Die Serum/PDGF-abhängige melanogene Rolle des winzigen Spiegels der onkogenen Kinase PAK1 in Melanomzellen, nachgewiesen durch den hochempfindlichen Kinase-Assay

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zusammenfassung:Wir haben zuvor gezeigt, dass die onkogene Kinase PAK4, die sowohl von Melanomen als auch von normalen Melanozyten in sehr hohem Maße exprimiert wird, für ihre Gesundheit essentiell istMelanogenese. In der vorliegenden Studie untersuchten wir mit dem hochempfindlichen "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo)-Kinase-Assay das melanogene Potenzial einer anderen onkogenen Kinase PAK1, die Melanomzellen (B16F10) nur in sehr geringem Maße exprimieren. Nach Transfektion von Melanomzellen mit PAK1-shRNA zum Silencing des PAK1-Gens, Melaningehalt,TyrosinaseAktivität und Kinaseaktivität von PAK1 wurden zwischen dem Wildtyp und den Transfektanten verglichen. Wir fanden heraus, dass (i) PAK1 signifikant durch melanogene Hormone wie IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin) und -MSH (Melanozyten-stimulierendes Hormon) aktiviert wird, (ii) das endogene PAK1-Gen stummgeschaltet wird Melanomzellen durch PAK1--spezifische shRNA reduziert sowohl den Melaningehalt als auchTyrosinaseAktivität in Gegenwart von sowohl Serum als auch melanogenen Hormonen auf das Grundniveau, (iii) das exogen zugesetzte Wildtyp-PAK1 in den Melanomzellen erhöht das -MSH-induzierbare Melaninniveau um ein Vielfaches, ohne das Grundniveau zu beeinflussen, und (iv) - MSH/IBMX-induzierte Melanogenese findet kaum in Abwesenheit von entweder Serum oder PAK1 statt, was eindeutig darauf hinweist, dass PAK1 hauptsächlich für Serum- und -MSH/IBMX-abhängige Menschen essentiell istMelanogenese, aber nicht die basale, in Melanomzellen. Das Ergebnis dieser Studie könnte die erste wissenschaftliche Grundlage dafür liefern, warum eine Vielzahl von pflanzlichen PAK1--Blockern wie CAPE (Coffeic Acid Phenethyl Ester), Curcumin und Shikonin in Kosmetika nützlich sindHautaufhellung.

Schlüsselwörter:PAK1,Melanogenese, Melanome,Tyrosinase, MITF,Hautaufhellung, Serum

aufhellende Hautpflegeprodukte von Cistanche

Einführung

Die Farbe von Haaren, Augeniris und Haut wird durch eine Pigmentfamilie namens Melanine gesteuert. Die intrazelluläre Melaninquelle ist Tyrosin und wird durch eine Reihe von enzymatischen Oxidationen (Hydroxylierung) in Melanin umgewandeltTyrosinase, TRP (Tyrosinase-verwandtes Protein) 1 und TRP2. Die Expression von Genen, die für diese melanogenen Enzyme kodieren, erfordert mindestens zwei onkogene/melanogene Transkriptionsfaktoren (MTFs): Beta-Catenin und MITF (Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor). Die Mehrheit der pflanzlichen Verbindungen inHautaufhellungKosmetika hemmen diese melanogenen Enzyme entweder direkt oder regulieren die MTFs herunter. Tyrosin-Analoga wie Kojisäure gehören zur ersten Kategorie (TyrosinaseInhibitoren), während die Mehrheit der Reste wie CAPE (Kaffeesäurephenethylester), Curcumin und Shikonin zur zweiten Kategorie (MTF-Regulatoren) gehören (1,2). Interessanterweise ist bekannt, dass viele dieser MTF-Regulatoren, einschließlich CAPE, Curcumin, Shikonin und Cucurbitacin, die onkogene/alternde Kinase PAK1 (RAC/CDC42--aktivierte Kinase 1) (3-5) blockieren. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass PAK1 an der Aktivierung dieser melanogenen/onkogenen Transkriptionsfaktoren in Haarzellen, Augeniris oder Hautmelanozyten beteiligt ist. Tatsächlich gehört zumindest Beta-Catenin zu den direkten Substraten von PAK1 (6). PAK1 phosphoryliert Beta-Catenin bei Ser 675 zur Aktivierung, was zu einer bösartigen Transformation führt. Darüber hinaus ist Beta-Catenin für die Aktivierung von MITF unerlässlich, was zuMelanogeneseoder/und Onkogenese von Melanozyten (7).

Interessanterweise wurde jedoch kürzlich enthüllt, dass das Ausschalten des PAK1-Gens per se in pigmentierten Mäusen keine Albino-Mäuse hervorbringt (Hong He et al., unveröffentlichte Beobachtung), was eindeutig darauf hinweist, dass zumindest die basale Melanogenese sowohl in den Haarzellen als auch im Auge erfolgt Iris ist unabhängig von PAK1, obwohl der Beitrag von PAK1 zur HautMelanogenesebleibt zu klären.

Wir haben zuvor gezeigt, dass die onkogene Kinase PAK4 (CDC42--abhängige Kinase 4) sowohl in Melanom- als auch in normalen Melanozyten-Zelllinien stark exprimiert wird und für ihre Melanogenese verantwortlich ist, wodurch CREB/beta-Catenin-MIFT- aktiviert wird.Tyrosinasewährend PAK2 (RAC/CDC42--aktivierte Kinase 2), ein weiteres stark exprimiertes Mitglied der PAK-Familie, bei ihrer Melanogenese keine Rolle spielt (8).

