Abstrakt:Das Hauptziel der vorliegenden Studie besteht darin, durch Differentialanalyse verschiedene biologische Aktivitäten des Gesamtphenolgehalts in alkoholischen Extrakten von drei Dattelpalmensorten abzuschätzen, die gegenüber Fusarium oxysporum empfindlich oder resistent sind. sp Albidinis. Hier wurden Stilbenprodukte mit antioxidativen und bioaktiven Eigenschaften in der resistenten Sorte Taabdount (TAAR) nachgewiesen. Darüber hinaus enthält die methanolische Fraktion der TAAR-resistenten Dattelpalmensorte ein signifikantes Produkt, bestimmt durch LCMS/MS und 1H, 13C NMR, das zur Familie der Hydroxystilbene gehört, antioxidative Eigenschaften aufweist, die Tyrosinaseaktivität des Pilzes hemmt und aktiviert und übt eine schützende Wirkung auf Hypochlorit-induzierte Schäden im 20S-Proteasom menschlicher dermaler Fibroblastenzellen aus. Insgesamt deuten die vorliegenden Ergebnisse darauf hin, dass das in resistenten Phoenix dactylifera L. vorhandene Hydroxytoluol untersucht werden sollte, um zu verstehen, wie das Stilben eine Anti-Aging-Fähigkeit entfalten könnte.

Glykosid von Cistanche kann auch die SOD-Aktivität im Herz- und Lebergewebe erhöhen und den Gehalt an Lipofuscin und MDA in jedem Gewebe erheblich reduzieren, wodurch verschiedene reaktive Sauerstoffradikale (OH-, H₂O₂ usw.) effektiv abgefangen und vor verursachten DNA-Schäden geschützt werden durch OH-Radikale. Cistanche-Phenylethanoidglykoside haben eine starke Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, eine höhere Reduktionsfähigkeit als Vitamin C, verbessern die Aktivität von SOD in der Spermiensuspension, reduzieren den MDA-Gehalt und haben eine gewisse schützende Wirkung auf die Funktion der Spermienmembran. Cistanche-Polysaccharide können die durch D-Galaktose verursachte Aktivität von SOD und GSH-Px in Erythrozyten und Lungengewebe experimentell seneszierender Mäuse steigern, außerdem den Gehalt an MDA und Kollagen in Lunge und Plasma verringern und den Gehalt an Elastin erhöhen eine gute Abfangwirkung auf DPPH, verlängert die Zeit der Hypoxie bei seneszenten Mäusen, verbessert die Aktivität von SOD im Serum und verzögert die physiologische Degeneration der Lunge bei experimentell seneszenten Mäusen. Bei der zellulären morphologischen Degeneration haben Experimente gezeigt, dass Cistanche über eine gute antioxidative Fähigkeit verfügt und hat das Potenzial, ein Medikament zur Vorbeugung und Behandlung von Hautalterungskrankheiten zu sein. Gleichzeitig hat Echinacosid in Cistanche eine erhebliche Fähigkeit, freie DPPH-Radikale abzufangen, reaktive Sauerstoffspezies abzufangen und den durch freie Radikale verursachten Kollagenabbau zu verhindern, und hat auch eine gute Reparaturwirkung auf Schäden durch freie Thymin-Radikalanionen.

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Schlüsselwörter:Phoenix dactylifera L.; Fusarium oxysporum. sp Albidinis (FoA); antioxidative Aktivitäten; Anti-Tyrosinase-Aktivität; Proteasom-Aktivierung; LC-MS/MS-Analyse; Stilben-Derivate

