Der RNA M6 A Reader YTHDF2 steuert den Antitumor und die antivirale Immunität von NK-Zellen, Teil 6

Metastasiertes Melanommodell und MCMV-Challenge

B16F10-Zellen (105) wurden Mäusen iv injiziert. 14 Tage nach der Injektion wurden die Mäuse zur Obduktion eingeschläfert. Metastatische Knötchen in der Lunge wurden makroskopisch analysiert und gezählt. Die B16F10-Zelllinie wurde von Hua Yu (City of Hope, Los Angeles, CA) bereitgestellt. Ythdf2ΔNK- und Ythdf2WT-Mäuse wurden mit einer ip-Injektion des Smith-Stamms MCMV (2,5 × 104 PFU) infiziert, der von der American Type Culture Collection (VR-1399) erworben wurde. Periphere Blutproben wurden durch submandibuläre Punktion an den Tagen 0, 4 und 7 nach der Infektion entnommen.

Lungenmetastasenknötchen beziehen sich auf Knötchen, die von bösartigen Tumorzellen von anderen Stellen gebildet werden, die über das Blut- oder Lymphsystem in die Lunge wandern. Für viele Patienten ist dies eine häufige Manifestation von Lungenkrebs.

Obwohl Lungenmetastasenknötchen eine Gefahr für die körperliche Gesundheit der Patienten darstellen, besteht kein direkter Zusammenhang zwischen ihnen und dem Gedächtnis. Daher sollten wir uns aktiv den Herausforderungen von Lungenkrebs und Lungenmetastasen stellen und nicht zulassen, dass negative Emotionen und Ängste unsere körperliche und geistige Gesundheit beeinträchtigen.

Gleichzeitig können wir das Gedächtnis durch einige positive Methoden erhalten und verbessern. Führen Sie beispielsweise ein Gedächtnistraining durch, wie zum Beispiel mathematische Berechnungen, Lesen, Musik hören, Spiele spielen usw. Darüber hinaus kann es auch hilfreich sein, gute Lebensgewohnheiten einzuhalten, wie zum Beispiel regelmäßige Bewegung, ausreichend Schlaf, gesunde Ernährung usw unser Gedächtnis verbessern.

Das Wichtigste ist, eine positive Einstellung zu bewahren. Egal mit welchen Schwierigkeiten Sie konfrontiert sind, Sie müssen an Ihre Stärke und die Flexibilität Ihres Nervensystems glauben und durch positive Anpassungen und Reaktionen werden Sie die Schwierigkeiten letztendlich erfolgreich überwinden.

Kurz gesagt: Obwohl metastatische Knötchen in der Lunge eine Gefahr für die körperliche Gesundheit darstellen, stehen sie nicht in direktem Zusammenhang mit dem Gedächtnis. Wir sollten positiv damit umgehen und unser Gedächtnis erhalten und verbessern, indem wir unseren Lebensstil anpassen und eine gute Einstellung bewahren. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche deserticola kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche deserticola auch das Gleichgewicht von Neurotransmittern regulieren kann, beispielsweise durch die Erhöhung des Acetylcholin- und Wachstumsfaktorspiegels. Diese Stoffe sind sehr wichtig für das Gedächtnis und das Lernen. Darüber hinaus kann Cistanche deserticola auch die Durchblutung verbessern und die Sauerstoffversorgung fördern, wodurch sichergestellt werden kann, dass das Gehirn ausreichend Nährstoffe und Energie erhält, wodurch die Vitalität und Ausdauer des Gehirns verbessert werden. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche deserticola kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche deserticola auch das Gleichgewicht von Neurotransmittern regulieren kann, beispielsweise durch die Erhöhung des Acetylcholin- und Wachstumsfaktorspiegels. Diese Stoffe sind sehr wichtig für das Gedächtnis und das Lernen. Darüber hinaus kann Cistanche deserticola auch die Durchblutung verbessern und die Sauerstoffversorgung fördern, wodurch sichergestellt werden kann, dass das Gehirn ausreichend Nährstoffe und Energie erhält, wodurch die Vitalität und Ausdauer des Gehirns verbessert werden.

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Um die Viruslast im peripheren Blut, in der Milz und in der Leber zu messen, wurde DNA mit einem QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit für die qPCR-Analyse isoliert. Die folgenden Primer wurden verwendet: MCMV-IE1, 59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (vorwärts) und MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (rückwärts).