In dieser Studie liefern wir den ersten biochemischen Beweis für eine spezifische Rolle einer anderen onkogenen Kinase namens PAK1 in der HautMelanogenese, trotz der Tatsache, dass sein Expressionsniveau winzig ist: shRNA-induziertes Silencing des PAK1-Gens in Melanozyten (B16F10), die von Maus-Melanomen stammen, reduzierte signifikant das -MSH/IBMX-induzierbareMelanogeneseauf das basale Niveau, während die Überexpression des PAK1-Gens die -MSH-induzierbare Melanogenese verstärkte, ohne das basale zu beeinflussen. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die -MSH/IBMX-induzierbare Melanogenese einen Serumfaktor erfordert, der höchstwahrscheinlich PDGF (von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor) ist. Im serumfreien Medium nur basalMelanogenesestattfinden.

Zistancheverringern die Aktivität der Tyrosinase

2. Materialien und Methoden

2.1. Materialien

B16F10-Melanomzellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) erworben. PAK1-SureSilencing-Plasmide, attraktive Transfektion, endofree®-Plasmid-Maxi-Kit wurden von Qiagen (Valencia, CA 91355, USA) erworben. Primäre PAK1--Antikörper, biotinylierte sekundäre Antikörper, signalfireTM ECL-Reagenz wurden von Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) bezogen. Kinase-Glo-Reagenz und ATP (ATP_Glo-Kinase-Kit) wurden von Promega (Madison, Wisconsin, USA) gekauft. Kompetente Lipofectamin- und JM109-Zellen wurden von Invitrogen und Life Technology bezogen. AG1295 und AG1478 wurden von Calbiochem (San Diego, CA, USA) bezogen. Alle anderen Chemikalien einschließlich menschlichem PDGF-bb wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen.

2.2. Silencing des PAK1-Gens in Maus-Melanozyten (B16F10) durch stabile Transfektion mit Maus-PAK1--spezifischer shRNA

2.2.1. Zellkultur

B16F10-Melanomzellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % hitzeaktiviertem FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin (10,000 U/ml und 100 µg/ml) bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert.

2.2.2. Stabile Transfektion mit Maus-PAK1--spezifischer shRNA

Die ShRNA-Transfektion der B16F10-Zelllinie wurde im Wesentlichen durch das gleiche zuvor beschriebene Verfahren (9) durchgeführt, jedoch mit Maus-PAK1--spezifischen shRNAs (# KM04553, Qiagen). Die folgenden vier unterschiedlichen shRNA-Klone wurden für die Transfektion verwendet: Klon 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), Klon 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT), Klon 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT) und Klon 4 (GTACCACCAGTGTCAGAAGAT) sowie shCONTROL non-targeting shRNA als Negativkontrolle (WT) . Jedoch erwiesen sich in dieser Studie die Klone 1 und 2 als wirksamer als die Klone 3 und 4 für das Silencing des Maus-PAK1-Gens in dieser Melanozytenlinie (Daten nicht gezeigt). Stabile Transfektanten wurden in Gegenwart von G418 (1 mg/ml) selektiert, das mehr als 99 Prozent der nicht-transfizierten Zellen abtötet.

2.2.3. Western-Blot-Analyse des PAK1-Proteinspiegels und In-vitro-Assay für die Kinaseaktivität von PAK1 in Transfektanten

2.2.3.1. Western-Blot-Analyse

Um den extrem niedrigen PAK1-Spiegel sowohl in der Kontrollzelllinie (WT) als auch in PAK1--stummgeschalteten Transfektanten (G418--resistent) zu quantifizieren, indem wir die Pegel des "unspezifischen Rauschens" minimierten, führten wir den Western durch Blot-Analyse unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen PAK1 (#2062, Cell Signaling Technology) als Primärantikörper. Kurz gesagt wurde jeder Klon mit einer Konzentration von 2 × 10 5 Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät, für 48 h vorkultiviert und die Zelllysate wurden in 25 &mgr;l SDS-PAGE-Puffer für 5 min gekocht. Acht &mgr;l (enthaltend 15 &mgr;g Gesamtprotein) jedes Überstands pro Slot wurden für SDS-PAGE verwendet. Die Nitrocellulose wurde mit dem Anti-PAK1-IgG (1:1, 000-Verdünnung als Primärantikörper) und als Sekundärantikörper mit dem HRP-gebundenen Anti-Kaninchen-IgG und Anti-Biotin-IgG (#7074, # 7075, Cell Signaling) wurden verwendet, um sowohl PAK1- als auch -Actin-Banden nachzuweisen, die schließlich mit dem ECL-System von Amersham sichtbar gemacht wurden. Die Western-Blot-Assays waren repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