1. Einleitung

Die Dattelpalme (Phoenix dactylifera L.) ist eine mehrjährige einkeimblättrige Pflanze aus der Familie der Arecaceae. Dieser Baum ist sowohl wirtschaftlich als auch sozial von größter Bedeutung für das Leben der Sahara-Bevölkerung im Süden und Südosten Marokkos. Bayoud-Krankheit, die durch den Bodenpilz Fusarium oxysporum f. verursacht wird. sp Albidinis (FoA) [1] hat den Ertrag marokkanischer Dattelpalmen in den letzten Jahren erheblich reduziert [2]. Es wird geschätzt, dass FoA aus zwei Dritteln des marokkanischen Phoenicicole-Erbes verschwunden ist, aber weiterhin zwischen 4,5 und 12 Prozent der hochwertigsten kommerziellen Dattelpalmensorten zerstört [2]. Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um diese Krankheit zu bekämpfen und einige Abwehrmechanismen der Dattelpalme aufzuklären [3]. Die ersten Studien zu den möglichen Abwehrmechanismen der Dattelpalme haben die Rolle von Phenolverbindungen und der antioxidativen Kapazität bei der FoA-Toleranz hervorgehoben [4,5]. Die biochemische Analyse resistenter und empfindlicher Wurzelsorten mit Phenolverbindungen war die erste biochemische Studie, die den Nutzen der Abwehrmechanismen der Dattelpalme aufklärte. Tatsächlich weist die Literatur darauf hin, dass Sorten mit resistenten Wurzeln reicher an 5-Caffeoylshikimisäure und ihren Positionsisomeren sind als Sorten mit empfindlichen Wurzeln [5]. Diese Verbindungen haben in vitro eine potenzielle antimykotische Wirkung gegen FoA gezeigt [6].

Die große Fähigkeit natürlicher Antioxidantien, freie Radikale abzufangen, ist der Grund für ihre steigende Beliebtheit in Lebensmittel- und medizinischen Studien [7–10].

Beispielsweise sind reaktive Sauerstoffspezies erschwerende Faktoren bei Zellschäden und Alterungsprozessen [11] und werden daher mit vielen Krankheiten in Verbindung gebracht. Infolgedessen können antioxidative Moleküle die menschliche Gesundheit unterstützen, indem sie degenerativen Erkrankungen vorbeugen und die Folgen des Alterns verlangsamen [12]. In dieser Studie interessieren wir uns für die Fähigkeit von Antioxidantien, die Aktivierung des 20S-Proteasoms zu fördern und es vor oxidativen Schäden zu schützen. Das Proteasom trägt tatsächlich zur Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase bei, indem es den Prozess der Zelle zur Beseitigung beschädigter Proteine ​​und die kontrollierte Zerstörung kurzlebiger Proteine ​​ermöglicht [13]. Daher könnte sich die Aktivierung des Proteasoms mit Antioxidantien als neue Anti-Aging-Strategie erweisen [14]. Darüber hinaus soll in dieser Arbeit das Potenzial des Phenolgehalts resistenter Wurzeln gegenüber FoA als aktive biologische Verbindungen untersucht werden.

2. Materialien und Methoden

2.1. Pflanzenprobe

Die Studie wurde für jede Probe mit Material von 10 ausgewachsenen Dattelpalmensorten (Phoenix dactylifera L.) durchgeführt, die entweder auf kontaminierten oder nicht kontaminierten Parzellen im Palmaria Figuig im Südosten Marokkos angebaut wurden. Die Hauptwurzeln (einschließlich ihrer luftatmenden Wurzeln) haben einen Durchmesser von 0,5 bis 2 cm bei anfälligen Sorten, wie z. B. infizierten Charas Bouffegous (BI) oder nicht infizierten (BNI). Darüber hinaus wurde die FoA-resistente Sorte Taabdount (TAAR) gesammelt und die Blätter zweier Heilpflanzen vor Ort als phylaktische Behandlung gegen FoA eingesetzt. Darüber hinaus wurden auch Rosmarin (R, Rosmarinus officinalis) und Granatapfel (G, Punica granatum L.) [15] auf derselben nicht kontaminierten Parzelle gesammelt, analysiert und als Kontrolle verwendet. Die Proben wurden in zwei Perioden im Jahr, im September und Ende Januar (zwischen 2013 und 2015), entnommen und hermetisch bei Raumtemperatur gelagert. Da die Proben von einem Palmenbauer stammen, sind sie vom marokkanischen Landwirtschaftsminister ordnungsgemäß zertifiziert (Identifizierung und Klassifizierung) [16].

