Das konservierte Cystein-reiche sekretorische Protein MaCFEM85 interagiert mit MsWAK16, um die pflanzliche Abwehr zu aktivieren

Abstrakt: Metarhizium anisopliaeist ein entomopathogener Pilz, der als Endophyt in Wirtspflanzen das Pflanzenwachstum und die Widerstandskraft steigern kann. Über die Proteininteraktionen und deren Aktivierungsmechanismen ist jedoch wenig bekannt. Proteine, die häufig in der extrazellulären Membran von Pilzen (CFEM) vorkommen, wurden als pflanzliche Immunregulatoren identifiziert, die pflanzliche Resistenzreaktionen unterdrücken oder aktivieren. Hier identifizierten wir ein CFEM-Domänen enthaltendes Protein, MaCFEM85, das hauptsächlich in der Plasmamembran lokalisiert war. Hefe-Two-Hybrid (Y2H), Glutathion-S-Transferase (GST)-Pulldown und bimolekulare Fluoreszenzkomplementationstests zeigten, dass MaCFEM85 mit der extrazellulären Domäne von a interagierteMedicago sativa(Luzerne-)Membranprotein, MsWAK16. Genexpressionsanalysen zeigten, dass MaCFEM85 und MsWAK16 deutlich hochreguliert warenM. anisopliaeUndM. sativajeweils 12 bis 60 Stunden nach der Co-Inokulation. Zusätzliche Hefe-Zwei-Hybrid-Assays und ortsspezifische Aminosäuremutationen zeigten, dass speziell die CFEM-Domäne und das 52. Cystein für die Interaktion von MaCFEM85 mit MsWAK16 erforderlich waren. Tests zur Verteidigungsfunktion zeigten, dass JA hochreguliert war, die Größe der Botrytis cinerea-Läsionen und die Reproduktion von Myzus persicae jedoch durch die vorübergehende Expression von MaCFEM85 und MsWAK16 in der Modellwirtspflanze Nicotiana benthamiana unterdrückt wurden. Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse neue Einblicke in die molekularen Mechanismen, die den Interaktionen von M. anisopliae mit Wirtspflanzen zugrunde liegen.

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Schlüsselwörter: wandassoziierte Kinase; CFEMs; Metahizium anisopliae; Pflanzenimmunität; Medicago sativa

1. Einleitung

Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben sind weit verbreitet und das Ergebnis vergangener und laufender Koevolution. Diese Interaktionen können für jeden Teilnehmer entweder positive, neutrale oder negative Folgen haben [1–3]. Nützliche rhizosphärische Mikrobiota können das Pflanzenwachstum fördern und die allgemeine Gesundheit verbessern, indem sie vor bodenbürtigen Krankheiten schützen oder die Nährstoffaufnahme verbessern [4,5]. Eine breite Palette nützlicher Mikroben kann Pflanzenfähigkeiten wie Nährstoffaufnahme, Wachstum sowie Krankheitserreger- und Insektenabwehr verbessern [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın ist eine wichtige Gattung entomopathogener Pilze mit der Fähigkeit, Pflanzen zu besiedeln [8], aber es gibt auch Hinweise darauf, dass Mitglieder der Gattung die Resistenz gegen Pflanzenpathogene erhöhen können. Eine Laborstudie ergab beispielsweise eine 60-prozentige Hemmung von Fusarium solani (Mart.) Sacc. in Gegenwart von Metarhizium robertsii (früher bekannt als M. anisopliae) im Vergleich zu Kontrollen ohne M. robertsii [9]. Einige Metarhizium-Stämme haben das Potenzial, die Pflanzenresistenz gegen Insektenschädlinge und -krankheiten zu verbessern, indem sie die Expression pflanzlicher Abwehrgene verändern. Die endophytische Besiedlung mit M. Roberts aktiviert die Expression der Abwehrwege Jasmonsäure (JA) und Salicylsäure (SA) in Maisblättern. Darüber hinaus ist eine solche Besiedlung mit der Förderung des Pflanzenwachstums und der Unterdrückung der Larvenentwicklung von Agrotis epsilon (Hufnagel) verbunden [10]. Metarhizium guizhouense aktivierte die -1,3-Glucanase und Chitinase in der Fruchtschale von Lansium parasiticum, was zu einer Wachstumshemmung von Botrytis sp. führte. und Fusarium sp. über die Frucht von Aglaia dookkoo Griff [11]. Darüber hinaus wurden bei der Anwendung von M. anisopliae auf Erdnusskeimlinge verschiedene Transkriptionsfaktoren, darunter WRKYs, MYCs, TGAs und auf Ethylen reagierende Transkriptionsfaktoren, aktiviert, während Nitrattransporter und Proteine, die auf Dehydrierung reagierende Elemente binden, ebenfalls unterschiedlich exprimiert wurden [12]. . Dies deutet darauf hin, dass M. anisopliae bei der Besiedlung der Pflanze die Abwehrgene der Pflanze reguliert. Allerdings ist relativ wenig über die Mechanismen bekannt, die den Abwehrreaktionen von Pflanzen nach einer Infektion durch Metarhizium zugrunde liegen. Effektoren sind ein gängiges Mittel, mit dem Mikroorganismen die Pflanzenresistenz regulieren [13]. Die Aktivierung der Pflanzenresistenz ist normalerweise durch einen oxidativen Ausbruch und die Induktion von Hormonen, Metaboliten und anderen Signalen gekennzeichnet [13]. Die Pflanzenhormone SA und JA spielen eine wichtige Rolle bei der Induktion von Pflanzenresistenz, indem sie zwei separate Abwehrsignalwege vermitteln [14]. Der SA-Signalweg ist hauptsächlich an der allergischen Reaktion der Pflanzen und an der systemisch erworbenen Resistenz gegen Krankheitserreger beteiligt, kann aber auch an indirekten Abwehrreaktionen der Pflanzen beteiligt sein, die durch die Fütterung stechender Insekten hervorgerufen werden [15]. Die Akkumulation von SA ist mit einer erhöhten Expression von Genen verbunden, die für Lipidtransferproteine ​​(LTPs) und Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL) kodieren [16], die die Synthese und Akkumulation von nachgeschalteten spezialisierten Metaboliten wie Flavonoiden und Lignin vermitteln [17]. Der JA-Signalweg fungiert bei direkten und indirekten Reaktionen auf mechanische Schäden, Pilzpathogene und Insektenschädlinge. Studien haben gezeigt, dass die JA-Signalisierung eine regulierende Wirkung auf die Synthese spezialisierter Metaboliten wie Terpenoide, Phenylpropanoide und Alkaloide hat, die ein breites Spektrum biologischer Funktionen haben [18]. Es wurde gezeigt, dass sich einige spezialisierte Metaboliten nach der Behandlung mit MethylJA (MeJA) in Pflanzenzellen ansammeln, darunter Paclitaxel in Taxus-Arten [19,20], Terpenoide in Centella Asiatica (L.) Urban [21] und Saponine in Ginseng [22]. . Die Anwendung von SA und Chitosan (CHT) als Auslöser induzierte eine Ligninanreicherung und Abwehrenzymreaktionen in Tomaten, was die Häufigkeit einer Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi-Infektion verringerte [23]. Darüber hinaus wurden die JA- und SA-Werte in Weizen durch die Anwendung des Auslösers PeaT signifikant erhöht, was die Abwehrreaktion auf die Haferblattlaus Sitobion avenae (Fabricius) verstärkte [24]. Dies weist darauf hin, dass die pflanzliche Immunität durch diese Effektoren durch Pflanzenhormone und Metaboliten reguliert werden könnte.