In-vivo-Mausbehandlung mit IL-15

Für die In-vivo-Mausbehandlung mit IL-15 wurden Ythdf2ΔNK- und Ythdf2WT-Mäusen 5 Tage lang 2 µg ip rekombinantes menschliches IL-15 (Kat.-Nr. 745101; National Cancer Institute) injiziert. Die behandelten Mäuse und die Kontrollmäuse wurden dann für eine durchflusszytometrische Analyse eingeschläfert.

Durchflusszytometrie

Einzelzellsuspensionen wurden aus BM, Blut, Milz, Leber und Lunge von Ythdf2ΔNK- und Ythdf2WT-Mäusen hergestellt, wie zuvor beschrieben (Wang et al., 2018b). Die Durchflusszytometrieanalyse und Zellsortierung wurden mit einem LSRFortessa X-20 bzw. einem FACSAriaFusion-Durchflusszytometer (BD Biosciences) durchgeführt.

Die Daten wurden mit der NovoExpress-Software (Agilent Technologies) analysiert.

Die folgenden fluoreszenzfarbstoffmarkierten Antikörper von BD Biosciences, BioLegend, Invitrogen oder Cell Signaling Technology wurden verwendet: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ),TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7),CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70), CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1), KLRG1 (2F1), CD45 ({{46 }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), Granzym B (QA16A02), Perforin (S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226(TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), Annexin V, Ki67 (b56), Tbet (4b10) und Eomes (WD1928), Phospho-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101), Phospho-Akt (Ser473, #5315), ribosomales Phospho-S6-Protein ,Phospho-Stat3 (Tyr705, Nr. 9145) und Phospho-Stat5 (Tyr694, Nr. 9539).

Zur Bewertung der NK-Zellproliferation wurden die Zellen mit 5 µM CTV (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers markiert, bevor sie in Empfängermäuse übertragen wurden. Die intrazelluläre Färbung von Ki67, Tbet und Eomes wurde durch Fixierung und Permeabilisierung mit dem Foxp3/Transcription Factor Staining Kit (eBioscience) durchgeführt.

Zum Nachweis phosphorylierter Proteine ​​wurden gereinigte Milz-NK-Zellen 1 Stunde lang mit rekombinantem humanem IL-15 (50 ng/ml) vorbehandelt und dann mit Phosflow Fix Buffer I fixiert, gefolgt von einer Permeabilisierung mit Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) und einer Färbung mit Antikörper.

Adoptiver Zelltransfer

Um die Auswirkung eines Ythdf2-Mangels auf die Reifung von NK-Zellen zu beurteilen, wurde eine Mischung aus 5 × 106 BM-Zellen im Verhältnis 1:1 von CD45.1- oder Ythdf2ΔNK CD45.2-Mäusen in Rag2-/-Il2rg-/-Mäuse cotransferiert. Die Rekonstitution der Empfänger wurde 8 Wochen nach der Transplantation mittels Durchflusszytometrie beurteilt.

Für Lymphopenie-induzierte homöostatische Proliferationsexperimente wurde eine gleiche Anzahl gereinigter Milz-NK-Zellen von CD45.1- oder Ythdf2ΔNK-CD45.2-Mäusen in Rag2–/–Il2rg–/–-Mäuse cotransferiert, gefolgt von einer Bewertung der relativen Prozentsätze der übertragenen WT- und Ythdf2ΔNK-NK-Zellen in der Milz von Rag2−/−Il2rg−/− Empfängern mittels Durchflusszytometrie zu angegebenen Zeitpunkten.

Für das metastasierte Melanommodell wurden 106 IL-2-expandierte NK-Zellen von Ythdf2ΔNK- oder Ythdf2WT-Mäusen iv in Rag2−/−Il2rg−/− Mäuse injiziert. Einen Tag später wurden Mäusen B16F10-Zellen (105) iv injiziert. 14 Tage nach der Injektion wurden die Mäuse zur Obduktion eingeschläfert. In einigen Experimenten wurden Zellen mit CTV (5 µM, Invitrogen) markiert, um die Zellproliferation vor dem Transfer zu verfolgen.

In-vivo-Trading-Assay

Zum Nachweis des NK-Zelltransports von BM in das periphere Blut wurde 1 µg APC-markierter Anti-CD45-Antikörper iv in C57BL/6-Mäuse injiziert. Zwei Minuten nach der Antikörperinjektion wurden die Mäuse sofort eingeschläfert und die BM-Zellen wurden für die Durchflusszytometrie gesammelt, nachdem die Zellen mit CD3- und NK1.1-Antikörpern angefärbt worden waren. Parenchymale NK-Zellen wurden durch fehlende CD45-Färbung identifiziert, wohingegen sinusoidale NK-Zellen durch das Vorhandensein einer CD45-Markierung identifiziert wurden. Daher zeigt das Verhältnis der NK-Zellen in den Sinusoiden (CD45+) zu denen in den Parenchymregionen (CD45−) den NK-Zelltransport von BM in das periphere Blut im Steady-State an.