2.2. Vorbereitung der Extrakte

Nach ausgiebigem Waschen mit Wasser wurden die Wurzeln bzw. Blätter im Schatten getrocknet und anschließend in einem Mixer zerkleinert. Für jede Probe (BI, BNI, TAAR, R und G) wurden 10 ml Methanol zu 1 g trockenem Material gegeben und dann 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden sie filtriert und bei 37 °C im Rotationsverdampfer eingedampft. Der Trockenextrakt wurde in eine Methanollösung mit einer Endkonzentration von 10 mg/ml oder 50 mg/ml gegeben (später zur Bestimmung biologischer Aktivitäten in vitro verwendet). Für die biologischen Aktivitätstests wurden für jede Probe drei unabhängige Extraktionen durchgeführt.

2.3. Biologische Aktivitäten

2.3.1. Phenolgehalt und antioxidative Aktivitäten

Das von Nacoulma et al. beschriebene Verfahren. wurde angewendet, um den gesamten Phenol- und Flavonoidgehalt jedes Extrakts zu bewerten [17], mit einer abschließenden Volumenanpassung bei 200 µL zur Verwendung auf einem Mikroplatten-Lesegerät. Die Absorption bei 76 0 nm bzw. 51 0 nm wurde gegen einen Methanol-Blindwert bestimmt. Standardkalibrierungskurven von Gallussäure (0–300 mg/L) (y=0.0083x plus 0,9106, r2=0.978) und Quercetin (0–100 mg/L) (y {{14 }}.0008x plus 0.0597 bzw. r2=0.994) wurden verwendet.

Unter Verwendung des freien Radikals 1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl wurde die antioxidative Abfangaktivität (DPPH) untersucht. Unter Verwendung einer abschließenden Anpassung der Volumina bei 300 µL bzw. 275 µL zur Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts wurde die Fähigkeit der Extrakte zur Verringerung von Eisen (III) bewertet, wie von Nacoulma et al. beschrieben. [17]. Im Vergleich zu einem Methanol-Blindwert wurde die Extinktion bei 517 nm bzw. 700 nm gemessen. Dann wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung die freie Radikale abfangende Aktivität jeder Lösung als Prozentsatz der Hemmung geschätzt:

Eine Standardkalibrierungskurve wurde unter Verwendung von Ascorbinsäure ({{0}}–100 mg/L) als Antioxidansstandard (y=0.0014x plus 0.0875, r2=0.998) erstellt.

2.3.2. FoAMyc-Helium-Wachstumshemmtest

Mit einer kleinen Modifikation kann die von Neri et al. [18] wurde verwendet, um den Grad zu bestimmen, in dem reine Chemikalien das FoA-Myzelwachstum hemmten. Bei einer 7- Tage alten FoA-Kultur wurden fünf Millimeter Myzelscheiben auf Petrischalen mit PDA-Medium platziert, das mit den oben aufgeführten reinen Chemikalien in einer Konzentration von 50, 75 und 100 µg/ml ergänzt war. Die Platten wurden 5 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Der durchschnittliche Durchmesser der Kolonie, gemessen in zwei rechten Winkeln, wurde zur Beurteilung der Hemmung des FoA-Myzelwachstums verwendet. Jede Behandlung bestand aus drei Tests mit drei verschiedenen FoA-Stämmen: FoA 41818, FoA 41814 (BCCM, Belgien) und FoA Local (Palemeraie of Figuig, Marokko) sowie einer Negativkontrolle unter Verwendung eines nicht zugesetzten Mediums.

