskelett abhängiger Prozess ist, was die mögliche Rolle der Endozytose in diesem Prozess unterstreicht [76]. Es wurde nachgewiesen, dass mehrere Wege diesen Prozess vermitteln können, darunter Phagozytose, Makropinozytose, Clathrin usw. [77,78], was zu unterschiedlichen Klassifizierungen und Rollen endozytierter Substanzen führte. Die Anreicherung unterschiedlich exprimierter exosomaler miRNAs auf diesem Weg weist darauf hin, dass Exosomen eine wichtige Rolle bei der PRRSV-Infektion spielen und dass die Regulierung des Transports und der Aufnahme von Inhalten in Exosomen zu pathophysiologischen Veränderungen in Zielzellen und -organen führen kann.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

5. Schlussfolgerungen

Durch die Identifizierung und bioinformatische Analyse exosomaler miRNAs im Serum von PRRSV-infizierten Schweinen wurden in dieser Studie eine Vielzahl von PRRSV-bezogenen Signalwegen und unterschiedlich exprimierten miRNAs erhalten, wie z. B. ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 usw., die potenzielle funktionelle Rollen bei PRRSV spielen -induzierte Immunantwort, Invasion und Exosomenaufnahme. Da eine einzelne miRNA außerdem auf mehrere Gene abzielen kann und ein einzelnes Gen auch durch mehrere miRNAs reguliert wird, erfüllen mehrere miRNAs in den oben genannten Signalwegen mehrere Funktionen. Es wurde nachgewiesen, dass einige miRNAs die PRRSV-Infektion regulieren, indem sie auf Schlüsselrezeptoren wirken oder direkt auf das Virusgenom abzielen, wie z. B. ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, let-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a usw. In der Zwischenzeit hat die vorliegende Studie auch eine Vielzahl von miRNAs vorhergesagt, die an binden können das am besten konservierte Fragment der 30 UTR des CHX1401-Virusgenoms, einschließlich ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} } und ssc-miR-6529, die für die Regulierung der viralen Pathogenität wichtig sein können.

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