Echtzeit-RT-qPCR und Immunblotting

Die RNA wurde mit einem RNeasy Mini Kit (QIAGEN) isoliert und dann mit dem PrimeScript RT Reagent Kit mit gDNA Eraser (Takara Bio) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers in cDNA transkribiert. Die mRNA-Expressionsniveaus wurden mit SYBRGreen PCR Master Mix und einem QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR-System (beide von Thermo Fisher Scientific) analysiert. Primersequenzen sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Das Immunblotting wurde gemäß den zuvor beschriebenen Standardverfahren durchgeführt (Denget al., 2015; Yu et al., 2006). Die folgenden Antikörper wurden verwendet: METTL3 (Kat.-Nr. 15073-1-AP; Proteintech), METTL14 (Kat.-Nr. 26158-1-AP; Proteintech), YTHDF1 (Kat.-Nr. 17479-1-AP ; Proteintech), YTHDF2 (Kat.-Nr. RN123PW; MBL), YTHDF3 (Kat.-Nr. 25537-1-AP; Proteintech), ALKBH5 (Kat.-Nr. ab195377; Abcam),FTO (Kat.-Nr. ab124892; Abcam), MDM2 (Kat.-Nr. 33-7100; Invitrogen), TDP-43 (Kat.-Nr. PA5-29949; Invitrogen) und -actin (Kat.-Nr. {{20 }}Ig; Proteintech).

siRNA-Knockdown-Assay

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90 %, gemessen mittels Durchflusszytometrie. Die Geneknockdown-Effizienz wurde durch qPCR und Immunblotting bestimmt. 3 Tage nach der Transfektion wurden Zellapoptose und Proliferation wie oben beschrieben durchflusszytometrisch analysiert.

Luciferase-Reporter-Assay

Die Ythdf2-Promotorregion im Bereich von –2,000 bp bis +100 bp des TSS wurde aus murinen NK-Zellen amplifiziert und in apGL4-Basic Luciferase Reporter Vector (Promega) kloniert, um apGL zu erzeugen. {5}}Ythdf2-Reporterplasmid. Von ATCC gekaufte HEK293T-Zellen wurden mit den pGL4-Ythdf2-Reporterplasmiden sowie den Überexpressionsplasmiden STAT5a oder STAT5b oder einem leeren Vektor zusammen mit einem pRL-TK-Renilla-Reporterplasmid (Promega) zur Normalisierung der Transfektionseffizienz cotransfiziert. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion zur Lyse geerntet und die Luciferaseaktivität wurde fluorimetrisch mit dem Dual-LuciferaseSystem (Promega) quantifiziert. Primersequenzen für die Klonierung des Ythdf2-Promotors und der Überexpressionsplasmide STAT5a und STAT5b sind in Tabelle S1 aufgeführt.

ChIP-Assays

ChIP-Assays wurden mit einem Pierce Magnetic ChIP Kit (Kat.-Nr. 26157; Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, eine gleiche Menge an Anti-Anti-Phospho-Stat5 (Tyr694, Kat.-Nr. 9351; Cell Signaling Technologies) oder entsprechendes normales Kaninchen-IgG zur Kontrolle wurde separat verwendet, um die aus 5 × abgeleiteten vernetzten DNA-Protein-Komplexe auszufällen 106 gereinigte primäre NK-Zellen der Maus, die 1 Stunde lang mit IL-15 (50 ng/ml) vorbehandelt wurden. Nach der Umkehrung der Vernetzung wurde die durch den angegebenen Antikörper immunpräzipitierte DNA mittels qPCR getestet. Die Sequenzen aller Primer sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Ex-vivo-Zytotoxizitätstest

Die Ex-vivo-Zytotoxizität von NK-Zellen wurde durch standardmäßige 51Cr-Freisetzungstests bewertet. Als Zielzellen wurden die Maus-Lymphom-Zelllinien RMA-S (MHC-Klasse mangelhaft) und RMA-Zellen (MHC-Klasse I ausreichend) verwendet, eine Spende von Andre'Veillette (McGill University, Montreal, Kanada). Mäuse wurden mit ip-Injektion von Polyinosinsäure: Polycytidylsäure [Poly (I: C); 200 µg/Mäuse] für 18 Stunden. Poly(I:C)-aktivierte NK-Zellen wurden mit dem EasySepMouse NK Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies) aus der Milz isoliert. Gereinigte NK-Zellen wurden mit Zielzellen in einem Verhältnis von 5:1, 2,5:1 und 1,25:1 in Gegenwart von IL-2 (50 U/ml) kokultiviert.