2.2.3.2. "Macaroni-Western" (IP-ATP_Glo)-Kinase-Assay für PAK1 in Melanomzellen

Die Kinaseaktivität von PAK1 in den WT-Melanozyten und shRNA-Transfektanten (SHs) wurde durch eine wesentliche Modifikation (5) einer jahrzehntealten Methode (die wir "Macaroni-Western" nannten) gemessen, die von einer italienischen Gruppe entwickelt wurde (1{{39 }}). Kurz gesagt, B16F10-Melanomzelllinien (WT oder SHs, 2 × 105 Zellen/ml) wurden 24 Stunden lang auf 6--Well-Platten vorkultiviert. Dann wurden die Zellen mit 100 nM -MSH oder 100 &mgr;M IBMX für 48 h behandelt. Die Zellen wurden durch Lysepuffer aufgeschlossen, der 50 mM Tris-HCl pH 7,5 und 150 mM NaCl und 1 Prozent Triton-X enthielt. Für die Immunpräzipitation (IP) von PAK1 wurden die geklärten Zelllysate mit Anti-PAK1-IgG (1:50-Verdünnung) und Protein-A-Agarose-Beads für 1-2 h im Kühlraum unter kontinuierlichem Schütteln durch einen Rotationsmischer inkubiert (Nissin, Suginami-ku, Tokio, Japan). Das resultierende IP (PAK1) aus jedem Lysat wurde mit dem ATP-Glo-Kinase-Assay-Kit (Promega) in Gegenwart von ATP und MBP (Myelin-Basisprotein) für 1 Stunde bei 37 Grad inkubiert, und der verbleibende ATP-Spiegel wurde mit dem ATP- abhängige Luciferin-Luciferase-Reaktion, die schließlich eine Lumineszenz erzeugt (10). Die endgültige Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand wurde zum Ablesen in eine 96--Well-Platte überführt. Die Lumineszenz wurde mit einem MTP-880Lab-Mikroplattenlesegerät (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Japan) mit einer Integrationszeit von 0,5 s pro Vertiefung aufgezeichnet.

2.3. Messung des Melaningehalts und der Tyrosinaseaktivität in Transfektanten

2.3.1. Messung des Melaningehalts

Der Melaningehalt wurde wie zuvor beschrieben bestimmt (11). Kurz gesagt, B16F10-Zellen (Wildtyp- oder PAK1--spezifische shRNA-Transfektanten) wurden mit einer Dichte von 2 × 104 Zellen/Vertiefung in einer 24--Vertiefungsplatte ausplattiert. Nach 24-stündiger Kultur wurden 100 µM Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) oder 100 nM -MSH zugegeben und weitere 72 Stunden bei 37 Grad inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit Phosphatpuffer gewaschen, dann mit 500 &mgr;l einer Lösung, die 1 M NaOH und 10 % DMSO enthielt, lysiert und 1 h bei 80 Grad inkubiert, um das Melanin zu solubilisieren, und der Melaningehalt wurde bei 490 nm gemessen. Um den Melaningehalt in den Wildtyp- und transfizierten Zellen zu vergleichen, wurde die Gesamtmenge an Melanin, die von den Wildtyp-Melanozyten produziert wurde, als Kontrolle betrachtet (100 Prozent), und die von den Transfektanten wurden entsprechend berechnet.

2.3.2. Assay für intrazelluläre Tyrosinase-Aktivität

TyrosinaseDie Aktivität wurde wie zuvor beschrieben (12) mit einer leichten Modifikation bestimmt. B16F10-Zellen (Wildtyp oder die Transfektanten) wurden mit einer Dichte von 2 × 10 4 Zellen/Vertiefung ausplattiert, und nach 24 h Kultur wurden 100 &mgr;M IBMX oder 100 nM -MSH zugegeben und weitere 72 h bei 37 Grad inkubiert . Die Zellen wurden dann mit eiskaltem Phosphatpuffer gewaschen und mit Phosphatpuffer (pH 6,8), enthaltend 1 Prozent Triton-X (500 &mgr;l/Vertiefung), lysiert. Die Platten wurden 30 Minuten lang bei –80 Grad eingefroren. Nach dem Auftauen wurden 100 &mgr;l 1-prozentiges L-DOPA in jede Vertiefung gegeben. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37 Grad wurde die Extinktion bei 490 nm gemessen.

2.4. Messung des Melaningehalts in Wildtyp- und PAK1--überexprimierenden Melanozyten nach -MSH-Behandlung

Unter Verwendung des Myc-Vektors (2 ug) wurden Melanozyten (B16F10) vorübergehend entweder mit Wildtyp (WT) PAK1 oder sogenanntem "konstitutiv aktiviertem" (CA) PAK1, das eine T423E-Mutation trägt, transfiziert. Nach 3 Tagen Kultur wurde jeder transfizierte Klon für weitere Experimente geerntet. Die Wirkung der PAK1--Überexpression auf den Melaningehalt wurde durch dieselben zuvor beschriebenen Verfahren gemessen (8). Kurz gesagt, Melanozyten, entweder der Wildtyp oder PAK1--Überexpression, die entweder den Wildtyp PAK1 oder seine CA-Mutante exprimieren, wurden mit 100 nM -MSH für 3 Tage inkubiert. Die Zellen wurden mit einer Lösung lysiert, die 1 M NaOH und 20 Prozent DMSO enthielt, um das Melanin aufzulösen, und sein Gehalt wurde bei 405 nm bestimmt.

2.5. Melanogenese in einem serumfreien Medium

B16F10-Zellen (Wildtyp- oder PAK1--spezifische shRNA-Transfektanten) wurden mit einer Dichte von 2 × 104 Zellen/Vertiefung in einer 24--Vertiefungsplatte in Gegenwart von 10 % FBS ausplattiert. Nach 24 h Inkubation wird das Kulturmedium durch ein serumfreies Medium ersetzt und weitere 72 h mit oder ohne 100 uM IBMX oder 100 nM -MSH kultiviert, um den Melaningehalt zu messen.

2.6. Wirkung von PDGF/EGF-Rezeptor-Inhibitoren auf die Serum-abhängige Melanogenese

2 × 10 4 B16F10-Zellen wurden in jede Vertiefung für 24 h in 10 % FBS-enthaltendem Medium ausgesät und dann für weitere 72 h in dem frischen Medium kultiviert, das 100 nM -MSH und Folgendes enthielt: (1) kein Serum, (2) 10 Prozent FBS allein, (3) 10 Prozent FBS plus 2 µM AG1295 (PDGF-Rezeptor-Inhibitor) und (4) 10 Prozent FBS plus 400 nM AG1478 (EGF-Rezeptor-Inhibitor), um den Melaningehalt zu messen.