2.3.3. Zelllebensfähigkeit und 20S-Proteasom-Aktivität

Es wurden normale menschliche Hautfibroblasten eines {{0}}jährigen Mannes (NHDF) (Promocell, Heidelberg, Deutschland) verwendet, wobei die Zellen in einer Dichte von 100,{{3 platziert wurden }} Zellen/ml in RPMI 10 Prozent, ergänzt mit 10 Prozent (Gew./Vol.) FBS, 1 Prozent (Gew./Vol.) L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin. Sie wurden in weißen oder transparenten 96-Mikrotiterplatten 24 Stunden lang bei 37 °C in einem Inkubator mit einer feuchten Umgebung von 5 Prozent CO2 aufbewahrt. Für den Proteasom-Aktivitätstest sowie zur Bewertung der Schutzwirkung auf Hypochlorit-induzierte Schäden wurden die Zellen dann mit Testmaterialien behandelt (eine reine Verbindung mit 5 bis 50 µg/ml, eine Positivkontrolle mit 0,5 und/oder 1 µM, und methanolische Pflanzenextrakte von 15 bis 50 µg/mL) für 24 h mit maximal 0,3 Prozent DMSO in der Endkonzentration, gleichzeitig, ohne Veränderungen gegenüber der Negativkontrolle. Die Untersuchung der schützenden Wirkung von TAAR-Extrakt oder reinen Verbindungen auf die Proteasomaktivität führte dazu, dass Fibroblastenzellen später 35 Minuten lang 50 µM OCl− ausgesetzt wurden (ausgewählt als optimal, ohne Zelltoxizität, Oxidationsmittel-Inhibitor des 20S-Proteasom-Zustands) [19]. Die folgenden Versuchsstufen wurden mit der Methodik des Anbieters abgeschlossen (Proteasome-Glo Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay, Promega Corporation, USA): Erstens ein gleichzeitiges Experiment zur Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung von Kristallviolett-Kolorimetrie- oder MTT-Assays, die unter völlig ähnlichen Bedingungen durchgeführt wurden wurde verwendet, um diesen Zell-Biolumineszenz-Assay zu normalisieren. Die Standardabweichungen und die durchschnittliche Fluoreszenz in dreifachen Proben aus zwei separaten Tests (n=6) werden angezeigt. Alle Messungen und unabhängigen Experimente (n=2) wurden zweimal durchgeführt.

2.3.4. Hemmende Wirkung auf die zellfreie Pilztyrosinase

Um den Einfluss auf die Enzymaktivität zu untersuchen, wurden die Testmaterialien (reine Antioxidantien oder methanolische Pflanzenextrakte) mit Enzymen in Phosphatpuffer bei Raumtemperatur vorinkubiert. Kurz gesagt, 300 ml einer 5 mM L-DOPA-Lösung mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) mit oder ohne Testmaterialien in verschiedenen Konzentrationen wurden zu a gegeben 96-Well-Mikrotiterplatte zusammen mit 100 ml einer wässrigen Lösung von Pilztyrosinase (20 Einheiten). Die Testmischung wurde 40 Minuten lang bei 25 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Dopachrom-Produktionsgrad der Reaktionsmischung spektrophotometrisch bei 492 nm gemessen [20]. Eine Standardkalibrierungskurve wurde mit Gallussäure (0–1000 µg/ml) erstellt (y=−0,087 × plus 0,45; r2=0,97). Jede unabhängige Messung und jedes unabhängige Experiment (n=2) wurde zweimal durchgeführt.

2.4. Analyse-, Isolierungs- und Strukturaufklärungsverfahren

Die gemahlene Wurzel (20 g) wurde mit 200 ml Methanol extrahiert, 24 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt, filtriert, 15 Minuten lang bei 10,000× g zentrifugiert und dann bei 35 °C unter Verwendung eines Rotationskolbens eingedampft Vakuumverdampfungsgerät. Der Rohextrakt wurde mit 20 ml destilliertem Wasser verdünnt, mit 2 × 20 ml Ethylacetat erneut extrahiert und dann unter Verwendung eines Rotationsvakuumverdampfungssystems bei 35 °C konzentriert. Das Hauptprodukt wurde durch präparative HPLC unter Verwendung einer Waters C18-Säule (SymmetryPrep 150 × 19 mm, 7 µm Partikelgröße) mit den gleichen LC-Gradientenbedingungen wie oben und einer Flussrate von 5 ml/min gereinigt. Der Peak bei RT lag zwischen 38,8 und 40,8 Minuten und wurde zwischen 39,2 und 40,2 Minuten gesammelt; Das Gesamtvolumen der Sammlung wurde lyophilisiert, um 27 mg der Verbindung zu ergeben. MS und NMR 1H und 13C identifizierten es dann.