m6A-seq

Gereinigte Milz-NK-Zellen wurden mit IL-2 (1,000 U/ml, Kat.-Nr. Bulk Ro 23-6019; National Cancer Institute) in vitro für 7 Tage expandiert. Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol-Reagenz (Thermo FisherScientific) aus 50 Millionen IL-2-expandierten NK-Zellen isoliert. Polyadenylierte RNA wurde mithilfe des Dynabeads mRNA Purification Kit (Invitrogen) weiter aus der Gesamt-RNA angereichert. mRNA-Proben wurden mit RNA-Fragmentierungsreagenzien (Invitrogen) in {{7}nt-lange Fragmente fragmentiert.

Fragmentierte mRNA (5 µgmRNA) wurde für die m6A-Immunpräzipitation unter Verwendung eines m6A-Antikörpers (202003; Synaptic) gemäß dem Standardprotokoll des Magna MeRIP m6A Kits (Merck Millipore) verwendet. Die RNA wurde durch RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) zur Bibliotheksgenerierung mit einem KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche) angereichert. Die Sequenzierung wurde in der Genomikeinrichtung von City of Hope auf einem Illumina HiSeq 2500-Gerät mit Single-Read-50-bp-Modus durchgeführt. Sequenzierungsablesungen wurden mithilfe der HISAT2 v101-Software auf das Mausgenom abgebildet (Kim et al., 2015).

Mappingreads von Immunpräzipitations- und Eingabebibliotheken wurden mithilfe des R-Pakets exomePeak bereitgestellt (Meng et al., 2014). m6Apeaks wurden mit der Software Integrative Genomics Viewer (http://www.igv.org) visualisiert. Das m6A-bindende Motiv wurde von MEME (https://meme-suite.org) und HOMER (http://homer.ucsd.edu/homer/motif) analysiert. Angerufene Peaks wurden durch Schnittmenge mit der Genarchitektur mit dem Rpackage ChIPseeker annotiert (Yu et al., 2015).

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2 (fache Änderung)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP-seq

50 Millionen IL-2-expandierte NK-Zellen wurden geerntet und zweimal mit kaltem PBS gewaschen, und das Zellpellet wurde mit 2 Vol. Lysepuffer (10 mM Hepes, pH 7,6, 150) lysiert mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 0,5 mM Dithiothreitol, 1:100 Protease-Inhibitor-Cocktail [Thermo Fisher Scientific] und 400 U/ml SUPERase-In RNase-Inhibitor [Thermo Fisher Scientific]).

Das Lysat wurde 5 Minuten lang auf Eis inkubiert und 15 Minuten lang zentrifugiert, um das Lysat zu klären. Ein Zehntel Volumen Zelllysat wurde als Input gespeichert. Der Rest des Zelllysats wurde mit 5 µg Anti-YTHDF2 (Kat.-Nr. RN123PW; MBL) inkubiert, das mit Protein A-Magnetkügelchen (Kat.-Nr. 10001D; Invitrogen) gekoppelt war. bei 4 Grad für 2 Stunden unter sanfter Rotation. Anschließend wurden die Perlen fünfmal mit 1 ml eiskaltem Waschpuffer (50 mM HEPES, pH 7,6, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,05 % NP-40, 0,5 mM Dithiothreitol und 200 U/ml RNase gewaschen Inhibitor).

Immunpräzipitierte Proben wurden einem Proteinase-K-Verdau in Waschpuffer, ergänzt mit 1 % SDS und 2 mg/ml Proteinase K (ThermoFisher Scientific), unterzogen und 1 Stunde lang unter Schütteln bei 1.200 U/min bei 55 Grad inkubiert. Die Gesamt-RNA wurde sowohl aus der Input- als auch der immunpräzipitierten RNA durch Zugabe von 5 Vol. TRIzol-Reagenz und anschließendem Direct-zol-RNA-Miniprep (Zymo Research) extrahiert.