2.7. statistische Analyse

Die Daten sind als Mittelwerte mit ihren Standardfehlern ausgedrückt. Statistische Vergleiche wurden durch einfache ANOVA, gefolgt von Duncans multiplem Bereichstest, durchgeführt. Die statistische Analyse wurde mit SAS (Release 9.2; SAS Institute, Cary, NC, USA) durchgeführt und p kleiner oder gleich 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Maca-Ginseng-Cistanche

3. Ergebnisse

3.1. Aktivierung von PAK1 in einer Melanomzelllinie (B16F10) durch melanogene Hormone

Zwei melanogene Hormone, -MSH (Melanozyten-stimulierendes Hormon) und IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin) werden häufig zur Stimulation verwendetMelanogenesein Melanozyten wie der Melanomzelllinie B16F10. Daher haben wir zunächst untersucht, ob diese Hormone PAK1 in dieser Zelllinie aktivieren können, obwohl der Proteinspiegel von PAK1 dort extrem niedrig ist, verglichen mit denen von PAK2 und PAK4 (8). Um die Änderungen der Kinaseaktivität von PAK1 in Zellen zu überwachen, haben wir kürzlich ein hochempfindliches/spezifisches Kinase-Assay namens „Macaroni-Western“ (IP ATP-Glo) Kinase-Assay-Protokoll entwickelt, indem wir die Immunpräzipitation (IP) von PAK1 aus der Zelle kombinieren Lysate und das ATP_Glo-Kinase-Kit von Promega (5). Unter Verwendung dieses Kinase-Assays stellten wir fest, dass sowohl -MSH (100 nM) als auch IBMX (100 µM) PAK1 in Melanomzellen aktivieren, wobei -MSH wirksamer ist als IBMX (siehe Abbildung 1). Wir sollten die Leser jedoch daran erinnern, dass die hier gezeigte Mehrfachaktivierung von PAK1 nur scheinbar ist, da während dieses zeitaufwendigen Reagenzglas-IP- und Kinase-Assays (insgesamt über 3 Stunden), der ohne diese melanogenen Hormone stattfindet, PAK1 allmählich normalisiert würde Zeit. Mit anderen Worten, wir können den genauen Kinase-Status von PAK1 am Ende der mit diesen Stimulatoren behandelten Zellkultur nicht einfrieren, und die fache Aktivierung ist nur eine unterschätzte Widerspiegelung der PAK1-Aktivierung, die während der Zellkultur durch diese Simulatoren stattfand.

3.2. Silencing des PAK1-Gens durch shRNAs in Maus-Melanom-Zelllinien

Um weiter biochemisch zu untersuchen, ob PAK1 dazu beiträgtMelanogenesein Hautzellen (Melanozyten) haben wir die Melanomzelllinie B16F10 stabil mit Maus-PAK1--spezifischer shRNA transfiziert, um das PAK1-Gen selektiv abzuschalten.

3.2.1. Silencing des PAK1-Gens in Melanozyten

Unsere vorläufige Western-Blot-Analyse legte nahe, dass in zwei verschiedenen PAK1--silenced-Klonen (SH1 und 2) die PAK1-Proteinspiegel signifikant (um etwa 75 %) reduziert sind, die Wachstumsrate dieser Melanomzelllinie an sich jedoch nicht signifikant von der PAK1-Stummschaltung beeinflusst (Daten nicht gezeigt). Die genaue Quantifizierung der PAK1-Proteinspiegel durch Scannen dieses Western-Blots war jedoch ziemlich schwierig, hauptsächlich wegen des starken Hintergrundrauschens um die PAK1-Bande bei dem Versuch, seine extrem niedrigen Expressionsspiegel sichtbar zu machen. Stattdessen verifizierten wir unter Verwendung des "Macaroni-Western"-Kinase-Assays (5,10), dass die Kinase-Aktivität von PAK1 sowohl in SH1- als auch in 2-Klonen nur etwa 25-30 Prozent der in den Kontrollzellen (WT) beträgt ( siehe Abbildung 2A).