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Proteine, die in der extrazellulären Membran von Pilzen vorkommen (CFEM), kommen in einer Vielzahl von Pilzen vor. Sie kodieren für Domänen, die normalerweise 60 Aminosäuren (aa) lang sind und acht charakteristisch beabstandete Cysteine ​​enthalten [25]. CFEM-Domänen ähneln den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-ähnlichen Domänen, die als extrazelluläre Rezeptoren, Signalwandler oder Adhäsionsmoleküle bei Wirt-Pathogen-Interaktionen fungieren [26]. Proteine, die CFEM-Domänen enthalten, können die pflanzliche Resistenzreaktion manipulieren, indem sie als Effektoren wirken. Im Weizenblattrostpilz Puccinia triticina Erikas beschleunigte der CFEM-Effektorkandidat PTTG_08198 das Fortschreiten des Zelltods und förderte die Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) [27]. Der Anthracnose-Pilz Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils enthält fünf Effektoren (CgCFEM6, 7, 8, 9 und 15), von denen gezeigt wurde, dass sie den BAX-induzierten programmierten Zelltod in Nicotiana benthamiana Domin unterdrücken [28]. Es wurde berichtet, dass der phytosymbiotische Mykorrhizapilz Laccaria bicolor (Maire) PDOrton mehrere CFEM-Proteine ​​wie Lac310796, Lac296573 und Lac296572 in symbiotischen Geweben sezerniert [29]. Obwohl die komplexen Funktionen dieser Proteine ​​bei der Mykorrhiza-Symbiose nicht weiter untersucht wurden, deuten frühere Ergebnisse darauf hin, dass CFEM-Proteine ​​bei der Signalübertragung zwischen Pilzen und Pflanzen eine Rolle spielen könnten. M. anisopliae kann in einer Wirtspflanze entweder als entomopathogener oder endophytischer Pilz fungieren [30]. Über die Rolle von CFEM-Proteinen wurde jedoch noch nicht berichtet. Wir haben zuvor ein CFEM-Domänen enthaltendes Protein in M. anisopliae identifiziert, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Hier berichten wir über die Beziehung zwischen MaCFEM85 und der Medicago sativa-Wand-assoziierten Kinase MsWAK16. Wir haben die MaCFEM85-Sequenz analysiert und Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, welche Reste für die Interaktion mit MsWAK16 entscheidend sind. Schließlich untersuchten wir unter Verwendung von N. benthamiana als Modellpflanze die Abwehrreaktionen der Pflanzen auf Botrytis cinerea und die Blattlaus Myzus persicae mit und ohne vorübergehender Expression von MaCFEM85 und MsWAK16.

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2. Ergebnisse

2.1. MaCFEM85 war am engsten mit nicht-pathogenen Pilz-CFEMs verwandt und in der Plasmamembran lokalisiert

Ein phylogenetischer Baum wurde erstellt, um die Beziehungen zwischen MaCFEM85 und anderen CFEM-Proteinen aus pathogenen und nicht-pathogenen Modellpilzen zu analysieren. Dazu gehörten Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl.), Neurospora crassa Shear & BODodge und Beauveria bassiana (Bals.) (siehe Abschnitt 4). MaCFEM85 war am engsten mit CFEM-Proteinen in B. bassiana verwandt und daher evolutionär näher an nicht-pathogenen als an pathogenen Pilzen (Abbildung 1a).

Abbildung 1a

2.2. MaCFEM85 wurde während Interaktionen mit M. sativa hochreguliert

Wandassoziierte rezeptorähnliche Kinasen (WAKs) stellen eine Untergruppe innerhalb der Superfamilie der rezeptorähnlichen Proteinkinasen (RLKs) dar und umfassen eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembranhelix und eine intrazelluläre Kinasedomäne. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Pflanzenwachstums, der Pflanzenentwicklung, der Stressreaktion und der Signalwege zur Pathogenresistenz [32]. RNA wurde nach gemeinsamer Inkubation aus M. anisopliae-Hyphen und M. sativa-Wurzeln extrahiert, um die Expressionsmuster von MaCFEM85 und MsWAK16 zu untersuchen. Sowohl MaCFEM85 als auch MsWAK16 wurden während der Co-Inkubation von 12 bis 6 0 Stunden in deutlich höheren Konzentrationen exprimiert (Abbildung 1c,d). Von 0 bis 36 Stunden nahm die MaCFEM85-Expression allmählich zu und erreichte nach 36 Stunden ihren Höhepunkt. Es wurde in der Kombination von M. anisopliae und M. sativa um das 593-fache stärker exprimiert als in allein angebautem M. anisopliae. Obwohl die MaCFEM85-Expression im Zeitraum von 48 bis 60 Stunden leicht zurückging, war die Expression immer noch deutlich höher als bei M. anisopliae, die allein gezüchtet wurde. Auch MsWAK16 war deutlich hochreguliert, wobei die Expression nach 36 Stunden ihren Höhepunkt erreichte. In M. sativa, das mit M. anisopliae infiziert war, wurde MsWAK16 89,06-mal stärker exprimiert als in M. sativa ohne M. anisopliae. Von 36 bis 60 Stunden nahmen die MsWAK16-Spiegel leicht ab, ihre Expression war jedoch immer noch deutlich höher als in den nicht inokulierten Pflanzen.

2.3. MaCFEM85 interagiert mit MsWAK16 in vitro und in vivo

Um den möglichen Funktionsmechanismus von MaCFEM85 als Reaktion auf die Behandlung mit M. anisopliae zu untersuchen, wurde ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screening (Y2H) durchgeführt, um vorläufig Wirtsproteine ​​zu identifizieren, die mit MaCFEM85 interagieren. Die Wechselwirkung zwischen der extrazellulären Domäne von MsWAK16 (MsWAK16-ED) und MaCFEM85 wurde mit einem Eins-zu-eins-Hefe-Zwei-Hybrid-Assay unter Verwendung von MaCFEM85 in pGBKT7 als BD-Vektor und MsWAK16 in pGADT7 als AD-Vektor untersucht. Die gesamte transformierte Hefe wuchs gut auf SD-T/L-defizientem Medium, und die Positivkontrollgruppe und die Versuchsgruppe wuchsen erfolgreich auf SD-T/L/H/A + X{17}}gal-defizientem Medium. Dies deutete darauf hin, dass MaCFEM85 mit MsWAK16-ED interagieren könnte (Abbildung 2a).

Abbildung 2. Validierung der Interaktion zwischen MaCFEM85 und MsWAK16.

Zur In-vitro-Validierung wurde mit Glutathion-S-Transferase (GST) markiertes MsWAK16-ED (kodierend für ein Produkt von 60 kDa) in pGEX6-P2 und mit Polyhistidin (His) markiertes MaCFEM85 eingefügt ( codiert ein Produkt von 17 kDa) wurde in pET-21b eingefügt. Immunblotting mit His- und GST-Antikörpern zeigte, dass das rekombinante Protein MaCFEM85-His mit der GST-MsWAK16-ED-Beute interagierte, jedoch nicht mit GST allein, und dass GST-MsWAK16-ED mit His interagierte -MaCFEM85 (Abbildung 2b). Um die Wechselwirkung zwischen MaCFEM85 und MsWAK16 weiter zu bestätigen, führten wir einen bimolekularen Fluoreszenzkomplementationstest (BiFC) mit MaCFEM85-YFPN- und MsWAK16-YFPC-Konstrukten durch. Die gleichzeitige Expression von MaCFEM85-YFPN und MsWAK16-YFPC in Tabakblättern erzeugte ein gelbes Fluoreszenzsignal, was darauf hinweist, dass MaCFEM85 mit MsWAK16 interagierte (Abbildung 2c).

2.4. Wichtige Standorte für MaCFEM85- und MsWAK16-Interaktionen

Um die Region von MaCFEM85 zu definieren, die für die Interaktion mit MsWAK16-ED erforderlich ist, wurden Proteindomänen mit der Online-Software SMART vorhergesagt (Abbildung 3a). MaCFEM85 enthielt eine CFEM-Domäne in der aa-Region 19-86. Die Tertiärstruktur wurde ebenfalls vorhergesagt (Abbildung 3b). Die acht Cysteine ​​in dieser Domäne führten zu vier Disulfidbindungen (CYS26 und CYS69, CYS30 und CYS64, CYS43 und CYS50 sowie CYS52 und CYS85), wodurch die Stabilität des Proteins erhalten blieb (Abbildung 3b). Um die mutmaßlichen Interaktionsstellen in MaCFEM85 zu validieren, wurden sieben mutierte Versionen des Proteins erzeugt und als Köderproteine ​​in pGBKT7 eingefügt. Jeder rekombinante Vektor wurde mit AD-MsWAK16-ED im Y2H-Gold-Stamm co-transfiziert. Der Stamm mit mutiertem CYS52 wuchs nicht auf selektiven Medien (Abbildung 3c, rot umrandet), was darauf hinweist, dass CYS52 für die Interaktion von MaCFEM85 mit MsWAK16-ED erforderlich ist.

