Hochauflösende Terahertz-Spektroskopie von thermischen Zersetzungsgasprodukten von Blutplasma und Nierengewebepellets von Diabetikern und Nichtdiabetikern

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Abstrakt

Bedeutung:Einer der modernen Trends in der medizinischen Diagnostik basiert auf Metabolomics, einem Ansatz, der die Bestimmung von Metaboliten ermöglicht, die die spezifischen Merkmale der Krankheit sein können. Hochauflösende Gasspektroskopie ermöglicht die Untersuchung des Gehalts an Gasmetaboliten in Proben biologischen Ursprungs. Wir präsentieren die Ausarbeitung einer Methode zur Untersuchung diabetischer und nicht-diabetischer biologischer Proben, die als Pellets präpariert wurden, durch Terahertz (THz) hochauflösende Spektroskopie.

Ziel:Die Hauptidee der Arbeit ist die Untersuchung des Gehalts an thermischen Zersetzungsgasprodukten von getrockneten Diabetikern und NichtdiabetikernBlutplasmaundNierengewebefür die Aufdeckung des Satzes von Gasmarkern, die Diabetes durch die hochauflösende THz-Spektroskopiemethode charakterisierten.

Sich nähern:Wir präsentieren einen Ansatz zur Untersuchung von Diabetikern und Nicht-DiabetikernBlutplasma(Mensch und Ratten) undNierengewebe(Ratten), mittels hochauflösender Spektroskopie basierend auf dem instationären Effekt des THz-Frequenzbereichs. Die Verfahren zur Aufbereitung der Blut- und Nierengewebeproben als Pellets und zur Verdampfung der Proben wurden entwickelt.

Ergebnisse:Die Messungen der Rotationsabsorptionsspektren von Dämpfen beim Erhitzen der aus Blut hergestellten Pellets undNierengewebewurden im Frequenzbereich 118 bis 178 GHz durchgeführt. Die in den Spektren der Probendämpfe auftretenden Absorptionslinien wurden detektiert und identifiziert. Die Molekulargehalte der thermischen Zersetzungsprodukte unterschieden sich bei Proben von Nicht-Diabetikern und Diabetikern; zB ist der Hauptmarker Aceton, das im diabetischen Blut (Mensch und Ratte) und bei Diabetikern vorkommtNierengewebe.

Schlussfolgerungen: Unsere Arbeit veranschaulicht die potenzielle Fähigkeit zur Bestimmung des Metabolitengehalts biologischer Proben für die Diagnostik und die Prognose von Krankheiten für die klinische Medizin. © Die Autoren. Veröffentlicht von SPIE unter einer Creative Commons Attribution 4.0 Unported License. Die Verbreitung oder Vervielfältigung dieses Werkes im Ganzen oder in Teilen erfordert die vollständige Nennung der Originalveröffentlichung, einschließlich ihres DOI. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Schlagwörter: Hochauflösende Terahertz-Spektroskopie; thermische Zersetzung; Gewebe;Blutplasma; Diabetes; Gefriertrocknung.

Schlüsselwörter:hochauflösende Terahertz-Spektroskopie; thermische Zersetzung; Blutplasma; Diabetes; Gefriertrocknung, Nierengewebe.

Cistanche-Erfahrung

1. Einleitung

Heutzutage zieht das Problem der Diagnostik gesellschaftlich wichtiger Krankheiten (Diabetes, Krebserkrankungen usw.), einschließlich der frühen Stadien, die große Aufmerksamkeit wissenschaftlicher Gruppen auf der ganzen Welt auf sich.Einer der neuen Ansätze, die neue Möglichkeiten in der Diagnostik und Behandlung verschiedener Krankheiten eröffnen, ist die Metabolomik. Metabolomik ist ein Wissenschaftsgebiet, das die End- und Zwischenprodukte des Stoffwechsels eines biologischen Systems (Zelle, Organe oder ganzer Organismus) untersucht. Die Metabolomik kann die Metaboliten offenbaren, die die spezifischen Merkmale der Krankheit sein können und eine große Rolle bei der Diagnose und Prognose einer Krankheit spielen können. Die Medien, die die End- und Zwischenprodukte des Stoffwechsels im menschlichen Organismus enthalten und nützlich sind, um die mit Krankheiten und Pathologien verbundenen Metaboliten aufzudecken, sind Atemluft, Blut, Urin, Speichel usw.