3.2.2. Reduktion der Melanogenese durch Silencing des PAK1-Gens

Unsere nächste kritische Frage war, ob sich eine solche Verringerung der Kinaseaktivität auf PAK1 auswirktMelanogenese. Somit wurde der Melaningehalt in diesen Klonen (SH1 und 2) mit den Melanomzellen vom Wildtyp (WT) verglichen, nachdem alle diese Zellen mit -MSH, einem melanogenen Induktor, für 72 h behandelt worden waren. Wie in Abbildung 2B gezeigt, ist der Melaningehalt in diesen PAK1--defizienten Melanozyten (SH1 und 2) um etwa 50 Prozent (51-55 Prozent) reduziert und erreicht im WT ohne melanogenes Hormon das Grundniveau. Um zu sehen, ob diese Verringerung des Melaningehalts mit der Unterdrückung der Tyrosinaseaktivität verbunden ist, haben wir die gemessenTyrosinaseAktivität in PAK1--defizienten Zellen (Klone SH1 und 2), verglichen mit dem WT. Wie in Abbildung 2C gezeigt, beträgt die Tyrosinase-Aktivität in PAK1--defizienten Zellen nur etwa 45 Prozent (33-58 Prozent) der im WT, was wiederum das basale (nicht stimulierte) Niveau erreicht, was ein klarer Hinweis ist dass PAK1 für die -MSH-induzierte Melaninproduktion von essentieller Bedeutung istTyrosinasein Melanozyten. Darüber hinaus wurde in sehr ähnlicher Weise auch die IBMX-induzierte Melanogenese durch Silencing des PAK1-Gens in dieser Melanomzelllinie reduziert (Daten nicht gezeigt). Berücksichtigt man jedoch die beiden folgenden Faktoren, ist es höchstwahrscheinlich nur die HälfteMelanogenesein Melanozyten ist PAK1--abhängig, und der Rest (weitgehend "basisch") ist PAK4--abhängig: (i) PAK4 ist auch für die -MSH-induzierte Melanogenese in Melanozyten essentiell (8), und (ii) ungefähr 25 Prozent des PAK1-Gens scheinen immer noch in diesen Transfektanten (SH1 und 2) exprimiert zu sein. Ob PAK1 für die hormoninduzierbare oder die basale verantwortlich ist, muss jedoch noch intensiv geklärt werdenMelanogenese.

Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass das endogene PAK1 durch melanogene Induktoren wie IBMX und -MSH in dieser Melanomzelllinie signifikant aktiviert wird (siehe Abbildung 1), jedoch ohne signifikante Änderung seiner Autophosphorylierung bei Thr 423, wie durch das Anti-pPAK1 beurteilt Antikörper (Daten nicht gezeigt).

3.3. Steigerung der -MSH-induzierbaren Melanogenese durch überexprimiertes PAK1

Durch Überexpression des Wildtyp (WT)-PAK1-Gens in Melanozyten (B16F10-Zelllinie) durch Transfektion zeigten wir, dass das exogen hinzugefügte PAK1-Gen den -MSH-induzierbaren Melaninspiegel um ein Vielfaches erhöht (siehe links in Abbildung 3, vergleiche Bahnen 2 und 4), während es den unabhängigen "basalen" Melaninspiegel an sich kaum beeinflusst (vergleiche Bahnen 1 und 3 im linken Feld von 3 ), was darauf hindeutet, dass PAK1 hauptsächlich zur -MSH/IBMX-Abhängigkeit beiträgtMelanogenese, und nicht die basale Melanogenese ohne exogene(n) Stimulator(en).

3.4. Serumwirkung auf -MSH/IBMX-induzierbare Melanogenese

Interessanterweise fanden wir heraus, dass die Induktion der Melanogenese durch -MSH/IBMX zusätzlich zu PAK1 10 Prozent FBS (fötales Rinderserum) erfordert. Wie in Fig. 4A gezeigt, induzierte in einem serumfreien Medium weder -MSH noch IBMX dieMelanogenesein den WT-Zellen, obwohl die 10 Prozent FBS allein (ohne -MSH/IBMX) die induziertenMelanogenesedeutlich (um rund 60 Prozent ). Interessanterweise war die Melanogenese in SH-Transfektanten (PAK1--defiziente Zellen) in Gegenwart oder Abwesenheit von Serum auf dem gleichen Niveau wie die in WT-Zellen in Abwesenheit von Serum (siehe 4B ), was darauf hindeutet, dass die Melanogenese von Serum abhängig ist erfordert auch PAK1. Um diese Annahme zu unterstützen, aktiviert Serum allein signifikant die Kinaseaktivität von PAK1 in WT-Zellen, aber die -MSH-abhängige Aktivierung von PAK1 in WT-Zellen erfordert Serum (siehe Fig. 4C).

In Bezug auf die chemische Natur des melanogenen Serumfaktors, der allein PAK1 aktiviert, spekulieren wir aus folgenden Gründen, dass es sich um PDGF (von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor) handelt: (i) Vor mehr als einem Jahrzehnt haben wir gezeigt, dass PDGF der einzige Wachstumsfaktor in ist Serum, das PAK1 durch die Transaktivierung des EGF-Rezeptors (epidermaler Wachstumsfaktor) durch den PDGF-Rezeptor aktiviert (13, 14), und vor kurzem haben andere bewiesen, dass entweder PDGF oder EGF allein tatsächlich den Rezeptor stimuliertMelanogenesevon Melanozyten (15,16).

3.5. Die Serum/PDGF-abhängige Melanogenese benötigt den EGF-Rezeptor

In einem Versuch, die spezifische chemische Natur dieses melanogenen Serumfaktors zu identifizieren, haben wir die Wirkung von entweder AG1295 (Inhibitor spezifisch für PDGF-Rezeptor) oder AG1478 (Inhibitor spezifisch für EGF-Rezeptor) auf Serumabhängige getestetMelanogenesein Melanozyten. Wie in 5 gezeigt, reduzierten entweder 2 &mgr;M AG1295 oder 400 nM AG1478 die serumabhängigen starkMelanogeneseauf das Niveau, das der grundlegenden (serumfreien) Melanogenese entspricht. Da PDGF im Serum reichlich vorhanden ist, aber nicht EGF, und AG1295 den EGF-Rezeptor nicht hemmt, während AG1478 den PDGF-Rezeptor nicht hemmt (13), ist es höchstwahrscheinlich, dass PDGF im Serum seinen Rezeptor aktiviert, der wiederum den EGF-Rezeptor transaktiviert aktiviert schließlich PAK1, das für die Serum-abhängige Melanogenese essentiell ist (Einzelheiten siehe Fig. 6). Basierend auf dieser Annahme werden wir später den wahrscheinlichsten Mechanismus diskutieren, der der offensichtlichen Synergie zwischen -MSH und Serum/PDGF für die Aktivierung von PAK1 zugrunde liegt, was zu einer robusten Melanogenese führt.