2.5. Die Interaktion von MaCFEM85 mit MsWAK16 aktiviert die pflanzliche Immunantwort

2.5.1. Bewertung der Rolle von MaCFEM85 und MsWAK16 bei der Krankheitsresistenz gegen B. cinerea

Um die mögliche Beteiligung von MaCFEM85 und MsWAK16 an Abwehrreaktionen gegen Krankheitserreger zu untersuchen, untersuchten wir, ob eine Überexpression von MaCFEM85, MsWAK16 oder MaCFEM85 und MsWAK16 eine erhöhte Resistenz gegen B. cinerea hervorrufen könnte. Wir haben diese Vektoren vorübergehend in N. benthamiana-Blättern exprimiert. Ein Western-Blot-Assay zeigte, dass MaCFEM85 und MsWAK16 in vergleichbaren Mengen exprimiert wurden, wenn sie einzeln oder zusammen exprimiert wurden, was zeigt, dass MaCFEM85 und MsWAK16 erfolgreich in Tabak exprimiert wurden (Abbildung 4a). Krankheitstests wurden auch mit N. benthamiana durchgeführt, das mit MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 oder der GFP-Kontrolle infiltriert war. Die Läsionen waren auf mit MaCFEM85, MsWAK16 oder MaCFEM85+MsWAK16 infiltrierten Blättern im Vergleich zu den Kontrollpflanzen deutlich kleiner (um etwa 30 % 2 Tage nach der Inokulation) (Abbildung 4b). Diese Daten zeigen, dass die vorübergehende Expression von MaCFEM85 in N. benthamiana zu einer erhöhten Resistenz gegen B. cinerea führte und dass MaCFEM85 und MsWAK16 die Abwehrreaktion gegen B. cinerea positiv regulierten.

Abbildung 3. Identifizierung der Interaktionsstelle zwischen MaCFEM5 und MsWAK16.

Abbildung 4. Induktion von Pflanzenresistenz durch vorübergehende Expression von MaCFEM85 und MsWAK16.

2.5.2. Bewertung der Rolle von MaCFEM85 und MsWAK16 bei der Blattlausabwehr in N. benthamiana

Um die Rolle von MaCFEM85 und MsWAK16 weiter zu untersuchen, wurden N. benthamiana-Pflanzen, die vorübergehend MaCFEM85 und MsWAK16 exprimierten, mit M. persicae infiziert und die Populationen bewertet. Für dieses Experiment wurde ein großer Bereich jedes N. benthamiana-Blattes mit dem rekombinanten binären Vektor pYBA1132, der MaCFEM85 und MsWAK16 enthielt, agroinfiltriert. Als Kontrolle wurde GFP verwendet. 12 Stunden nach der Infiltration wurden 2 0 ausgewachsene M. persicae auf jedem Blatt in Käfigen gehalten, wodurch der infiltrierte Bereich Blattläusen ausgesetzt wurde. In den folgenden drei Tagen wurden die Sterblichkeit erwachsener Blattläuse und die Anzahl der Nymphen erfasst; Die Nymphen wurden dann entfernt. Es gab keinen signifikanten Unterschied im Mortalitätsrisiko zwischen M. persicae-Populationen, die sich von Pflanzen ernährten, die MaCFEM85, MsWAK16 oder MaCFEM85+MsWAK16 exprimierten (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081 ) (Abbildung 4c). Nach 24, 48 und 72 Stunden war jedoch die durchschnittliche Anzahl der von jeder erwachsenen Blattlaus produzierten Nachkommen bei N. benthamiana, die die GFP-Kontrolle exprimierten, signifikant höher als bei denen, die MaCFEM85, MsWAK16 oder MaCFEM85+MsWAK16 exprimierten (Abbildung 4d).

2.5.3. Bewertung der Rolle von MaCFEM85 und MsWAK16 bei der Hormonakkumulation und der hormonbedingten Genexpression

Um die Unterschiede zwischen den Abwehrreaktionen von N. benthamiana-Pflanzen, die eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 und MaCFEM85+MsWAK16 exprimieren, zu analysieren, haben wir die JA-, SA- und Gesamtflavonoidspiegel sowie die Expression verwandter Gene gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die JA- und SA-Werte zwischen Pflanzen unterschieden, die eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 und MaCFEM85+MsWAK16 exprimierten (Abbildung 5a). Im Vergleich zu Pflanzen, die eGFP exprimierten, waren die JA-Spiegel in Pflanzen, die MaCFEM85 exprimierten, signifikant niedriger; Die SA-Werte waren leicht erhöht, die Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. Im Gegensatz dazu zeigten Pflanzen, die MsWAK16 exprimierten, keine signifikanten Unterschiede in den JA-Spiegeln im Vergleich zur eGFP-Kontrolle, wohingegen die SA-Spiegel deutlich niedriger waren als in der Kontrolle (Abbildung 5a). Die JA- und SA-Werte waren in Pflanzen, die MaCFEM85+MsWAK16 exprimierten, im Vergleich zu eGFP signifikant erhöht bzw. verringert.

Abbildung 5. Hormonspiegel und Genexpression der Hormonreaktion

Der Gesamtflavonoidgehalt war in Pflanzen, die MaCFEM85+MsWAK16 exprimierten, im Vergleich zu allen anderen Behandlungsgruppen signifikant höher (Abbildung 5a). Die Expressionsniveaus der biosynthetischen Gene waren in Pflanzen, die MsWAK16 und MaCFEM85+MsWAK16 exprimierten, ähnlich. Beispielsweise waren die mit der JA-Reaktion verbundenen Gene, nämlich COI1, MYC2 und PDF1.2, im Vergleich zu Pflanzen, die GFP exprimierten, deutlich hochreguliert (Abbildung 5b). In ähnlicher Weise wurden die SA-verwandten Gene NPR1, WRKY70 und PR1 in Pflanzen, die MsWAK16 und MaCFEM85+MsWAK16 exprimierten, signifikant unterschiedlich exprimiert; NPR1 war hochreguliert, wohingegen WRKY70 und PR1 im Vergleich zur Kontrolle herunterreguliert waren (Abbildung 5b). Wir untersuchten auch die Expression von Schlüsselgenen in den Shikimisäure- und Phenylpropanoid-Synthesewegen, die beide mit der Flavonoidsynthese zusammenhängen. Im Allgemeinen führte die alleinige Expression von MaCFEM85 nicht zu einer signifikant höheren Expression dieser Gene im Tabak. Allerdings waren diese Gene in Tabak, der MsWAK16 oder MsWAK16+MaCFEM85 exprimierte, im Vergleich zur GFP-Kontrolle hochreguliert (Abbildung 5c).