Eine der gesellschaftlich wichtigen Krankheiten, die die Lebensqualität der Menschen bedrohen, ist Diabetes. Diabetes mellitus Typ 2 war früher eine Erkrankung des mittleren Lebensalters, heute wird er bei Erwachsenen, Jugendlichen und Kindern diagnostiziert. Die Ergebnisse metabolomischer Untersuchungen von Blut- und Urinproben von Diabetespatienten ab 18 Jahren sowie Kindern von 1 bis 13 Jahren werden in der Human Metabolome Database (HMDB) dargestellt.1 Hauptsächlich Blut (21 chemische Substanzen inkl. Isomere), Urin ( 30 chemische Substanzen inkl. Isomere) und Liquor cerebrospinalis (1 chemische Substanz) untersucht. Beispielsweise wurde (R)-3-Hydroxybuttersäure in allen drei Arten von Flüssigkeiten nachgewiesen. Einige Substanzen (Acessigsäure, D-Fructose und D-Glucose) wurden in beiden Flüssigkeiten (Blut und Urin) nachgewiesen. Das charakteristischere Merkmal von Diabetes (Aceton, CH3COCH3) war nur für Urin vorhanden. Die flüssigen Proben, die Ergebnisse der in HMDB vorgestellten Untersuchungen, wurden mit verschiedenen Methoden untersucht – Gaschromatographie;2 Gaschromatographie mit Massenspektrometrie;3,4 Gas-Flüssigkeits-Chromatographie mit Massenspektrometrie;5 hochauflösende Kernspektroskopie Protonen-Magnetresonanz;6 und Methoden, die spezielle Geräte für die Zustandsüberwachung von Diabetespatienten verwenden, das kontinuierliche Glukoseüberwachungssystem.7

Die Entwicklung einer chronischen Nierenerkrankung ist eine Hauptkomplikation von Diabetes mellitus. Obwohl die Bestimmung von glykiertem Albumin der übliche Ansatz für das Screening ist, kann eine Nierenschädigung beginnen, lange bevor klinisch signifikante Veränderungen im Urinalbumin auftreten. In Anbetracht der multifaktoriellen Pathogenese der chronischen Nierenerkrankung wurden verschiedene Marker für ihr Screening in Betracht gezogen.8,9 Ihr diagnostischer Wert ohne Nierenbiopsie erschien jedoch zweifelhaft.

Der spektroskopische Ansatz kann Informationen über den Inhalt der biologischen Proben liefern, die für die medizinische Diagnostik verwendet werden können. Der Terahertz (THz)-Frequenzbereich ist sehr wichtig für die Untersuchung von Gasen, Flüssigkeiten und Geweben lebender Organismen. Es gibt einige Übersichtsartikel, die Anwendungen von Methoden im THz-Frequenzbereich gewidmet sind, einschließlich THz-Zeitbereichsspektroskopie, THz-Reflektometrie und THz-Bildgebung für Biologie und Medizin.10

Die THz-Zeitbereichsspektroskopie ermöglicht die Erfassung von Spektren, bei denen der Absorptionskoeffizient oder Brechungsindex einige spektrale Merkmale aufweist, die dem Vorhandensein einiger Biomoleküle (Proteine, Zucker usw.) in den Proben oder ihren verschiedenen Konzentrationen entsprechen.11

Die molekulare Absorptionsspektroskopie und insbesondere die THz-Gasspektroskopie ist ein vielversprechender Ansatz zur Untersuchung von Mehrkomponenten-Gasgemischen unterschiedlicher Herkunft.12 Die Proben in flüssigem und festem Zustand können durch Verdampfen oder thermische Zersetzung untersucht werden. Die Metaboliten-Marker von gesellschaftlich wichtigen Krankheiten (Diabetes, Krebs usw.) können durch ihre Spektrallinien in den Absorptionsspektren, die bei der Übertragung von Strahlung durch Gasproben durchgeführt werden, aufgedeckt werden.

Der Acetonspiegel in Atemluft- und Urinproben der Diabetespatienten (12 Personen) wurde mit einem Spektrometer im Terahertzbereich mit Phasenumtastung der einwirkenden Strahlung gemessen. Die Experimente wurden in Zusammenarbeit mit dem Almazov National Medical Research Centre durchgeführt. Die Messungen wurden an den Aceton-Absorptionslinien mit Mittenfrequenzen von 150,537 und 151,647 GHz durchgeführt. Die Messungen wurden ohne Erwärmung durchgeführt. Die gleichzeitige Analyse der Proben der ausgeatmeten Atemluft und des Urins von Diabetespatienten ergab, dass der Acetongehalt im Urin viel höher war als in der ausgeatmeten Luft, in einigen Fällen eine Größenordnung höher.13,14

Die Ergebnisse von hochauflösenden THz-Gasspektroskopie-Untersuchungen vonBlutplasmavon Patienten und Ratten (bedingt gesund und mit Diabetes) sowie der RatteNierengewebe(gesund und mit Diabetes) getrocknet und zu Pellets gepresst vorgelegt. Die Gewebe bzwBlutplasmavon lebenden Organismen sind ohne jegliche Präparation unmittelbar nach der Probenahme zu untersuchen. Die Zubereitung als Pellets ermöglicht eine Untersuchung nach ausreichend langer Zeit nach Blutentnahme oder Nierenbiopsie.