Schließlich sollte darauf hingewiesen werden, dass der "basale" Melaningehalt ohne -MSH durch die überexprimierte CA (konstitutiv aktive) Mutante von PAK1, die die T423E-Mutation trägt (siehe linkes Feld von 3 , Spur 5), nicht signifikant verändert wurde wenn es sich entweder um eine DN (dominant negative) oder inaktive Mutante handelte. Tatsächlich induzierte -MSH überhaupt keine Phosphorylierung von WT-PAK1 bei Thr 423 (Daten nicht gezeigt). Daraus konnte geschlossen werden, dass die Autophosphorylierung von PAK1 bei Thr 423 nichts mit der -MSH-induzierten Aktivierung von PAK1 zu tun hat, was zu der Robustheit führtMelanogenesein Melanomzellen. Da bekannt ist, dass die T423E-Mutante von PAK1 hochgradig onkogen ist (6), könnte die Autophosphorylierung bei Thr 423 vielleicht einen Wechsel von einer "melanogenen" zu einer "onkogenen" Signalübertragung bewirken.

4. Diskussion

Aus unserer Beobachtung sowohl der PAK1--abhängigen als auch der PAK4--abhängigen Melanogenese in Melanozyten/Melanomzellen ergeben sich zwei potenziell interessante Probleme, auf die hingewiesen werden sollte: (i) Die "spezifische" melanogene Aktivität von PAK1 ( nur geringfügig exprimiert) muss viel höher sein als die von PAK4 (stark exprimiert) in Melanomzellen. (ii) Es scheint, dass PAK1 hauptsächlich für die Serum-induzierte Melanogenese verantwortlich ist, während PAK4 hauptsächlich für die intrinsische (basale) Melanogenese verantwortlich ist.Melanogenese. Mit anderen Worten, obwohl PAK4--Mangel bei Mäusen embryonal tödlich ist, während PAK1--Mangel allein keine "Albino"-Mäuse hervorbringt, ist der offensichtliche Unterschied in der ursprünglichen Hautfarbe (basicMelanogenese) zwischen Schwarzen und Weißen könnte zumindest teilweise den Unterschied im Expressionsniveau von PAK4 sowie den Unterschied im Melanogenitätsniveau widerspiegelnTyrosinases.

In vivo haben wir mit HRM-2-Mäusen (pigmentiert, aber haarlos) kürzlich gezeigt, dass eine Creme mit 10 μM PF3758309 (PAK1/PAK4--Inhibitor) die UV-induzierte Melanogenese in ihrer Haut auf das reduziert Basalspiegel, wobei noch zu klären bleibt, ob PAK4 oder PAK1 für die UV-Induktion der Melanogenese verantwortlich ist (8). Da PAK1 für die induzierbare, aber nicht für die basale Melanogenese verantwortlich ist, wäre es wert zu testen, ob PAK1 signifikant zur UV-induzierbaren beiträgtMelanogenese(Sonnenbräunen) unter Verwendung der seltenen Mutante PAK1 KO (knock out), die vom C57B16-Mäusestamm mit dunklen Haaren und Augen stammt (Hong He et al., unveröffentlichte Beobachtung), um zu verstehen, ob eine Vielzahl von pflanzlichen PAK1 Blocker in Kosmetika sind für Sonnenschutzmittel sinnvoll oder nicht. Interessanterweise wurde berichtet, dass PAK1 durch UV-Strahlung und andere DNA-schädigende Mittel aktiviert wird (17).

Es wurde gezeigt, dass -MSH die Tyr-Kinase JAK2 (18) aktiviert, die wiederum PAK1 durch die Phosphorylierung an Tyr 285 (anstelle von Thr 423) aktiviert, was zur PIX-PAK1-Wechselwirkung führt (19). Dies könnte erklären, warum weder die -MSH-abhängige Aktivierung von PAK1 noch die Melanogenese die Autophosphorylierung von PAK1 bei Thr 423 beinhaltet. Daher haben wir kürzlich untersucht, ob die PAK1--abhängige Melanogenese durch ein starkes pflanzliches JAK2- blockiert wird. Inhibitor namens Cucurbitacin I (CBI) aus Bittermelone (Goya), der direkt JAK2 (20) hemmt, und fand heraus, dass CBI das hemmtMelanogenesein Anwesenheit melanogener Hormone um mehr als 70 Prozent, was auf die Möglichkeit hindeutet, dass CBI nicht nur PAK1, sondern auch PAK4 blockiert (5). In diesem Zusammenhang wäre es von großem Interesse festzustellen, dass die pflanzlichen PAK1--Blocker wie CAPE, Curcumin, Shikonin und FTY 720 die -MSH-induzierte Melanogenese in Maus- oder menschlichen Hautzellen nur etwa hemmen konnten 50 Prozent sogar bei ihren Konzentrationen, bei denen PAK1 fast vollständig blockiert ist (1,2), während der synthetische Pan-PAK-Blocker PF3758309, der sowohl PAK1 als auch PAK4 hemmt, dies aufhebtMelanogenesein Hautzellen um rund 90 Prozent bei 300 nM (8). Mit anderen Worten, das -MSH-induzierte melanogene System in Melanozyten könnte die PAK1--spezifischen Blocker von Pan-PAK-Blockern unterscheiden. Bisher wurden keine pflanzlichen PAK4--spezifischen Blocker (außer PAK4--spezifischen siRNAs) identifiziert. Kürzlich wurde jedoch gezeigt, dass ein sehr wirksames Quassinoid namens Glaucarubinon, das aus einem im Amazonas-Dschungel gewachsenen Bitterbaum stammt, sowohl PAK1 als auch PAK4 blockiert und das Wachstum von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen sowohl in vitro als auch in vivo hemmt (21). Daher wäre es von großem Interesse zu testen, ob dieser pflanzliche PAK-Blocker die Melanogenese von Hautzellen fast vollständig unterdrückt, wie dies bei PF3758309 der Fall ist.