Die Analysen wurden mit einem System der Serie LC 1200 mit schneller Auflösung unter Verwendung eines Diodenarray-Detektors (DAD) durchgeführt, der zur Überwachung von UV-Spektren bei 320 nm verwendet wurde (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Die Verbindungstrennung wurde auf einer Beckman C18-Säule (ULTRASPHERE 250 mm × 4,6 mm, 5 µm Partikelgröße) unter Verwendung eines 47-minütigen Gradienten von 10 mM Ammoniumacetat/0,2 Prozent Ameisensäure in Wasser (v/v), pH 2,9 ({{ 13}}Lösungsmittel A) und 30/70 Acetonitril/Methanol-Mischung (=Lösungsmittel B). Die Flussrate betrug 0,8 ml/min, und Lösungsmittel B wurde in 45 Minuten von 5 auf 35 Prozent erhöht und 2 Minuten lang wieder ins Gleichgewicht gebracht. In einer Serie mit DAD wurde eine ESI-QTOF 6520-Serie (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) für hochauflösende MS- und gezielte Tandem-MS-Analysen (MS/MS) verwendet. Die Spektren wurden im negativen und hochauflösenden (4 GHz) Aufnahmemodus aufgenommen.

1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren wurden mit einem Bruker Avance 300-Spektrometer bei 300 MHz aufgezeichnet. Freie Induktionszerfälle wurden mit der NMR-Suite MestreNova 5.3.2 von MestreLab Research SL verarbeitet.

2.5. Statistische Analyse

Alle unabhängigen Experimente wurden dreifach durchgeführt. Alle Daten wurden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Mit Version 6 des Programms GraphPad Prism wurden die Ergebnisse mithilfe des nichtparametrischen Kruskal-Wallis-Tests zusammen mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunn analysiert. p-Werte 0.05 und niedriger werden als signifikant angesehen.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Gesamtphenol- und Flavonoidgehalt methanolischer Extrakte

Aufgrund ihrer Redoxeigenschaften haben pflanzliche Phenolverbindungen vielfältige biologische Wirkungen, darunter auch eine antioxidative Wirkung [21]. Tabelle 1 zeigt den Gesamtphenolgehalt von Methanol-Wurzelextrakten (500 µg/ml) anfälliger Ghagras-Sorten, die mit FoA infiziert (BI) und nicht infiziert (BNI) oder resistent wie Taabdount (TAAR) sind. Ihre Konzentration schwankte zwischen 171 ± 14 und 253 ± 47 mg Gallussäureäquivalent/g. Die höchste Menge dieser Verbindungen wurde in der BNI-Sorte gefunden, während die niedrigste Konzentration im Methanolwurzelextrakt von BI auftrat. Die Anzahl der Flavonoide in denselben Extrakten (Tabelle 1) schwankte zwischen 240 ± 25 und 406 ± 66 mg Quercetin-Äquivalent/g, und auch hier wurde die höchste Menge der Sorte BNI zugeschrieben. Es kommt zu einem Verlust von etwa 1/3 der Gesamtmenge an Polyphenolen und Flavonoiden zwischen nicht infizierten (BNI) Sorten und infizierten (BI) oder resistenten (TAAR) Sorten gegenüber der FoA. Daher ist es wichtig zu prüfen, wie sich der Verlust von Verbindungen, die als entscheidend für die antioxidative Kapazität der Pflanze gelten, auf die biologischen Aktivitäten auswirken kann, an denen wir interessiert sind.