2 Experimente und Methodik

2.1 Verfahren zur Herstellung von Blutplasmapellets und Nierenpellets

Venöses Blut von Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und bedingt gesunden Teilnehmern wurde in der Abteilung für Endokrinologie des Nationalen Medizinischen Forschungszentrums Almazov gesammelt; Das Zentrum bietet medizinische Versorgung für Diabetiker. Drei Patienten und zwei Teilnehmer waren männlich und gleichaltrig (39 bis 43 Jahre alt). Alle in dieser Untersuchung verwendeten experimentellen Protokolle wurden von den Patienten und Teilnehmern und der Verwendungskommission des medizinischen Zentrums überprüft und genehmigt. Venöses Blut wurde morgens nach 8 bis 12 Stunden Fasten in einem Röhrchen mit dem Antikoagulans K3EDTA (Vacutest Kima, Italien) gesammelt. Plasma wurde für die Analyse von biochemischen Parametern durch Zentrifugation von Vollblut bei 3000 U/min für 15 min in einer Laborzentrifuge (Eppendorf 5702R, Deutschland) bei einer Temperatur von 4°C erhalten. Werte der biochemischen Parameter vonBlutplasmaProben und Referenzintervalle sind in Tabelle 1 dargestellt (der Gehalt an glykiertem Hämoglobin wurde aus dem Vollblut erhalten). Tabelle 1 zeigt, dass die Konzentration von Glucose, Triglyceriden und glykiertem Hämoglobin in den Proben eines Patienten mit Diabetes um das 1,5-, 2- bzw. 2,3-fache ansteigt.

Die Studie wurde auch mit männlichen Wistar-Ratten im Alter von 8 Wochen und einem Gewicht von 180 bis 200 g gemäß dem Protokoll für experimentelle Studien durchgeführt, das von der Animal Care and Use Commission des Institute of Experimental Medicine Almazov National Medical Research Centre genehmigt wurde. Der Glukosespiegel bei Tieren der Versuchsgruppe betrug 21 mmol ∕ l nach 120 min nach Glukosebelastung. Als Kontrollgruppe wurden intakte Ratten verwendet. Venöses Blut wurde aus der unteren Hohlvene gesammelt, bevor die Tiere eingeschläfert wurden. Auch die Niere wurde geerntet. Blutproben wurden in Röhrchen gesammelt, die ein Antikoagulans enthielten.

Testproben wurden bei einer Temperatur von –80 Grad eingefroren (Tiefkühlschrank DW-86L388A, Haier, China). Anschließend wurde es durch Gefriertrocknung Vaco 2 (ZirBus, Deutschland) bei einer Temperatur von –50 Grad und einem Druck von 3 Pa lyophilisiert. Vor der Gefriertrocknung wird ein Einfrieren durchgeführt, da während der Gefriertrocknung unter dem Einfluss von hohem Innendruck biologische Bestandteile entstehen können sei zerstört. Getrocknete Proben waren ein Schwamm, der aus biologischen Kristallen bestand. Der Schwamm wurde mit einem Metallspatel zerstört und zu Kristallen mit einer Größe von mehreren zehn Mikrometern zerkleinert. Die Verwendung von Mörser und Pistill war unmöglich, da das Mahlen der Proteine ​​in der Zusammensetzung der Proben zu deren unerwünschtem Anhaften und der Bildung runder Körner führen würde.

Das lyophilisierte Probenpulver wurde gewogen (Analysenwaage OHAUS Discovery, Schweiz) und dann in eine Stahlpressform gegeben. Unter Verwendung von Laborpressen (Angkor, Russland und Specac, UK) bei einem bestimmten Pressdruck, derBlutplasmaPellets und Nierenpellets wurden erhalten. Jeder Pelletkristall enthält einen bestimmten Prozentsatz an Fetten (Triglyceriden), Proteinen (Albumin) und Fibrinogen – alle normal oder glykiert (im Fall von Diabetikern). Die Pellets von Proben aus der Kontrollgruppe werden nachstehend als "Nicht-Diabetiker-Pellet" und die Pellets von Proben aus der Kontrollgruppe bezeichnetDiabetiker-Gruppe werden nachstehend als "Diabetiker-Pellet" bezeichnet.