Die cDNA-Bibliothek wurde mit einem KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche) generiert und auf einer Illumina HiSeq 2500-Plattform sequenziert. Peak-Calling-Ergebnisse mit Immunpräzipitation und Eingabebibliotheken wurden mit dem R-Paket RIPSeeker generiert (Li et al., 2013). HOMER wurde verwendet, um Motive der Datenverteilung in Peakregionen zu finden. Genannte Peaks wurden durch Schnittmenge mit der Gen- und Transkriptarchitektur unter Verwendung von ChIPpeakAnno annotiert (Zhu et al., 2010).

mRNA-Stabilitätstest

Gereinigte Milz-NK-Zellen von Ythdf2ΔNK- und Ythdf2WT-Mäusen wurden mit IL-15 (50 ng/ml) kultiviert. 3 Tage nach der Kultur wurden die Zellen für die angegebene Zeit mit Actinomycin D (5 µg/ml, Kat.-Nr. A9415; Sigma) behandelt. Zellen ohne Behandlung wurden bei 0 Stunden verwendet. Die Zellen wurden zum angegebenen Zeitpunkt gesammelt und die Gesamt-RNA wurde aus den Zellen für die qPCR extrahiert. Die mRNA-Halbwertszeit wurde mit der zuvor von Weng et al. (2018) beschriebenen Methode berechnet. Primersequenzen sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Online-Datenbankanalyse

Wir haben die Online-Ressource BioGPS (http://biogps.org) verwendet, um die gewebespezifische Expression von Ythdf2 zu analysieren. Die RNA-Sequenzdatensätze stammten von GEO unter den Zugangsnummern. GSE106138, GSE113214 und GSE25672. Normalisierte Daten aus RNA-seq-Analysen wurden exportiert und der Genexpressions-Z-Score wurde mit der Heatmap.2-Funktion in der gplots-Bibliothek visualisiert

Statistiken

Ungepaarte Student-T-Tests (zweiseitig) wurden mit der GraphPad Prism-Software durchgeführt. Eine einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA wurde durchgeführt, wenn drei oder mehr unabhängige Gruppen verglichen wurden. Die P-Werte wurden für Mehrfachvergleiche mithilfe des Holm-Sˇ´ıdak-Verfahrens angepasst. P < 0.05 wurde als signifikant angesehen. *, P < {{10}}.05; **, P < 0,01; und ***, P < 0,001.

Online-Ergänzungsmaterial

Abb. S1 zeigt die Proteinspiegel von YTHDF2 in Immunzellen, einschließlich NK-Zellen, als Reaktion auf IL-15-Stimulation, MCMV-Infektion und Tumorprogression; die Generation von Mäusen mit NKzell-spezifischer Deletion von Ythdf2. Abb. S2 zeigt die Virustiter in Milz und Leber von mit MCMV infizierten Mäusen sowie den Prozentsatz und die absolute Anzahl von Ly49H+- und/oder Ly49D+-NK-Zellen in mit MCMV infizierten Mäusen. Abb. S3 zeigt die Proliferation, das Überleben, die Reifung und die Expression aktivierender und inhibitorischer Rezeptoren von NK-Zellen aus Ythdf2WT- und Ythdf2ΔNK-Mäusen. Abb. S4 zeigt die Regulierung der YTHDF2-Expression durch IL-15-STAT5-Signalisierung und die Expression der Komponenten von IL-15-Rezeptoren, des PI3K-AKT-Signalwegs und des MEK-ERK-Signalwegs in NK-Zellen von Ythdf2WT und Ythdf2ΔNK Mäuse. Abb. S5 zeigt transkriptomweite RNA-seq-, m6A-seq- und RIP-seq-Assays in NK-Zellen. Tabelle S1 listet die in der Studie verwendeten Primer auf.

Datenverfügbarkeit

Die RNA-seq-, m6A-seq- und RIP-seq-Daten wurden beim National Center for Biotechnology Information GEO unter der Zugangsnummer hinterlegt. GSE174027. Die übrigen Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458 und CA210087), der Leukemia and Lymphoma Society (1364-19) und dem California Institute for Regenerative Medicine (DISC2COVID{{) unterstützt. 9}}) und der Breast Cancer Alliance 2021 Exceptional ProjectAward. Diese Arbeit wurde teilweise auch durch einen USDAaward (USDA/NIFA 2020-67017-30843) unterstützt.

Beiträge der Autoren: S. Ma, J. Yu und MA Caligiuri haben das Projekt konzipiert und gestaltet. S. Ma, J. Yan, J. Zhang und J. Yu führte Experimente und/oder Datenanalysen durch. Z. Chen, L.-S. Wang, JC Sun und J. Chen steuerten Reagenzien und Materialunterstützung bei. S. Ma, J. Yu, J. Chen und MA Caligiuri haben den Artikel geschrieben, überprüft und/oder überarbeitet. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Offenlegungen: J. Chen berichtete über „Sonstiges“ von Genovel BiotechCorp. außerhalb der eingereichten Arbeit und ist ein wissenschaftlicher Gründer von Genovel Biotech Corp. und ein wissenschaftlicher Berater der Rassen-Onkologie. Es wurden keine weiteren Offenlegungen gemeldet.

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