Der aktuelle Stand der Neuroprotektion bei angeborenen Herzfehlern Teil 2

Die mikroskopischen Bilder wurden dann einer Bildberechnung mit der ImageJ-Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) unterzogen. Das Signal von Hsp60 wurde mit „x“ multipliziert.

Hsp60 ist ein wichtiges Proteinmolekül, das im menschlichen Körper eine wichtige biologische Rolle spielt. Untersuchungen der letzten Jahre haben gezeigt, dass das Vorhandensein von Hsp60 eng mit dem menschlichen Gedächtnis zusammenhängt.

Hsp60 ist ein molekulares Chaperon-Protein, das hauptsächlich an der Faltung, Entfaltung, Stabilisierung und dem Abbau von Proteinen beteiligt ist. Diese Prozesse sind für den normalen Stoffwechsel und die Zellfunktion des menschlichen Körpers sehr wichtig. Gleichzeitig hat Hsp60 auch antioxidative, entzündungshemmende und immunmodulatorische Wirkungen und spielt eine große Rolle bei der Erhaltung der menschlichen Gesundheit und dem Gleichgewicht des Immunsystems.

Untersuchungen haben ergeben, dass Hsp60 eine entscheidende Rolle bei der Bildung und Aufrechterhaltung des Gedächtnisses spielt. Während des Lern- und Gedächtnisprozesses produzieren Gehirnzellen eine große Anzahl von Hsp60-Molekülen. Diese Moleküle können Zellen vor Störungen und Schäden durch die äußere Umgebung schützen und so einen reibungslosen Lern- und Gedächtnisfortschritt gewährleisten. Darüber hinaus kann Hsp60 auch das menschliche Denken und Verhalten beeinflussen, indem es die Signalübertragung von Gehirnzellen und die Entwicklung von Neuronen verändert und sich positiv auf die Kognition und Stressresistenz auswirkt.

Obwohl die Rolle von Hsp60 positive Auswirkungen auf den menschlichen Körper gezeigt hat, müssen sich die Menschen auch darüber im Klaren sein, dass sowohl ein Überschuss als auch ein Mangel an Hsp60 negative Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben können. Daher sollten wir den Mechanismus von Hsp60 bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Zuständen des menschlichen Körpers aktiv erforschen und untersuchen, um die Position und Rolle von Hsp60 für die menschliche Gesundheit besser zu verstehen. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche deserticola kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche deserticola antioxidative, entzündungshemmende und Anti-Aging-Wirkungen hat, die dazu beitragen können, Oxidations- und Entzündungsreaktionen im Gehirn zu reduzieren und so das Gehirn zu schützen Gesundheit des Nervensystems. Darüber hinaus kann Cistanche deserticola auch das Wachstum und die Reparatur von Nervenzellen fördern und dadurch die Konnektivität und Funktion neuronaler Netzwerke verbessern. Diese Effekte können dazu beitragen, das Gedächtnis, die Lernfähigkeit und die Denkgeschwindigkeit zu verbessern und können auch die Entwicklung kognitiver Dysfunktionen und neurodegenerativer Erkrankungen verhindern.

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Der „x“-Wert wurde wie folgt bestimmt: Durch Subtrahieren des „x“-gefalteten Hsp60-Signals vom mitochondrialen DNA-Signal in der Kontrollgruppe wurde der mitochondriale DNA-Wert kleiner oder gleich Null. Das Signal des Histons H2B wurde mit „y“ multipliziert.

Der „y“-Wert wurde wie folgt bestimmt: Durch Subtrahieren des „y“-gefalteten Histon-H2B-Signals vom Kern-DNA-Signal in der Kontrollgruppe wurde der Kern-DNA-Wert kleiner oder gleich Null. Wenn das Hintergrundsignal durch die Multiplikation hoch wird, kann der Kontrast des multiplizierten Bildes für die gleichen Bedingungen in allen Proben angepasst werden.