2,2-THz-Hochauflösende Spektroskopie Experimenteller Aufbau

Hochauflösende THz-Spektroskopie basierend auf instationären Effekten ermöglicht die Analyse der Komponentenzusammensetzung von Gas- und Dampf-Mehrkomponenten-Gasgemischen. Spektrometer bieten eine Empfindlichkeit nahe der theoretischen Grenze mit einer nur durch den Doppler-Effekt begrenzten Auflösung und können schnelle Vorgänge aufzeichnen. Die Empfindlichkeit bleibt auch bei einer erheblichen Abnahme des Gasdrucks erhalten und beträgt im Scanmodus für einige Gase (z. B. Ammoniak bei den Messungen der Absorptionslinie nahe der Frequenz von 572 GHz) etwa 0,2 ppb. Darüber hinaus ermöglicht es die Bestimmung der Komponentenzusammensetzung eines Gasgemisches mit hoher Zuverlässigkeit.12 Eine Untersuchung der thermischen Zersetzungsprodukte von Pellets wurde mit der Methode der instationären THz-Gasspektroskopie im Bereich von 118 bis 178 GHz durchgeführt. Das Spektrometer verwendet einen Phasenregelkreis zur automatischen Steuerung der Frequenz der Rückwärtswellenlampe und Phasenverschiebung, Registrierung im Zeitbereich, Mittelwertbildung und Verarbeitung des spektroskopischen Übergangssignals. Das Gerät registriert ein Signal im Zeitbereich. Der Dampf der Proben wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens analysiert. Pellets wurden in ein Reagenzglas gegeben, unter Verwendung von Vakuum gepumpt, ein Reagenzglas allmählich erhitzt (bis zu 240 Grad) und die resultierende Mischung von thermischen Zersetzungsprodukten der Probe wurde in die Messzelle gelassen. Eine Datendatei enthält üblicherweise Aufzeichnungen eines ausgewählten oder des gesamten Betriebsbereichs des Spektrometers. So können Substanzen durch im Gesamtspektrum der Probe erscheinende Absorptionslinien identifiziert und die Dynamik von Konzentrationen in einem Gemisch durch Vergleich mehrerer Datensätze verfolgt werden. Substanzen wurden identifiziert, indem sie in Open-Source-MW-, mmw- und THz-Datenbanken gesucht wurden.15,16

3 Analyse von Blutplasma- und Nierendämpfen mit einem hochauflösenden Terahertz-Spektrometer

Mit unseren THz-TDS-Systemen haben wir die Transmission von Pellets im Spektralbereich von 0,2 bis 1,4 THz gemessen,17 aber wir wissen, dass Biomoleküle und insbesondere ihre Zersetzungsprodukte im Gaszustand eine informative Antwort haben (Rotationsabsorption). Spektren) bei diesen Frequenzen und auch niedriger, daher führten wir eine zusätzliche Studie mit einem hochauflösenden THz-Gasspektrometer durch. Die nachgewiesenen Absorptionslinien von Substanzen bei DiabetikernBlutplasmastimmen mit Substanzen von Menschen ohne Diabetes übereinBlutplasma, außer Aceton. Im Arbeitsfrequenzbereich des Spektrometers (118 bis 178 GHz) liegen viele Absorptionslinien von Aceton. Normalerweise ist es mehr als ausreichend, eine Absorptionslinie einer Substanz zu erkennen, um das Vorhandensein der Substanz in dem Mehrkomponenten-Gasgemisch eindeutig zu bestimmen. Ein Beispiel für die Aufnahme von Teilen des Absorptionsspektrums mit der Absorptionslinie von Aceton ist in Abb. 1 dargestellt. Aceton kann bei einer Störung des Kohlenhydratstoffwechsels im Blut auftreten. Wie in der Literatur erwähnt, enthielt das Blut von Patienten mit Diabetes -OH-Butyrat und Acetoacetat, aber später zerfielen diese Substanzen in Aceton und Kohlendioxid.18 Kohlendioxid hat kein Dipolmoment; daher hat es keine Rotationsübergänge. Sein erhöhter Gehalt kann nur durch Untersuchung des Schwingungsspektrums der Probe im IR-Bereich nachgewiesen werden.