3.2. Antioxidatives Potenzial methanolischer Extrakte

Die DPPH-Radikalfängeraktivität ist eine Methode, die häufig zum Screening der antioxidativen Aktivität von Pflanzenextrakten eingesetzt wird [22]. Dieser Test bestimmt, ob die in den Extrakten enthaltenen antioxidativen Chemikalien in der Lage sind, die stabile Radikalspezies DPPH abzufangen. Die experimentellen Daten (Abbildung 1) zeigen, dass alle methanolischen Extrakte (bei 100 oder 500 µg/ml) wahrscheinlich die Wirkung haben, freie Radikale abzufangen, wobei die höchsten DPPH-Abfangaktivitäten in TAAR-Wurzeln beobachtet wurden (87,0). Prozent der DPPH-Hemmung). Die antioxidative Aktivität scheint nicht vom Vorhandensein der Gesamtmenge an Polyphenol- oder Flavonoidverbindungen abzuhängen. Die bessere Aktivität der methanolischen TAAR-Wurzelextrakte könnte jedoch darauf zurückzuführen sein, dass im Extrakt mehr wasserstoffspendende Komponenten enthalten sind.

Die Reduktionskraft wird anhand der Fähigkeit des methanolischen Extrakts bewertet, Fe (III) in Fe (II) umzuwandeln. Diese Fähigkeit, Fe(III) zu reduzieren, kann auf die Anzahl und Position der in Phenolverbindungen vorhandenen Hydroxylgruppen und deren Fähigkeit, Wasserstoff abzugeben, zurückgeführt werden [23]. Tabelle 2 zeigt die reduzierenden Aktivitäten methanolischer Extrakte unserer Pflanzenproben im Vergleich zu Ascorbinsäure als Standard. Methanolische Extrakte von TAAR-Wurzeln enthalten hohe Reduktionen (95 ± 1 mg Ascorbinsäure-Äquivalent/g), während der niedrigste Gehalt aus BNI-Wurzelextrakten (27 ± 2 mg Ascorbinsäure-Äquivalent/g) erhalten wurde.

Zur Korrelation der erhaltenen Ergebnisse wurde eine Regressionsanalyse durchgeführt (Korrelationskoeffizient (R)). Es wurden signifikante lineare Korrelationen zwischen dem Gesamtphenol- und Flavonoidgehalt (R {{0}}.849, p < 0.05) und zwischen DPPH und dem Reduktionskrafttest (R=0) gefunden. 816, p < 0,05), es gab jedoch keine Unterschiede zwischen den Phenol- oder Flavonoidgehalten der methanolischen Extrakte und ihren antioxidativen Aktivitäten. Schließlich zeigten alle methanolischen Extrakte signifikante antioxidative Aktivitäten gegen die DPPH-Radikalfängeraktivität und einen Reduktionskrafttest, diese antioxidativen Aktivitäten scheinen jedoch nicht mit dem Gesamtgehalt an Phenolen oder Flavonoiden in Zusammenhang zu stehen. Daher deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass höchstwahrscheinlich eine bestimmte Art von Chemikalie und nicht die Menge an Phenol- oder Flavonoidverbindungen, die in unseren verschiedenen Extrakten enthalten sind, für die antioxidative Aktivität der untersuchten Pflanzenextrakte verantwortlich ist. Einige zuvor beschriebene und hochaktive phenolische Komponenten können ebenfalls einen Einfluss auf die antioxidative Aktivität von Pflanzenextrakten haben: Unabhängig von ihrer Konzentration können die in gealtertem Rotwein enthaltenen phenolischen Verbindungen verschiedene antiradikale Eigenschaften aufweisen, die mit ihren strukturellen Aspekten zusammenhängen [ 24].

Die TAAR-FoA-resistente Sorte weist unter den verschiedenen Dattelpalmensorten die höchste antioxidative Aktivität auf. Der Literatur zufolge kann die Resistenzentwicklung bei diesen speziellen Dattelpalmen auf einen Anstieg der Menge verschiedener Stellungsisomere der Caffeoylshikimisäure zurückgeführt werden [5].