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3. Diskussion

3.1. Das konservierte CFEM-Proteinmotiv erfüllt in Pilzarten mehrere Funktionen

Die CFEM-Domäne ist einzigartig bei Pilzen und kommt häufig in extrazellulären Membranproteinen von Pilzen vor. Die Domäne stammt vom jüngsten gemeinsamen Vorfahren von Ascomycota und Basidiomycota [33]. Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass CFEM-Proteine ​​in Pilzpathogenen als pflanzliche Immunregulatoren fungieren können, die je nach Art der Infektion eine Unterdrückung oder Aktivierung des Immunsystems der Wirtspflanze bewirken können [28,34,35]. Es gibt nur wenige Berichte über CFEM-Domänen enthaltende Proteine ​​in M. anisopliae, lediglich im Zusammenhang mit einem evolutionären Vergleich mit anderen Pilzen [36]. In dieser Studie verglichen wir die CFEM-Proteine ​​von M. anisopliae mit anderen bekannten CFEM-Proteinen sowohl in pathogenen als auch in nicht-pathogenen Pilzen. Wir haben bestätigt, dass das nächste Homolog von MaCFEM85 Cfem5 ist, das in Beauveria bassiana vorkommt, einem von 12 CFEM-Proteinen dieser Art (Ergänzende Abbildung S1). BbCfem5 ist für die Eisenaufnahme essentiell [37]. Darüber hinaus ist die CFEM-Domäne in MaCFEM85 basierend auf der vorhergesagten Tertiärstruktur dem in Candida albicans (CPRobin) Berkhout gefundenen Surface Antigen Protein 2 (CSA2) sehr ähnlich, in dem 65 Reste (96 % der Sequenz) mit 99,8 modelliert wurden % Konfidenz [31]. Candida albicans ist ein Tierpathogen; CSA2 spielt eine wichtige Rolle bei Wachstum und Pathogenität, indem es Häm aus Hämoglobin extrahiert und Häm von der Zellwand zum Plasma transportiert [38–40]. Wir gehen davon aus, dass MaCFEM85 an der Virulenz von Insektenwirten durch M. anisopliae beteiligt sein könnte. Diese kombinierten Funktionen von MaCFEM85 bei tierpathogenen Infektionen und der Aktivierung der pflanzlichen Immunität machen das Protein zu einem spannenden zukünftigen Forschungsschwerpunkt.

3.2. Disulfidbindungen sind wichtige Strukturen für die Proteinfunktion

Die Konformationsintegrität einer Proteinstruktur steht in direktem Zusammenhang mit ihrer Funktionsfähigkeit. Die von Cysteinpaaren gebildeten Disulfidbindungen fördern die Proteinfaltung und Konformationsstabilität und gelten als Schlüsselstellen für die Erkennung und Bindung spezifischer Rezeptoren oder Liganden [41]. Beispielsweise führt die Unterbrechung einer der drei konservierten Disulfidbindungen im Effektorprotein AVR4 des Pflanzenpathogens Cladosporium fulvum zu einer Proteaseempfindlichkeit und einer verringerten Chitinbindungsfähigkeit [42]. In drei anderen C. fulvum-Proteinen (ECP1, ECP2 und ECP5) dämpfen einzelne Cysteine ​​durch Alanine die überempfindliche Reaktion der Tomate, was darauf hindeutet, dass die Cysteine ​​für die Aufrechterhaltung der Stabilität und der überempfindlichen Reaktion auslösenden Aktivität von entscheidender Bedeutung sind [43]. Darüber hinaus kann im reifen Protein MC69 von Magnaporthe oryzae die Mutagenese von zwei konservierten Cysteinresten (Cys36 und Cys46) die MC69-Funktion beeinträchtigen, ohne die Sekretion zu beeinträchtigen, was auf die Bedeutung der Disulfidbindung speziell für die Pathogenität von MC69 schließen lässt [44]. Die CFEM-Domäne scheint in Größe und Muster der Cysteinreste den EGF-ähnlichen Domänen zu ähneln, die drei oder vier Paare von Disulfidbindungen enthalten. EGF-Proteine ​​können als Zelloberflächenrezeptoren, Signalwandler oder Adhäsionsmoleküle bei Wirt-Pathogen-Interaktionen fungieren [45]. In dieser Studie fanden wir nicht nur heraus, dass die CFEM-Domäne von MaCFEM85 acht konservierte Cysteine ​​enthielt, die vier Paare von Disulfidbindungen bildeten (Abbildung 3b), sondern wir bestätigten auch, dass CFEM die entscheidende Domäne für die Interaktion zwischen MaCFEM85 und MsWAK16 war. Darüber hinaus fanden wir durch ortsspezifische Mutation von Cysteinresten zu Alanin, dass der Cysteinrest an Position 52 die für die Wechselwirkung erforderliche Kernstelle war (Abbildung 3c). Diese Ergebnisse bilden eine Grundlage für weitere Untersuchungen der physiologischen Funktionen der CFEM85-WAK16-Wechselwirkung.

3.3. Die Wechselwirkung von MaCFEM85 mit MsWAK16 aktivierten pflanzlichen Abwehrkräften

Bei Mikroben-Pflanzen-Interaktionen werden pflanzliche Abwehrreaktionen im Allgemeinen durch mikrobielle Effektorproteine ​​aktiviert. Die induzierte Abwehr wird zu einem wichtigen Instrument der biologischen Schädlingsbekämpfung zur Förderung von Resistenzen. CFEM-Proteine ​​wurden als Effektoren identifiziert, die an der Regulierung der Aktivierung oder Hemmung des pflanzlichen Immunsystems beteiligt sind [28,46]. Es gibt jedoch nur wenige veröffentlichte Forschungsergebnisse, die die Regulierung dieser Immunfaktoren mit ihrer spezifischen Rolle bei Pflanzenkrankheiten und Insektenresistenz in Verbindung bringen. In dieser Studie verwendeten wir einen entomopathogenen und endophytischen Pilz, M. anisopliae, um eine Wechselwirkung zwischen MaCFEM85 und einer Zellwand-assoziierten Kinase, MsWAK16, in M. sativa zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Wechselwirkung das Läsionsverhältnis nach der Inokulation mit B. cinerea verringerte (Abbildung 4b) und die Populationswachstumsrate von M. persicae verringerte (Abbildung 4d), was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung zwischen MaCFEM85 und MsWAK16 die Resistenz von M. sativa gegen Blattläuse erhöhte. Änderungen der Konzentrationen von JA, SA und Ethylen (ET) können als Marker zur Bewertung der Induktion von Pflanzenresistenz verwendet werden [47,48]. Hier haben wir gezeigt, dass MaCFEM85 mit MsWAK16 interagiert, um die Pflanzenresistenz durch hormonelle Regulierung zu beeinflussen und die Reproduktionsrate von M. persicae zu hemmen (Abbildung 4d). Über ähnliche Studien wurde bereits berichtet. Beispielsweise wurde gezeigt, dass das Brevibacillus laterosporus-Effektorprotein PeBL1 die JA- und SA-Akkumulation in Tomaten induziert und die Wachstumsrate der Populationen von M. persicae der zweiten und dritten Generation verringert, die sich von diesen Pflanzen ernährten. Darüber hinaus haben mit Effektoren besprühte Tomatenpflanzen eine abstoßende Wirkung auf M. persicae [49]. Die Anwendung des Auslöseproteins PeBC1 auf Gartenbohnen (Phaseolus vulgaris L.) führt zu ausgeprägten und signifikanten subletalen Auswirkungen auf grüne Pfirsichblattläuse. Mit PeBC1 behandelte Pflanzen zeigen eine signifikante Hochregulierung der mit JA und SA verbundenen Gene [50]. Der Beauveria bassiana-Auslöser PeBb1 reduziert die Fruchtbarkeit von M. persicae auf Tabak und induziert die Expression von JA- und ET-bezogenen Genen (51). In der vorliegenden Studie führte die vorübergehende Expression von MaCFEM85 und MsWAK16 in Tabak zu einer signifikanten Hochregulierung der JA-Reaktionsgene COI1, MYC2 und PDF1.2 (Abbildung 5b) und einem Anstieg des JA- und Gesamtflavonoidgehalts (Abbildung 5a), was mit den Ergebnissen vergleichbar war in der Literatur wie oben beschrieben. Allerdings konnten wir 12 Stunden nach der Infiltration keine hohen SA-Werte im Tabak feststellen, und Pflanzen, die vorübergehend MsWAK16 oder MaCFEM85+MsWAK16 exprimierten, zeigten signifikant verringerte SA-Werte und eine Herunterregulierung der an der SA-Reaktion beteiligten Gene (Abbildung 5a,b). . Dies zeigte, dass die Stimulation verschiedener Pflanzenhormone nicht nur zu synergistischen Aktivitäten, sondern auch zu Übersprechen und Rückkopplungen führen kann, sodass Pflanzen angemessen auf unterschiedliche Reize reagieren können. In Pflanzen wurde bereits über erhöhte JA-Werte, aber niedrige SA-Werte berichtet. Beispielsweise waren die JA-Spiegel bei A. thaliana, denen die SA-Akkumulation fehlte, um das 25-fache höher als bei Wildtyp-A. thaliana, und auf JA reagierende Gene wurden aktiviert [52]. Es wurde auch berichtet, dass einige Bakterien den JA-Spiegel in Pflanzen erhöhen können, um die SA-Anreicherung zu hemmen und so den durch SA verursachten Schaden zu vermeiden. Beispielsweise zielt Pseudomonas syringae über ein Toxin, Coronatin, auf den COI1-Rezeptor ab, das den JA-Signalweg negativ reguliert [53]. Dies fördert die durch MYC2-induzierte Hochregulierung der Transkriptionsfaktoren ANAC019, ANAC055 und ANAC072 [54], hemmt die Transkription von ICS1 (einem Schlüsselgen für die SA-Synthese) und reguliert so die SA-Produktion und Signaltransduktion herunter. In der vorliegenden Studie führte die Wechselwirkung zwischen MaCFEM85 und MsWAK16 zu einer erhöhten JA-Akkumulation und Hochregulierung von JA-responsiven Genen, jedoch zu einer Hemmung der SA-Akkumulation und Transkription von SA-bezogenen Genen. Dies deutete darauf hin, dass die Wechselwirkung zwischen MaCFEM85 und MsWAK16 JA induzierte und dadurch die Resistenz der Pflanzen gegen Blattläuse verbesserte.