Plasmadampfsubstanzen wie Carbonylsulfid (OCS), Schwefeldioxid (SO2), Ameisensäure (HCOOH), Isocyansäure (HNCO) und Ammoniak (NH3) wurden sowohl in menschlichen als auch in nicht-diabetischen Proben nachgewiesen. In einigen Fällen wird in den Spektren der Probe eine experimentelle Linie entdeckt, die mehr als einer Linie für eine Substanz (z. B. Isocyansäure) in den Katalogdaten entspricht (siehe Tabelle 2).15,16

Dies erklärt sich dadurch, dass die Kataloge Daten über Hyperfeinstrukturen von Substanzen enthalten, die in diesem Experiment nicht aufgelöst werden, da die Linien eine endliche Breite in der Größenordnung von mehreren hundert kHz haben. Die erhaltenen Absorptionslinien der untersuchten Substanzen stimmen mit den Absorptionsspektren von Kapillarblutdämpfen übereinBlutplasmavon Patienten mit Diabetes und bedingt gesunden Teilnehmern, die in unserer früheren Arbeit veröffentlicht wurden.19 Die nachgewiesenen gasförmigen Substanzen könnten während der Probenvorbereitung als Produkte der chemischen Umwandlung von Aminosäuren entstanden sein. Die Frage, ob diese Verbindungen von diagnostischem Wert sind, muss untersucht werden. In der klinischen Praxis in der Diabetologie wird die Analyse des Gehalts dieser Substanzen noch nicht verwendet.

Die Dämpfe derBlutplasmavon gesunden Ratten enthielten Carbonylsulfid (OCS), Methanthiol (CH3SH), Butyronitril (C3H7CN), Acetaldehyd (CH3CHO) und Ameisensäure (HCOOH). Die Probe vonBlutplasmavon diabetischen Ratten wurde durch die Anwesenheit von Aceton unterschieden. Neben den Absorptionslinien von Propionitril (C2H5CN) wurde Methylformiat (CH3OCHO) nachgewiesen.

Die Dampfproben getrockneter Pellets gesunder und diabetischer RattenNierengewebewaren gelernt. Die Dämpfe vonNierengewebeder gesunden Ratten enthalten Carbonylsulfid (OCS), Schwefeldioxid (SO2), Ameisensäure (HCOOH), Isocyansäure (HNCO), Ethylformiat (C2H5OCHO) und Propylenglykol (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). Der Dampfgehalt diabetischer RattenNierengewebeunterschied sich von der gesunden Ratte nicht nur durch das Vorhandensein von Carbonylsulfid (OCS), sondern auch seines Isotopologen OCS-34. Acetaldehyd (CH3CHO), Methanthiol (CH3SH), Ethylensulfid (C2H4S), Methanol (CH3OH) und Glykolaldehyd (CH2ðOHÞCHO) wurden auch in den Dämpfen eines Pellets einer diabetischen Ratte nachgewiesenNierengewebe(siehe Abb. 2 und Abb. 3).

Das Vorhandensein von Schwefelverbindungen wie Methanthiol kann durch die thermische Zersetzung von Schwefelaminosäuren (Methionin, Cystein und Cystin) in der Blutproteinzusammensetzung angegeben werden. Methionin ist eine essentielle Aminosäure, die im menschlichen Organismus nicht synthetisiert wird. Es wird aus der Nahrung gewonnen und ist eine Schwefelquelle für die Cystein-Biosynthese. Beim Erhitzen von schwefelhaltigen Aminosäuren auf Temperaturen um 240 Grad wurden im Massenspektrum dieser Substanzen Methanthiol und Ethylensulfid (Methioninzersetzung) nachgewiesen.20

4. Fazit

Der molekulare Inhalt von Mensch und RatteBlutplasmaund RatteNierengewebewährend der thermischen Zersetzung der Proben wurde mit dem hochauflösenden THz-Spektrometer untersucht. Das Verfahren zur Herstellung der biologischen Proben als Pellets wurde vorgestellt. Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit, Proben zu lagern und zu transportieren. Die hochauflösende Gasspektroskopie ermöglicht die Bestimmung des Gehalts von Mehrkomponenten-Gasgemischen jeglicher Herkunft, einschließlich biologischer mit Spurenkonzentrationen von Gaskomponenten. Bei Diabetikern wurde Aceton nachgewiesenBlutplasmaProben. Informationen über den inhaltlichen Unterschied von Diabetikern und GesundenBlutplasmavon Menschen und Ratten und diabetischen und gesunden RattenNierengewebewurde aus Absorptionsrotationsspektren von Dämpfen erhalten. Die Verwendung von hochauflösender THz-Spektroskopie ermöglicht eine qualitative Analyse des Komponentengehalts von Proben von Blutdämpfen undNierengewebePellets. Die Möglichkeit, die quantitative Bestimmung der Konzentrationen wichtiger Diabetes-Gasmarker in Abhängigkeit vom Zustand der Patienten durchzuführensollte in weiteren Untersuchungen untersucht werden.