3.3. Pilz-Tyrosinase-Aktivität

Die Pilz-Tyrosinase-Diphenolase-Aktivität katalysiert die Oxidation von zwei Dopaquinon-Derivaten, was zur Melaninsynthese führt. Die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse zeigen die Fähigkeit von Verbindungen, die in methanolischen Extrakten von TAAR, BI und BNI vorhanden sind, die Hydroxylierung von l-DOPA durch Hemmung der Pilz-Tyrosinase-Aktivität zu stören. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass der methanolische Extrakt von TAAR statistisch gesehen aktiver auf die Pilztyrosinaseaktivität ist als Extrakte von BI (p < 0.05) und BNI (p < 0,05). Die Fähigkeit von Palmdattelwurzelextrakten, die Tyrosinaseaktivität zu hemmen, scheint also dem gleichen Trend zu folgen wie die antioxidativen Fähigkeiten.

Tyrosinasen werden hauptsächlich mit der Pigmentierung von Haut, Augen und Haaren in Verbindung gebracht. Tatsächlich handelt es sich bei Tyrosinasen um Melanogeneseenzyme, die an den ersten Schritten der Melaninbiosynthese beteiligt sind, und Melanin wird mit Schutz vor ultravioletter (UV), Sonnen- oder Gammastrahlung, einer verringerten zellulären Anfälligkeit und einer Zellwandresistenz gegen hydrolytische Enzyme in Verbindung gebracht [20]. Umgekehrt kann eine Überproduktion von Melanin bei Hautanomalien oder schwerwiegenderen Krankheiten wie Krebs (z. B. Melanom) eine Rolle spielen, und ein Dopaquinonüberschuss kann zu neurodegenerativen Erkrankungen (z. B. Parkinson-Krankheit) führen [20,25]. Darüber hinaus wurde berichtet, dass bei der Melanogenese Wasserstoffperoxid und andere ROS entstehen, wodurch menschliche Melanozyten einem hohen Maß an oxidativem Stress ausgesetzt werden [26]. Mehrere aus Pflanzen gewonnene natürliche Antioxidansverbindungen (Phenole, Flavonoide und andere) hemmten die Tyrosinase-Phenolase-Aktivität [27,28]. Hier scheint TAAR-Extrakt eine oder mehrere Verbindungen zu enthalten, die die Hautalterung und Melanogenese hemmen können.