Das Hauptziel dieser Studie war es, sich auf die spezifische melanogene Rolle von PAK1 zu konzentrieren und nicht im Detail zu untersuchen, wie PAK1 den melanogenen Signalweg einschließlich melanogener Enzyme und MTFs aktiviert. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, dass PAK1 direkt Beta-Catenin aktiviert, indem es an Ser 675 phosphoryliert, was zur Aktivierung von MITF führt, das für die Expression von Genen, die für melanogene Enzyme kodieren, wesentlich ist, wie zTyrosinase(Tyr).

Kürzlich fanden wir heraus, dass auch PAK4 (CDC42--abhängige Kinase 4) daran beteiligt istMelanogenesederselben Melanomzelllinie durch Aktivierung von zwei Transkriptionsfaktoren, CREB und Beta-Catenin, die beide für die MIFT-Aktivierung essentiell sind (8). Da bekannt ist, dass CREB durch LIM-Kinase aktiviert wird (22,23), die wie beta-Catenin zu den gemeinsamen direkten Substraten sowohl von PAK1 als auch von PAK4 gehört (6,18), ist es höchstwahrscheinlich, dass PAK1 und PAK4 dasselbe CREB teilen /beta-catenin-MITF-Signalwege zur Aktivierung der melanogenen Enzymgene.

Die detaillierten Signalwege, die zur -MSH/IBMX-abhängigen Aktivierung von PAK1 führen, könnten sich jedoch signifikant von denen unterscheiden, die zur Aktivierung von PAK4 führen, hauptsächlich weil ersterer den Serumfaktor (PDGF) involviert. Das Serum allein ist in der Lage, PAK1 zu aktivieren (13) und verstärkt auch die -MSH/IBMX-abhängige Aktivierung von PAK1. Mit anderen Worten, es gibt eine klare Synergie zwischen dem Serum und diesen melanogenen Hormonen sowohl bei der PAK1-Aktivierung als auch bei der PAK1-AktivierungMelanogenese.

Das Folgende ist unsere Arbeitshypothese, wie diese Synergie stattfinden könnte. Der Hauptsignalweg, der zur PAK1-Aktivierung führt, ist die onkogene EGFR (epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor)-RAS-PI 3 -Kinase-RAC/CDC42-PAK1-Kaskade. Diese Kaskade allein reicht jedoch nicht für die vollständige Aktivierung aus. Es benötigt einen weiteren Faktor namens PIX, ein SH3-Adapterprotein, das über sein Pro-reiches Motiv aus 18 Aminosäuren namens PAK18 direkt an PAK1 bindet. Die PIX-PAK1-Interaktion benötigt ein drittes Protein namens JAK2, eine Tyr-Kinase, die PAK1 an Tyr 285 phosphoryliert. RAS reguliert JAK2 durch Prolaktin hoch. Nach einigen früheren Erkenntnissen von uns und anderen (13-16) ist PDGF (von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor) der wichtigste melanogene Serumfaktor, der für die -MSH/IBMX-induzierten essentiell istMelanogenese, weil es seinen Rezeptor (PDGFR) Tyr-Kinase aktiviert, die wiederum EGFR (epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor=ErbB1) Tyr-Kinase transaktiviert, was zur Aktivierung von PAK1 durch die onkogene RAS-PI3-Kinase-RAC führt /CDC42-Weg (13). Somit kann PDGF im Serum allein PAK1 aktivieren und Melanogenese bis zur Hälfte induzieren. Für die vollständige Aktivierung der PAK1--abhängigen Melanogenese ist jedoch -MSH/IBMX erforderlich, um JAK2 über einen cAMP-abhängigen Weg (der PKA beinhalten könnte) zu aktivieren, der schließlich die PIX-PAK1-Interaktion sichert (für Einzelheiten siehe siehe Abbildung 6).

Abschließend präsentieren wir hier den allerersten biochemischen Beweis, der erklären könnte, wie eine Vielzahl von pflanzlichen PAK1--Blockern wie CAPE, Curcumin und Shikonin in kosmetischen Cremes zur "Hautaufhellung"-Effekte. Eine Reihe analoger Studien mit menschlichen Melanozyten wird für weitere Beweise oder Bestätigungen erwartet.

Maca-Ginseng-Cistanche

Verweise

1. Lee JH, Jang JY, Park C, Kim BW, Choi YH, Choi BT. Curcumin unterdrückt die Alpha-Melanozyten-stimulierende Hormon-stimulierte Melanogenese in B16F10-Zellen. Int. J. Mol. Med. 2010; 26:101-106.

2. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. Kaffeesäurephenethylester hemmt die Alpha-Melanozyten-stimulierende Hormon-induzierte Melaninsynthese durch Unterdrückung der Transaktivierungsaktivität des Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors. J Nat Prod. 2013; 76: 1399-1405.