Das Bild der dsDNA-Färbung abzüglich des angepassten Bildes von multipliziertem Hsp60 und Histon H2B wurde für die anschließende Analyse verwendet. Mithilfe der Funktion „Adjust-Threshold“ wurden diese Bilder binarisiert. Wir haben dsDNA-Punkte mit einer Größe von 2 bis 20 µm2 (Rundheit 0,1–1,0) ausgewählt und sie wurden mit der Funktion „Partikel analysieren-analysieren“ gezählt.

2.3. Elektronenmikroskopie

Einen Tag vor der Transfektion wurden HeLa-Zellen mit einer Dichte von 600 Zellen/µL ausplattiert. Die Expression von Genen von Interesse wurde in HeLa-Zellen unter Verwendung von Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) in Lipofectamine RNAiMAX Transfektionsreagenz (ThermoFisher Scientific) gemäß der Richtlinie zum Schweigen gebracht Herstellerangaben (mit einer RNA-Endkonzentration von 10 nM).

Vier Tage nach dem siRNA-Knockdown wurden die Zellen einer Fixierung unterzogen. Zellkulturproben wurden mit 2 % PFA und 2 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, bei 37 °C fixiert und dann in einen 4 ◦C Kühlschrank für 30 Min. Die Proben wurden über Nacht bei 4 °C in 2 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer fixiert. Die Proben wurden dreimal mit 0,1 M Phosphatpuffer 30 Minuten lang gewaschen und mit 2 % Osmiumtetroxid in 0,1 M Phosphatpuffer 1 Stunde lang bei 4 °C nachfixiert.

Bei den Proben handelte es sich um dehydrierte, abgestufte Ethanollösungen, die auf Harz (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokio, Japan) übertragen und 48 Stunden lang bei 60 °C polymerisiert wurden. Die polymerisierten Harze wurden mit einem Diamantmesser unter Verwendung eines Ultramikrotoms (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) in ultradünne 70-nm-Schnitte geschnitten und dann auf Kupfergittern montiert.

Die Schnitte wurden 15 Minuten lang bei RT mit 2 % Uranylacetat gefärbt und mit destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von einer Sekundärfärbung mit einer Bleifärbelösung (Sigma-Aldrich, Tokio, Japan) 3 Minuten lang bei RT.

Die Gitter wurden unter einem Transmissionselektronenmikroskop (JEM-1400Plus, JEOL Ltd. beobachtet., Tokio, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV (Zebrafischgehirn) oder 100 kV (Zelle), und die Bilder wurden mit einer CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) aufgenommen. .

2.4. Immunelektronenmikroskopie

Die Proben auf den Goldscheiben wurden in flüssigem Propan bei −175 ◦C eingefroren. Nachdem die Proben eingefroren waren, wurden sie 24 Stunden lang bei –80 °C mit 1 % Gerbsäure in Ethanol und 2 % destilliertem Wasser eingefroren.

Die Proben wurden dann 4 Stunden lang bei –20 °C gehalten und anschließend 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proben dreimal 30 Minuten lang in wasserfreiem Ethanol dehydriert. jedes Mal, gefolgt von einer 1-stündigen Infiltration mit einer 50:50-Mischung aus Ethanol und Harz (LR weiß: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) bei 4 °C. Die Proben wurden auf frisches 100 %-Harz übertragen und 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt.

Die Proben wurden auf frisches 100 %iges Harz übertragen und bei 50 °C CO/N polymerisiert. Die polymerisierten Harze wurden mit einem Diamantmesser unter Verwendung eines Ultramikrotoms (Ultracut UCT; Leica) bei 90 nm ultradünn geschnitten und die Schnitte auf Nickelgitter gelegt. Die Gitter wurden mit Anti-dsDNA-Antikörper (35I9-DNA) (1/800, Abcam, Kat.-Nr. ab27156, RRID: AB_470907) in 1 % BSA/PBS bei 4 °C CO/N inkubiert, gefolgt von drei Spülungen mit 1 % BSA/PBS für jeweils 1 Minute.