3.4. Proteasomaktivität von methanolischen Dattelpalmenwurzelextrakten

Es wurde berichtet, dass erhöhte Werte des 20S-Proteasoms zu einer erhöhten Toleranz gegenüber oxidativem Stress führen [13]. Daher wurde die Regulierung der Proteasomaktivität durch Wurzelextrakte der Sorten BI, BNI und TAAR untersucht. Die gemessene 20S-Proteasomaktivität steht im Zusammenhang mit der Chymotrypsin-ähnlichen (CT-L) Aktivität in NHDF-gealterten Zellen (siehe Materialien und Methoden). Wie in Abbildung 2A dargestellt, zeigten Zellen, die 24 Stunden lang mit 50 µg/ml methanolischer Extrakte behandelt wurden, eine signifikante Aktivierung des CT-L für BI- und TAAR-Extrakte und eine Hemmung für BNI, ohne mehr als 30 Prozent Zelltoxizität zu erzeugen. TAAR-Wurzelextrakt zeigte im Vergleich zu 1 µM Liponsäure (Ct plus) eine ansprechende Proteasomaktivierung (212 Prozent bzw. 248 Prozent). Das Proteasom ist ein zylindrischer Proteinasekomplex mit einem Kern aus vier gestapelten Ringen, der für die Entfernung abnormal abgebauter (26S) Proteasom- und oxidativ (20S proteolytischer Kernkomplex) beschädigter Proteine ​​verantwortlich ist (Ciechanover, 1998). Wie in Hwangs Arbeit dargelegt [29], kann eine Proteasom-Dysfunktion zur Alterung der menschlichen Haut beitragen. Tatsächlich wurde gezeigt, dass alternde und replikative seneszierende Zellen eine verminderte Proteasomaktivität sowie die Proteinspiegel der Proteasomuntereinheiten aufweisen. Die Tatsache, dass sich in diesen Zellen sowohl oxidierte als auch/oder beschädigte Zellproteine ​​häufiger ansammelten, legt nahe, dass der Ubiquitin-Proteasom-Weg des Proteinabbaus an intrinsischen Alterungsprozessen beteiligt ist. Die Abbildungen 2B und C zeigen die Fähigkeit des methanolischen TAAR-Extrakts, NHDF-gealterte Zellen vor der Hemmung der 20S-Proteasomaktivität durch das Oxidationsmittel OCl− zu schützen. Tatsächlich hemmt das Oxidationsmittel OCl− die Proteasomaktivität der Kontrollzellen (Ct) bei 50 Prozent, während der stärkste 20S-Proteasomaktivator (Liponsäure bei 1 µM, Ct plus) mit mehr als 50 Prozent Hemmaktivität die Hemmung nicht umkehren kann der 20S-Proteasomaktivität durch OCl−, während alle anderen getesteten Konzentrationen (15, 50 und 75 µg/ml) des methanolischen TAAR-Extrakts diese Hemmung aufzuheben scheinen (0 bis 19 Prozent der Hemmung). Diese Ergebnisse legen nahe, dass TAAR-Wurzelextrakte Moleküle enthalten könnten, die die Hautalterung verzögern könnten, indem sie nicht nur die Proteasomaktivität steigern, sondern auch der hemmenden Wirkung von Oxidationsmitteln entgegenwirken. Unter diesen Molekülen ist neben anderen Verbindungen am wahrscheinlichsten Caffeoylshikimisäure vorhanden. Darüber hinaus wurden LC-DAD-MS (MS)- und NMR-Analysen durchgeführt, um die Hauptbestandteile der Extrakte zu identifizieren und werden hiermit im nächsten Abschnitt besprochen.

3.5. Spektrometrische Analysen

3.5.1. LC-DAD-MS-Analyse methanolischer Extrakte

Die vergleichende Untersuchung der Dattelpalmenwurzeln ergab keine qualitativen Unterschiede, stattdessen wurden bis zu einem gewissen Grad semiquantitative Unterschiede (in DAD- und MS-Chromatogrammen) zwischen den Sorten festgestellt (Abbildung 3A, D). Tatsächlich erlauben die vorliegenden Ergebnisse keinen Zusammenhang zwischen der Resistenz von Dattelpalmen gegenüber einem Anstieg der Menge verschiedener Positionsisomere von Caffeoylshikimisäure, da die resistente Sorte (TAAR) die geringste relative Häufigkeit dieser Verbindungen aufweist (Abbildung 3C). Alle drei Positionsisomere von Caffeoylshikimisäure (m/z=335.0768 mit einem Fehler von 1,2 ppm) wurden anhand ihrer MS/MS-Spektren (Abbildung S6) mit einem Fragment bei m/z identifiziert 179,0340, entsprechend einem Kaffeesäurefragment A (C9H7O4) und einem Fragment bei m/z 135,0443, entsprechend der Decarboxylierung von Kaffeesäure (C8H7O2). Dennoch scheint eine andere Verbindung, die nicht den Caffeoyl-Shikimisäuren entspricht (Abbildung 3C) und deren Retentionszeit 29 Minuten mit m/z=259.0607 (oder 373.0543 für TFA-Addukt) beträgt, klar zwischen verschiedenen Sorten unterschieden zu werden (Abbildung 3D). Der Unterschied in der Anreicherung dieser Verbindung in den Wurzeln empfindlicher und resistenter Sorten (0,135 Prozent) mit einem Verhältnis von etwa 1:35 (aus m/z=259.06, MS-Daten) könnte die herausragende biologische Ursache erklären Aktivitäten, die für den methanolischen Extrakt dieser Wurzel beobachtet wurden.

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