3. Maruta H. Pflanzliche Therapeutika, die die onkogene Kinase PAK1 blockieren: Ein praktischer Ansatz für PAK1--abhängige Krankheiten und Langlebigkeit. Phytother-Res. 2014; 28: 656-672.

4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Mehrere pflanzliche Verbindungen in Okinawa-Pflanzen hemmen direkt die onkogene/alternde Kinase PAK1. Droge Discov Ther. 2014; 8: 238-244.

5. Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Kombination aus Immunpräzipitation (IP)-ATP_Glo-Kinase-Assay und Melanogenese zur Bewertung wirksamer und sicherer PAK1--Blocker in Zellkulturen . Droge Discov Ther. 2015; 9: 289-295.

6. He H, Maruta H. Onkogenität von PAKs und ihren Substraten. In: PAKs, RAC/CDC42 (p21)-aktivierte Kinasen: Hin zur Heilung von Krebs und anderen PAK-abhängigen Krankheiten (Maruta H, Hrsg.). Elsevier, Oxford, 2013; S. 23-51.

7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lessnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. -Catenin-induziertes Melanomwachstum erfordert den nachgeschalteten Ziel-Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktor. J CellBiol. 2002; 158: 1079-1087.

8. Yun CY, You ST, Kim JH, Chung JH, Han SB, Shin EY, Kim EG. p21-aktivierte Kinase 4 reguliert die Melanogenese entscheidend über die Aktivierung der CREB/MITF- und -catenin/MITF-Wege. J Invest Dermatol. 2015; 135: 1385-1394.

9. Huynh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P21--aktivierte Kinase 1 stimuliert das Wachstum und die Migration/Invasion von Dickdarmkrebszellen über ERK- und AKT-abhängige Wege. Biochim Biophys Acta. 2010; 1803: 1106-1113.

10. F. Tagliati, A. Bottoni, A. Bosetti, MC Zatelli, EC degli Uberti. Nutzung der Lumineszenztechnologie zur Entwicklung eines Kinase-Assays: Cdk4 als Modellsystem. J Pharm Biomed Anal. 2005; 39:811-814.11. Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. Hemmende Wirkung von aus Ecklonia cava isolierten Phlorotanninen auf Pilz-Tyrosinase-Aktivität und Melaninbildung in Maus-B16F10-Melanomzellen. J Agric FoodChem. 2009; 57: 4124-4129.

12. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein hemmt die Melanogenese durch Aktivierung des ERK-Signalwegs. Int. J. Mol. Med. 2010; 25:923-927.

13. He H., Levitzki A., Zhu H. J., Walker F., Burgess A., Maruta H. Der aus Blutplättchen stammende Wachstumsfaktor erfordert einen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor, um die Kinasen der p21--aktivierten Kinasefamilie zu aktivieren. JBiolChem. 2001; 276: 26741-26744.

14. Y. Saito, J. Händeler, Y. Hojo, K. Yamamoto, BC Berk. Rezeptor-Heterodimerisierung: Wesentlicher Mechanismus für die Transaktivierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors, der durch Blutplättchen-Wachstumsfaktor induzierte wird. Mol Cell Biol. 2001; 21: 6387-6394.

15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. Der von Blutplättchen stammende Wachstumsfaktor reguliert die Proliferation und Differenzierung menschlicher Melanozyten in einer differenzierungsstadienspezifischen Weise. J Dermatol Sci. 2016; 83: 200-209.

16. Garcez RC, Teixeira BL, Schmitt Sdos S, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) fördert die in-vitro-Differenzierung von Neuralleistenzellen zu Neuronen und Melanozyten. Zelle Mol Neurobiol. 2009; 29:1087-1091.

17. Roig J., Traugh JA. p21-aktivierte Proteinkinase Gamma PAK wird durch ionisierende Strahlung und andere DNA-schädigende Mittel aktiviert. Ähnlichkeiten und Unterschiede zu alpha PAK. JBiolChem. 1999; 274: 31119-31122.

18. Buggy JJ. Die Bindung des Alpha-Melanozyten-stimulierenden Hormons an seinen G-Protein-gekoppelten Rezeptor auf B-Lymphozyten aktiviert den Jak/STAT-Weg. Biochem J. 1998; 331: 211-216.

19. Hammer A, Oladimeji P, De Las Casas LE, Diakonova M. Die Phosphorylierung von Tyrosin 285 von PAK1 erleichtert die PIX/GIT1-Bindung und den Adhäsionsumsatz. FASEB J. 2015; 29:943-959.

20. MA Blaskovich, J. Sun, A. Cantor, J. Turkson, R. Jove, SM Sebti. Entdeckung von JSI-124 (Cucurbitacin I), einem selektiven Januskinase/Signalwandler und Aktivator des Inhibitors des Transkriptions-3-Signalwegs mit starker Antitumoraktivität gegen menschliche und murine Krebszellen in Mäusen. Krebsres. 2003; 63: 1270-1279.

21. D. Yeo, N. Huynh, JA Beutler, C. Christophi, A. Shulkes, GS Baldwin, M. Nikfarjam, H. He. Krebs Lett. 2014; 346: 264-272.

22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. Zytoskelettveränderungen, die durch die Serin/Threonin-Kinase PAK4 reguliert werden, werden durch LIM-Kinase 1 und Cofilin vermittelt. JBiolChem. 2001; 276: 32115-32121.

23. Yang EJ, Yoon JH, Min DS, Chung KC. LIM-Kinase 1 aktiviert cAMP-responsives Element-bindendes Protein während der neuronalen Differenzierung von immortalisierten Hippocampus-Vorläuferzellen. JBiolChem. 2004; 279: 8903-8910.