In N. benthamiana, das vorübergehend MaCFEM85 und MsWAK16 exprimierte, waren die JA-Spiegel erhöht und die Größe der B. cinerea-Läsionen verringert (Abbildung 4b), was mit früheren Studien übereinstimmt. JA ist an der Pflanzenresistenz gegen Insekten und nekrotrophe Krankheitserreger beteiligt [52,55]. Als nekrotropher Erreger wurde B. cinerea durch JA- und ET-Akkumulation gehemmt [56]. In der A. thaliana ET-defizienten Mutante ein2-1 und der JA-Response-Mutante coi1-1 waren die Spiegel des Downstream-Verteidigungsgens PDF1.2 signifikant reduziert und die Empfindlichkeit gegenüber B. cinerea erhöht [ 57]. Wir fanden hier heraus, dass die JA-Akkumulation und die Transkription von JA-verwandten Genen in N. benthamiana, die vorübergehend MaCFEM85 und MsWAK16 exprimierten, signifikant erhöht waren, wohingegen die Akkumulation von SA und die Transkription von SA-verwandten Genen gehemmt waren. Die Expression von MaCFEM85 und MsWAK16 zeigte auch eine hemmende Wirkung auf B. cinerea. Dies deutete darauf hin, dass JA durch MaCFEM85 und MsWAK16 aktiviert wurde und eine führende Rolle bei der Pflanzenresistenz gegen B. cinerea spielte.

4. Materialien und Methoden

4.1. Pilzstämme, Pflanzenmaterialien und Kultivierungsmethoden

Metarhizium anisopliae-Isolatstämme Ma 9 wurden auf Kartoffel-Zucker-Agar (PSA)-Medium (2 00 g geschälter Kartoffelextrakt, gekocht in Wasser, 20 g Saccharose und 15 g Agar/L) kultiviert. Nach 10 Tagen wurde frisches Sporangiumpulver gesammelt. Nicotiana benthamiana-Pflanzen wurden in einer künstlichen Klimakammer mit einem 14/10-stündigen Hell-/Dunkel-Zyklus (27/25 °C) gezüchtet. Für die vorübergehende Genexpression mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation wurde der Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 in Luria Broth (LB)-Medium (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl/L) kultiviert. Der Hefestamm Gold (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) wurde auf Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium (YPDA) (10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 g Glucose und 0,03 g Adeninhemisulfat/l) kultiviert. Für jeden Vektor und Stamm wurden geeignete Antibiotika verwendet, nämlich Rifampin, Kanamycin oder Ampicillin (jeweils 25, 50 oder 50 µg/ml). Die in dieser Studie verwendeten Stämme und Plasmide sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Medicago sativa-Samen wurden 1 Minute lang mit 75 % Ethanol und anschließend 15 Minuten lang mit 50 % NaClO (5,5 %) oberflächensterilisiert. Die Samen wurden gründlich gemischt und dann dreimal jeweils 5 Minuten lang in sterilem Wasser gewaschen. Die Samen wurden über 24 Stunden lang bei 4 °C im Dunkeln inkubiert und dann über Nacht bei Raumtemperatur auf 1 % Wasser-Agarplatten gekeimt. Drei Tage nach der Keimung wurden die sich entwickelnden Sämlinge auf Filterpapier auf sterilen Petrischalen mit einer Größe von 9- cm übertragen, mit 20 Sämlingen pro Schale. Die Behandlungen und die Kontrolle wurden jeweils 15 Gerichten zugeordnet. Die Sämlinge wurden dann mit 10 ml M. anisopliae-Sporensuspension mit 107/ml bewässert, und die Kontrolle wurde mit 10 ml sterilem Wasser bewässert. Um 0, 12, 24, 48 und 60 Stunden wurde für jedes Zeitintervall eine zufällige Auswahl an Sämlingen aus drei Petrischalen entnommen. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert.

4.2. qRT-PCR und Plasmidkonstruktion

Die Gesamt-RNA wurde aus M. anisopliae (Hyphen) und M. sativa (Wurzeln) mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Qualität und Häufigkeit der resultierenden RNA wurden mit einem NanoPhotometer® (Implen, München, Deutschland) gemessen. Die Erststrang-cDNA-Synthese (bis zu 2 μg RNA) wurde unter Verwendung von 5× All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Kanada) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die qRT-PCR wurde mit 2×SYBR Green qPCR Master Mix von EVER BRIGHT ® INC. aus den USA und dem ABI QuantStudio 5-System gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die für jedes Gen verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt. Maury [58], Msactin [59] und Nbactin [60] wurden als interne Referenzgene für die Normalisierung der Expressionsdaten verwendet. Die Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 5 Minuten bei 95 °C, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 15 Sekunden und bei 60 °C für 40 Sekunden. Für jede Probe gab es drei technische Replikate. Der relative Ausdruck wurde mit der 2−∆∆Ct-Methode berechnet [61]. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und des Duncan-Mehrbereichstests in SPSS v20.0 (SPSS) bestimmt.

4.3. Vorübergehende Expression von Proteinen in N. benthamiana

Die MaCFEM85-Kodierungssequenz (CDS) wurde mit Ultra-Fidelity-DNA-Polymerase unter Verwendung von cDNA als Matrize amplifiziert. Für die subzellulären Lokalisierungstests wurden PCR-Produkte, die das CDS für MaCFEM85 enthielten, in pYBA1132-eGFP (verdaut mit EcoRI und SalI) bzw. pcambia1300-cherry (EcoRI und SacI) kloniert. Alle Konstrukte wurden durch Sequenzierung validiert (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Peking, China). Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt. Für die vorübergehende Expression von MaCFEM85-eGFP und MaCFEM85-mCherry in N. benthamiana wurde der A. tumefaciens-Stamm GV3101 mit jedem Plasmid transformiert und mit PCR verifiziert. Das Agrobacterium wurde über Nacht bei 28 °C unter Schütteln kultiviert. Die Zellen wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 5000 U/min bei Raumtemperatur gesammelt, dreimal mit sterilem doppelt destilliertem Wasser gewaschen und in 10 mM MgCl2-Puffer (enthaltend 10 mM MES und 10 mM Acetosyringon, pH 5,7) resuspendiert. Die Zellsuspension wurde auf eine OD600 von 0,5 eingestellt und dann mit einer 1--ml-Spritze in die Unterseite von 4- bis 5- Wochen alten N. benthamiana-Blättern infiltriert. Jedes Blatt wurde mit 50 µL A. tumefaciens infiltriert; Pro Pflanze wurden drei Blätter behandelt und in jeder Behandlungsgruppe befanden sich drei Pflanzen. Die behandelten Blätter wurden nach 30 Stunden gesammelt und mit einem konfokalen Zeiss LSM980-Mikroskop (Carl Zeiss, Deutschland) sichtbar gemacht, um die subzelluläre Lokalisierung zu bestimmen.