Anschließend wurden sie mit dem Sekundärantikörper, der an {{0}}nm Goldpartikel (polyklonaler Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper) konjugiert war, 2 Stunden lang bei RT inkubiert. Nach dem Spülen mit PBS wurden die Gitter in 2 % Glutaraldehyd und 0,1 M Cacodylatpuffer gelegt.

Anschließend wurden die Gitter getrocknet und dann 15 Minuten lang mit 2 % Uranylacetat und 3 Minuten lang mit einer Bleifärbelösung (Sigma-Aldrich) bei RT gefärbt. Die Gitter wurden durch ein Transmissionselektronenmikroskop (JEM-1400) beobachtet. plus; JEOLLtd.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV. Digitale Bilder wurden mit einer CCD-Kamera (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) aufgenommen.

3. Ergebnisse

3.1. Vermindertes TFAM oder GBA induziert einen Anstieg der ektopischen mitochondrialen DNA

Zunächst zeigten wir ein Beispiel für den Nachweis von mitochondrialer zytoplasmatischer DNA in HeLa-Zellen, in denen das TFAM-Protein durch siRNA abgebaut wurde (Abbildung 1A). TFAM ist ein wichtiger mitochondrialer Transkriptionsfaktor und fungiert auch bei der Replikation und Reparatur mitochondrialer DNA [20]. .

Es wird berichtet, dass Sequenzpolymorphismen in diesem Gen mit der Parkinson-Krankheit assoziiert sind [21,22]. Nach drei Tagen TFAM-Protein-Knockdown wurden viele doppelsträngige DNA-Punkte im Zytoplasma der HeLa-Zellen nachgewiesen.

Histone sind positive Marker für DNA nuklearen Ursprungs im Zytoplasma und negative Marker für mitochondriale DNA und DNA mitochondrialen Ursprungs im Zytoplasma [23]. Diese Punkte waren nicht gemeinsam mit Histonen lokalisiert, was darauf hindeutet, dass es sich nicht um DNA aus dem Kern handelte. Darüber hinaus waren einige dieser zytoplasmatischen, ektopischen DNA-Punkte nicht gemeinsam mit Hsp60 lokalisiert, einem Marker für die mitochondriale Matrix, was darauf hindeutet, dass sie sich außerhalb der Mitochondrien befanden (Abbildung 1B, C).

Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten außerdem, dass die ektopische DNA aus den Mitochondrien austrat (Abbildung 2A, B). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Anstieg ektopischer DNA-Punkte im Zytoplasma durch TFAM-Knockdown darauf zurückzuführen war, dass mitochondriale DNA aus den Mitochondrien austrat. Zweitens zeigten wir ein weiteres Beispiel für den Nachweis von aus Mitochondrien stammender zytoplasmatischer DNA in HeLa-Zellen, in denen GBA-Protein durch siRNA abgebaut wurde (Abbildung 1A).

GBA ist das ursächliche Gen für die Gaucher-Krankheit, aber eine heterozygote Mutation von GBA ist auch ein Risikofaktor für die Parkinson-Krankheit [24]. Nach 3 Tagen GBA-Protein-Knockdown wurden im Zytoplasma der HeLa-Zellen viele doppelsträngige DNA-Punkte nachgewiesen. Einige DNA-Punkte waren zusammen mit Histones lokalisiert, was darauf hindeutet, dass es sich um aus dem Zellkern stammende DNA handelte.

Andere DNA-Punkte waren nicht mit Histone kolokalisiert, was darauf hindeutet, dass es sich nicht um aus dem Kern stammende DNA, sondern um aus Mitochondrien stammende DNA handelte (Abbildung 1D). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Zunahme ektopischer DNA-Punkte im Zytoplasma durch GBA-Knockdown zumindest teilweise auf das Austreten mitochondrialer DNA aus den Mitochondrien zurückzuführen war.

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