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4.4. Phylogenetische Analyse

Ein phylogenetischer Baum wurde mithilfe der Neighbor-Joining-Methode in MEGA X erstellt. 1000 Bootstrap-Replikate verwendeten das P-Distanzmodell. Die zur Erstellung des Baums verwendeten Aminosäuresequenzen wurden mit BLASTP-Suchen in der NCBI-Datenbank verwandter Pilze (z. B. Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Lasiodiplodia theobromae, Gliocladium roseum) ermittelt , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana und Paecilomyces lilacinus) unter Verwendung von MaCFEM85 als Abfrage.

4.5. Hefe-Zwei-Hybrid-Assays

Das Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc.; jetzt Takara Bio USA, Inc.) wurde verwendet, um die Wechselwirkung zwischen MaCFEM85 und MsWAK16 zu verifizieren. MaCFEM85 ohne das Signalpeptid wurde als Köder in pGBKT7 eingeführt und die extrazelluläre Domäne von MsWAK16 (MsWAK16-ED) wurde als Beute in pGADT7 eingefügt. Die Vorbereitung und Transformation hefekompetenter Zellen wurde unter Verwendung eines Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Köder- und Beuteplasmide wurden in den Hefestamm Gold co-transformiert. Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden basierend auf dem Wachstum auf Platten mit SD-Doppel-Dropout-Medium (DDO, SD/-Trp-Leu) und SD-Vierfach-Dropout-Medium (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade) analysiert.

4.6. BiFC-Assay

Um die BiFC-Konstrukte zu erzeugen, wurden die pUC-SPYNE- und pUC-SPYCE-Vektoren durch Verdauung mit BamHI linearisiert. Die CDS voller Länge von MaCFEM85 und MsWAK16 wurden jeweils kloniert und unter Verwendung eines rekombinanten Enzyms in die linearisierten Plasmide eingefügt, um die Konstrukte MaCFEM85-YFPN und MsWAK16-YFPC zu erhalten. Die Plasmide, die MaCFEM85 und MsWAK16 enthielten, wurden mit leeren Vektoren als Negativkontrollen co-transformiert (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE und pUC-SPYNE + pUC-SPYCE). . Alle Vektoren wurden wie oben beschrieben über eine Agrobacterium-vermittelte Transformation in N. benthamiana eingeführt. Fluoreszenzsignale wurden in Blattepidermiszellen mit einem konfokalen Zeiss LSM980-Mikroskop (Carl Zeiss, Deutschland) beobachtet. Die für die Vektorkonstruktion verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt.

4.7. GST-Pull-Down-Assay

Für die GST-Pulldown-Assays wurde MsWAK16-ED in den pGEX-6P-2-Vektor und MaCFEM85 in pET-21b eingefügt. Die gereinigten Fusionsproteine ​​(GST-MsWAK16- ED) und das pGEX-6P-2-No-Load-Protein (GST) wurden als Köderprotein und gereinigtes pET-21 verwendet. Als Beute wurde das b-MaCFEM85-Fusionsprotein (His-MaCFEM85) verwendet. GST-Pulldown-Assays wurden mit dem Proteinreinigungssystem Mag-Beads GST Fusion (Sangon Biotech, Shanghai, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, Mag-Beads wurden fünfmal mit 1× phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen, um den Alkoholschutz freizusetzen, und dann wurden 10 ml GST oder GST-MsWAK16-ED hinzugefügt. Die Perlen wurden durch 30-minütiges Umdrehen bei Raumtemperatur gemischt. Nach dem Entfernen des Überstands wurden die Mag-Beads fünfmal mit 1× PBS gewaschen. His-MaCFEM85 wurde zu bereits mit GST gebundenen Mag-Beads gegeben und die Mischung über Nacht bei 4 °C unter Rotation inkubiert. Anschließend wurden die Perlen fünfmal mit 1× PBS gewaschen, um ungebundene Proteine ​​zu entfernen. Anschließend wurden die auf den Perlen immobilisierten Proteine ​​durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Nitrozellulosemembran (100 V, 1 h) übertragen und per Western Blot analysiert. Die Membranen wurden dreimal jeweils 10 Minuten lang mit PBS + Tween (PBST) gewaschen. Die Membranen wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 5 % Magermilch blockiert und dann mit ProteinFind-Anti-His-Maus-monoklonalem Antikörper (TransGen Biotech, Peking, China) (verdünnt 1:3000) oder ProteinFind-Anti-GST-Maus-Monoklonal-Antikörper für 2 Stunden inkubiert h bei 4 ◦C. Die Membranen wurden dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in ProteinFind-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG(H+L) (HRP)-Antikörper (TransGen Biotech, Peking, China) (verdünnt 1:5000) getaucht. Die Membranen wurden mit dem EasySee® Western Blot Kit (TransGen Biotech, Peking, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers sichtbar gemacht.

4.8. Identifizierung der Schlüsselstelle in MaCFEM85

Um die für die Interaktion von MaCFEM85 mit MsWAK16 erforderliche Größe zu bestimmen, wurde eine PCR-Amplifikation durchgeführt, um mehrere verkürzte Formen von MaCFEM85 zu erzeugen. Die CFEM-Domäne (MaCFEM85-CFEM; aa-Reste 19–86) und der C-Terminus ohne die CFEM-Domäne (MaCFEM85-C, aa-Reste 87–170) wurden in den Vektor eingefügt pGBKT7 als Köderprotein (Ergänzungstabelle S1). Weitere fünf Varianten wurden mithilfe der Polypeptidsynthese konstruiert, um Cystein an den Positionen 26, 30, 43, 52 und 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8543, ∆) zu Alanin zu mutieren CFEM8552 bzw. ∆CFEM858 alle). Diese Varianten wurden verwendet, um Y2H-Experimente mit MsWAK16-ED durchzuführen. Die transformierten Hefezellen wurden auf Wachstum auf synthetischen Dropout-SD/-Trp-Leu-Platten und SD/-Trp-Leu-His-Ade-Platten, die X- -Galactosidase (X- -Gal) enthielten, untersucht.

4.9. Pflanzenresistenztests

Myzus persicae wurden von Henan Quanying Biological Co., Ltd. bezogen. Eine Woche vor Beginn der Biotests wurden 150 erwachsene Blattläuse auf drei N. benthamiana-Pflanzen platziert (50 Blattläuse pro Pflanze). Nach 72 Stunden wurden alle erwachsenen Tiere mit einem weichen Künstlerpinsel entfernt und die Nymphen konnten weitere vier Tage lang fressen, bevor sie für die Blattlausleistungstests nach N. benthamiana überführt wurden.

4.10. Blattlaus-Leistungstests

Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) wurde verwendet, um die Leistung von M. persicae, die Pflanzenkrankheitsresistenz gegen B. cinerea und die Expression hormonbezogener Gene zu bewerten. Agrobacterium, das entweder pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 oder pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 trug, wurde in LB, ergänzt mit geeigneten Antibiotika, 36 Stunden lang bei 28 °C gezüchtet. Die Zellen wurden dreimal gewaschen und dann in Infiltrationspuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES und 100 µM Acetosyringon, pH 5,6) bis zu einer OD600 von 0,6 resuspendiert. Zur Koinfektion wurden Bakterien, die MaCFEM85 und MsWAK16 trugen, auf eine OD600 von 1,2 eingestellt und dann in gleichen Volumina gemischt. Vollständig entfaltete Blätter wurden mit nadellosen 1--ml-Spritzen mit Bakterien infiltriert. Auf jede Pflanze wurden drei Blätter infiltriert und jede Behandlung auf drei Pflanzen angewendet, also insgesamt 12 Pflanzen pro Experiment.

Für die Blattlausleistungstests wurden 20 erwachsene Blattläuse 12 Stunden nach der Anwendung des Agrobacteriums auf den infiltrierten Bereich jedes Blattes aufgebracht. Die Blattläuse wurden in Klammerkäfigen mit 5 mm Durchmesser eingesperrt. Jede Behandlung wurde fünfmal wiederholt. Die Sterblichkeit erwachsener Blattläuse und die Anzahl neu gelegter Nymphen wurden drei Tage lang täglich aufgezeichnet. B. cinerea wurde am PDAY fünf Tage lang kultiviert. 12 Stunden nach der Agrobacterium-Infiltration wurde das neu kultivierte B. cinerea in einen 5- mm großen Pilzkuchen gestanzt und die Myzelwachstumsoberfläche wurde an der Infiltrationsfläche auf der Blattoberfläche befestigt. Um die Krankheitsentwicklung zu erleichtern, wurden die Pflanzen feucht gehalten, indem man sie in Schalen bei 22 °C mit Plastikfolie abdeckte, um das Fortschreiten der Krankheit zu erleichtern. Nach 48 Stunden wurde der Krankheitsfortschritt in inokulierten Blättern durch Messung der Läsionsgröße abgeschätzt. Zur Quantifizierung der relativen Expression relevanter Gene wurden die drei infiltrierten Blätter 12 Stunden nach der Infiltration von jeder Pflanze gesammelt, dann in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 Grad gelagert. Die Gesamt-RNA-Extraktion, die cDNA-Synthese und die qRT-PCR wurden wie in Abschnitt 3.2 beschrieben durchgeführt. Die Salicylsäure (SA), Jasmonsäure (JA) und Flavonoidspiegel wurden pro Behandlung in 15 infiltrierten N. benthamiana-Blättern gemessen. Die Blätter wurden gesammelt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bei –80 Grad gelagert. Pflanzenhormone wurden mit den ELISA-Kits „Plant Salicylic Acid“ und „Plant Jasmonic Acid“ (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.) quantifiziert, und Flavonoide wurden mit dem „Micro Plant Flavonoids Assay Kit“ (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) quantifiziert die Anweisungen des Herstellers.

4.11. Statistische Analyse

Die Daten wurden in SPSS v20.0 analysiert. Signifikante Unterschiede in den Expressionsniveaus von MaCFEM85 und MsWAK16 wurden mithilfe eines Student-T-Tests ermittelt. Signifikante Unterschiede in den SA-, JA- und Flavonoidspiegeln wurden mithilfe der einfaktoriellen ANOVA und des Duncan-Mehrbereichstests mit einem Schwellenwert von p < 0,05 ermittelt.

5. Schlussfolgerungen

In dieser Studie haben wir ein neues sekretiertes Protein, MaCFEM85, in M. anisopliae identifiziert und charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass es sich um einen konservierten Effektor handelt, der mit MsWAK16 interagieren und die Abwehrreaktion von N. benthamiana aktivieren kann. Wir haben gezeigt, dass die CFEM-Domäne und der Cysteinrest an Position 52 in MaCFEM85 für die Interaktion entscheidend sind. Diese Interaktion kann JA-bedingte Immunantworten sowie krankheits- und insektenresistente Mechanismen in der Pflanze aktivieren.

Verweise

1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Bueno, MA; García, MB; Dardanelli, MS Partnerschaften zwischen Pflanzen und Mikroben: Auswirkungen auf Wachstum und Pflanzengesundheit. Symbiose pflanzlicher Mikroben: Grundlagen und Fortschritte; Springer: Berlin/Heidelberg, Deutschland, 2013; S. 105–117. [CrossRef]

2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Aufklärung der Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben: Kann die Transkriptomik mehrerer Arten helfen? Trends Biotechnologie. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]

3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Füttere deine Freunde: Gestalten Pflanzenexsudate das Wurzelmikrobiom? Trends Pflanzenwissenschaft. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]

4. Lugtenberg, B.; Kamilova, F. Pflanzenwachstumsfördernde Rhizobakterien. Annu. Rev. Microbiol. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]

5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Induzierte systemische Resistenz und Pflanzenreaktionen auf pilzliche Biokontrollmittel. Annu. Rev. Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]

6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Stoffwechsel- und transkriptomische Veränderungen, die in Arabidopsis durch das Rhizobakterium Pseudomonas fluorescens SS101 hervorgerufen werden. Pflanzenphysiologie. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]

7. Lareen, A.; Burton, F.; Schafer, P. Pflanzenwurzel-Mikroben-Kommunikation bei der Gestaltung von Wurzelmikrobiomen. Pflanzenmol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]

8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Der insektenpathogene Pilz Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) ist ebenfalls ein Endophyt, der die Wurzelentwicklung von Pflanzen stimuliert. Bin. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]

9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Antagonismus des endophytischen insektenpathogenen Pilzes Metarhizium robertsii gegen den Bohnenpflanzenpathogen Fusarium solanif. sp. Phaseoli. Dürfen. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]

10. Ahmad, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endophytisches Metarhizium robertsii fördert das Maiswachstum, unterdrückt das Insektenwachstum und verändert die Genexpression der Pflanzenabwehr. Biol. Control 2020, 144, 104167. [CrossRef]

11. Chairin, T.; Petcharat, V. Induktion von Abwehrreaktionen in Hongkong-Früchten (Aglaia dookkoo Griff.) gegen Fruchtfäulepilze durch Metarhizium guizhouense. Biol. Kontrolle 2017, 111, 40–44. [CrossRef]

12. Hao, K.; Wang, F.; Nong, X.; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Reaktion von Erdnuss-Arachis hypogaea-Wurzeln auf das Vorhandensein nützlicher und pathogener Pilze durch Transkriptomanalyse. Wissenschaft. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]

13. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM Kapitel 11 – Rolle von Pilzauslösern im pflanzlichen Abwehrmechanismus. In molekularen Aspekten pflanzennützlicher Mikroben in der Landwirtschaft; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., Hrsg.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2020; S. 143–158. [CrossRef]

14. Dong, X.; Sa, JA Ethylen und Krankheitsresistenz bei Pflanzen. Curr. Meinung. Pflanzenbiol. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]

15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Separate Jasmonat- und Salicylat-abhängige Abwehr-Reaktionswege in Arabidopsis sind für die Resistenz gegen verschiedene mikrobielle Krankheitserreger von entscheidender Bedeutung. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]

16. Hose, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL) Fördert die antivirale Abwehr gegen das Panicum-Mosaik-Virus und seine Satelliten. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]

17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Expressionsprofil eines PAL-Gens aus Astragalus membranaceus var. Mongholicus und seine entscheidende Rolle beim Fluss in die Flavonoid-Biosynthese. Plant Cell Rep. 2006, 25, 705–710. [CrossRef]

18. De Geyter, N.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Transkriptionsmaschinen im durch Jasmonat ausgelösten pflanzlichen Sekundärstoffwechsel. Trends Pflanzenwissenschaft. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]

19. Mirjalili, N.; Linden, JC Auswirkungen der Gasphasenzusammensetzung auf Suspensionskulturen von Taxus cuspidata. Biotechnologie. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [CrossRef]

20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Transkriptionsprofil von Taxus chinensis-Zellen als Reaktion auf Methyljasmonat. BMC-Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]

21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, ​​PA; Dubery, IA Metabolomics-abgeleitete Erkenntnisse über die Manipulation der Terpenoidsynthese in Centella asiatica-Zellen durch Methyljasmonat. Pflanzenbiotechnologie. Rep. 2015, 9, 125–136. [CrossRef]

22. Lu, M.; Wong, H.; Teng, W. Auswirkungen der Auslösung auf die Produktion von Saponin in der Zellkultur von Panax Ginseng. Plant Cell Rep. 2001, 20, 674–677. [CrossRef]

23. Mandal, S.; Kar, ich.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Elicitor-induzierte Abwehrreaktionen in Solanum lycopersicum gegen Ralstonia solanacearum. Wissenschaft. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]

24. Li, L.; Wang, S.; Yang, X.; Francis, F.; Qiu, D. Der Proteinauslöser PeaT1 verstärkte die Resistenz gegen Blattläuse (Sitobion avenae) in Weizen. Schädlingsbekämpfer Wissenschaft. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]

25. Bujalowski, W. Erweiterung der physiologischen Rolle der hexameren DnaB-Helikase. Trends Biochem. Wissenschaft. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]

26. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdansky, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Die drei GPI-verankerten Proteine ​​der CFEM-Domäne von Aspergillus fumigatus (CfmA-C) beeinflussen die Zellwandstabilität, spielen aber keine Rolle bei der Virulenz von Pilzen. Pilz. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]

27. Zhao, S.; Shang, X.; Bi, W.; Yu, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Wang, X.; Wang, X. Genomweite Identifizierung von Effektorkandidaten mit konservierten Motiven aus dem Weizenblattrostpilz Puccinia triticina. Vorderseite. Mikrobiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]

28. Gong, A.; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q.; Wang, G.; Liu, W. Bioinformatische Analyse und funktionelle Charakterisierung der CFEM-Proteine ​​im Mais-Anthracnose-Pilz Colletotrichum graminicola. J. Integr. Landwirtschaft. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]

29. Martin, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; et al. Das Genom von Laccaria bicolor gibt Einblicke in die Mykorrhiza-Symbiose. Nature 2008, 452, 88–92. [CrossRef]

30. Stefan, V.; Lara, RJ Entomopathogene Pilze als Endophyten: Wechselwirkungen zwischen Pflanzen, Endophyten und Pflanzenfressern und Aussichten für den Einsatz in der biologischen Kontrolle. Curr. Wissenschaft. 2015, 109, 46–54.

31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X.; Tu, X.; Zhang, Z.; Wang, G. Bioinformatische Analyse und funktionelle Charakterisierung der CFEM-Proteine ​​von Metarhizium anisopliae. J. Pilze. 2022, 8, 661. [CrossRef]

32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; und Kanyuka, K. WAKsing pflanzliche Immunität, schwindende Krankheiten. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]

33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z.; Zou, CG Systematische Analysen enthüllen die Einzigartigkeit und den Ursprung der CFEM-Domäne in Pilzen. Wissenschaft. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]

34. Fang, A.; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Zhou, S.; Cui, F.; Sun, W. Ein neuartiges Effektorgen SCRE2 trägt zur vollständigen Virulenz von Ustilaginoidea virens gegenüber Reis bei. Vorderseite. Mikrobiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]

35. Zhu, W.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, Vorderseite. Mikrobiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]

36. Xu, X.; Li, G.; Kleine.; Su, Z.; Chen, C. Genomweite vergleichende Analyse mutmaßlicher Pth11--verwandter G-Protein-gekoppelter Rezeptoren in Pilzen, die zu Pezizomycotina gehören. BMC Mikrobiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]

37. Peng, YJ; Hou, J.; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH Systematische Beiträge von CFEM-Domänen enthaltenden Proteinen zur Eisenaufnahme sind für die Interspezies-Interaktion des filamentösen pathogenen Pilzes Beauveria bassiana von wesentlicher Bedeutung. Umgebung. Mikrobiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]

38. Roy, U.; Kornitzer, D. Häm-Eisen-Erwerb in Pilzen. Curr. Meinung. Mikrobiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]

39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, ein Mitglied der Rbt5-Proteinfamilie, ist an der Nutzung von Eisen aus menschlichem Hämoglobin während des Hyphenwachstums von Candida albicans beteiligt. FEMS Heferes. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]

40. Perez, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Casanova, M.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Biofilmbildung durch Candida albicans-Mutanten für Gene, die Pilzproteine ​​kodieren, die die CFEM-Domäne mit acht Cysteinen aufweisen. FEMS Heferes. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]

41. Hogg, PJ Disulfidbindungen als Schalter für die Proteinfunktion. Trends Biochem. Wissenschaft. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]

42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R.; Woestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Mutanten von AVR4 des Tomatenpathogens Cladosporium fulvum mit unterbrochener Disulfidbindung sind empfindlich gegenüber Proteolyse, umgehen die Cf-4--vermittelte Resistenz, behalten aber ihre Fähigkeit zur Chitinbindung. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Zhang, J.; Xia, F.; Schlüssel.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; et al. Verbesserung mehrerer agronomischer Merkmale durch ein Krankheitsresistenzgen durch Zellwandverstärkung. Nat. Plants 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]

44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; et al. Eine groß angelegte Genstörung in Magnaporthe oryzae identifiziert MC69, ein sekretiertes Protein, das für die Infektion durch einkeimblättrige und zweikeimblättrige Pilzpathogene erforderlich ist. PLoS Pathog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]

45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. Eine acht Cystein enthaltende CFEM-Domäne, die einzigartig für eine Gruppe von Pilzmembranproteinen ist. Trends Biochem. Wissenschaft. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Peng, J.; Wu, L.; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q.; Wang, X.; Li, X.; Yan, J. Systemische Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von in Pilzen vorkommenden extrazellulären Membranproteinen in Lasiodiplodia theobromae. Vorderseite. Pflanzenwissenschaft. 2021, 12, 804696. [CrossRef]

47. Bari, R.; Jones, JD Rolle von Pflanzenhormonen bei pflanzlichen Abwehrreaktionen. Pflanzenmol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]

48. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP Pflanzenhormonvermittelte Regulierung von Stressreaktionen. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]

49. Javed, K.; Qiu, D. Der Proteinauslöser PeBL1 von Brevibacillus laterosporus erhöht die Resistenz gegen Myzus persicae in Tomaten. Krankheitserreger 2020, 9, 57. [CrossRef]

50. Basit, A.; Hanan, A.; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Molekulare und funktionelle Charakterisierung des aus Botrytis cinerea extrahierten Auslösers PeBC1, der an der Induktion der Resistenz gegen grüne Pfirsichblattlaus (Myzus persicae) in gewöhnlichen Bohnen (Phaseolus vulgaris L.) beteiligt ist. Insekten 2019, 10, 35. [CrossRef]

51. Nazir, T.; Hanan, A.; Basit, A.; Majeed, MZ; Anwar, T.; Nawaz, I.; Qiu, D. Mutmaßliche Rolle eines noch nicht charakterisierten Proteinauslösers PeBb1 Abgeleitet von Beauveria bassiana ARSEF 2860 Stamm gegen Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) in Brassica rapa ssp. pekinensis. Krankheitserreger 2020, 9, 111. [CrossRef]

52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Müller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Brown, R.; Kazan, K.; et al. NPR1 moduliert die Wechselwirkung zwischen Salicylat- und Jasmonat-abhängigen Abwehrwegen durch eine neuartige Funktion im Zytosol. Plant Cell 2003, 15, 760–770. [CrossRef]

53. Xin, XF; Er, SY Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000: Ein Modellpathogen zur Untersuchung der Krankheitsanfälligkeit und der Hormonsignalisierung in Pflanzen. Annu. Rev. Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]

54. Zhang, X.; Wang, C.; Zhang, Y.; Sonnig.; Mou, Z. Die Untereinheit des Arabidopsis-Mediatorkomplexes16 reguliert positiv die durch Salicylat vermittelte systemische erworbene Resistenz und die durch Jasmonat/Ethylen induzierten Abwehrwege. Plant Cell 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]

55. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Conconi, A.; Ryan, CA Salicylsäure hemmt die durch Systemin und Jasmonsäure induzierte Synthese von Proteinaseinhibitoren in Tomatenblättern. Pflanzenphysiologie. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]

56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC Vernetzung durch niedermolekulare Hormone in der pflanzlichen Immunität. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]

57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Die gleichzeitige Aktivierung von Jasmonat- und Ethylen-Reaktionswegen ist für die Induktion eines pflanzlichen Defensin-Gens in Arabidopsis erforderlich. Plant Cell 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]

58. Fang, W.; Bidochka, MJ Expression von Genen, die an der Keimung, Konidiogenese und Pathogenese in Metarhizium anisopliae beteiligt sind, mittels quantitativer Echtzeit-RT-PCR. Mykol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]

59. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Alfalfa-Cellulose-Synthase-Genexpression unter abiotischem Stress: Ein Leitfaden für Per Anhalter zur RT-qPCR-Normalisierung. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]

60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong Y.; Qiu, D. Eine Verticillium dahliae-Pektatlyase induziert pflanzliche Immunantworten und trägt zur Virulenz bei. Vorderseite. Pflanzenwissenschaft. 2018, 9, 1271. [CrossRef]

61. Livak, KJ; Schmittgen, TD Analyse relativer Genexpressionsdaten mittels quantitativer Echtzeit-PCR und der 2(-Delta Delta C(T))-Methode. Methoden 2001, 25, 402–408. [CrossRef]