Die Tyrosinkinase C-Abl verstärkt die Interferon-vermittelte antivirale Immunität durch STAT1-Phosphorylierung

ZUSAMMENFASSUNG

Die durch Interferon (IFN) induzierte Aktivierung des Signalwandlers und Aktivators der Transkriptionsfamilie (STAT) ist ein wichtiges Ereignis bei der antiviralen Immunität. Hier zeigen wir, dass die Nichtrezeptorkinasen c-Abl und Arg direkt mit STAT1 interagieren und die Phosphorylierung von STAT1 auf Y701 verstärken. c-Abl/Arg könnte die STAT1-Phosphorylierung unabhängig von Janus-Kinasen in Abwesenheit von IFNg vermitteln und die IFNg-vermittelte STAT1-Phosphorylierung verstärken. Darüber hinaus werden die STAT1-Dimerisierung, die nukleare Translokation und die nachgeschaltete Gentranskription durch c-Abl/Arg reguliert. Ein Mangel an c-Abl/Arg (abl1/abl2) unterdrückt die antiviralen Reaktionen in mit dem vesikulären Stomatitis-Virus infizierten Zellen erheblich. Im Vergleich zum Vehikel führte die Verabreichung des c-Abl/Arg-selektiven Inhibitors AMN107 zu einer deutlich erhöhten Mortalität bei Mäusen, die mit dem menschlichen Influenzavirus infiziert waren. Unsere Studie zeigt, dass c-Abl eine wesentliche Rolle im STAT1-Aktivierungssignalweg spielt und einen wichtigen Ansatz zur Regulierung der antiviralen Immunität bietet.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

EINFÜHRUNG

Interferone (IFNs) spielen eine Schlüsselrolle bei der angeborenen Immunität gegen Virusinfektionen und der Immunüberwachung, indem sie die Aktivierung von Januskinasen (JAKs) und Signaltransducer und Aktivator der Transkription (STAT) regulieren und die zelluläre Genexpression neu programmieren (Stark und Darnell, 2012). Die Bindung von IFNs an ihre jeweiligen Rezeptoren führt zur Kreuzphosphorylierung von drei assoziierten JAKs (JAK1, JAK2 und TYK2) und zur Rekrutierung von STATs, wodurch einzelne Tyrosinreste in der Nähe der C-terminalen Enden dieser STATs durch JAKs phosphoryliert werden können (Platanias, 2005). Die aktivierten STATs dimerisieren dann, wandern in den Zellkern und binden an die Promotoren IFN-responsiver Gene, um deren Transkription zu induzieren. Die Tyrosinphosphorylierung von STATs ist ein wesentlicher Schritt im JAK-STAT-Signalweg der IFN-Signalisierung und ist an der STAT-Dimerisierung, der nuklearen Translokation und der DNA-Bindung beteiligt (Stark und Darnell, 2012). Somit fungiert die Tyrosinphosphorylierung als STAT-Aktivierungsschalter. Durch die gezielte Störung von JAK-Genen in Mäusen gewonnene Erkenntnisse legen nahe, dass JAKs die wichtigsten STAT-Tyrosinkinasen sind (Villarino et al., 2017). Es wurde jedoch auch gezeigt, dass Tyrosinreste in STAT1, STAT3 und STAT5 in JAK-defizienten Zellen durch Rezeptoren des epidermalen Wachstumsfaktors und des aus Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktors mit intrinsischer Tyrosinkinaseaktivität phosphoryliert werden (Leaman et al., 1996; Vignais et al ., 1996). Darüber hinaus wurde eine konstitutive Aktivierung von STATs in transformierten Zellen beobachtet, die onkogene Tyrosinkinasen wie v-Src, v-Abl und BCR-Abl exprimieren. Ob STATs jedoch die direkten Substrate dieser Kinasen sind, muss noch ermittelt werden (Danial und Rothman). , 2000; Reddy et al., 2000). Die vom c-abl (abl1)-Gen kodierte Säugetier-Abelson-Kinase c-Abl und das vom arg (abl2)-Gen kodierte Abl-verwandte Genprotein Arg gehören zu einer Familie intrazellulärer Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen, die für mehrere zelluläre Prozesse erforderlich sind. einschließlich Proliferation, Apoptose, Adhäsion, Zellmigration und Stressreaktionen (Bradley und Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber et al., 2013; Pendergast, 2002). Die Kinaseaktivität von c-Abl ist unter normalen physiologischen Bedingungen streng reguliert. Retrovirale Transduktions- und chromosomale Translokationsereignisse führen zur Expression von v-Abl bzw. BCR-Abl, einer onkogenen Form von Abl (Advani und Pendergast, 2002). Darüber hinaus führt die gezielte Löschung des c-abl-Gens bei Mäusen zu pleiotropen Phänotypen, die mit einer Immunschwäche verbunden sind, einschließlich hoher perinataler Letalität, Milz- und Thymusatrophie, Lymphopenie und erhöhter Anfälligkeit für Infektionen (Schwartzberg et al., 1991). Darüber hinaus ist die Behandlung von BCR-Abl-positiver chronischer myeloischer Leukämie (CML) mit den Abl-Inhibitoren STI571 (Imatinib) und AMN107 (Nilotinib) bei einer Untergruppe von Patienten mit einer Immunsuppression verbunden (Dietz et al., 2004; Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Frühere Studien haben gezeigt, dass cAbl eine Rolle bei der Regulierung der durch TCR (T-Zellrezeptor) und BCR (B-Zellrezeptor) vermittelten Signaltransduktion, Entwicklung, Proliferation und Zytokinproduktion spielt (Gu et al., 2009; Pendergast, 2002). ; Silberman et al., 2008). Abl-defiziente Mäuse weisen auch eine verringerte Anzahl von T/B-Zellen auf (Gu et al., 2009; Liberatore und Goff, 2009; Schwartzberg et al., 1991). Die Mechanismen, die der beeinträchtigten Immunität zugrunde liegen, die bei Abwesenheit oder Hemmung von c-Abl auftritt, sind jedoch noch unklar. Es wurde weithin berichtet, dass der JAK-STAT-Signalweg für die BCR-Abl-induzierte Transformation essentiell ist (Carlesso et al., 1996; Danial et al., 1998; de Groot et al., 1999). Daher lohnt es sich zu untersuchen, ob JAK-STAT auch zur angeborenen Immunität beitragen kann, die an c-Abl beteiligt ist. Hier berichten wir, dass STAT1 auf JAK-unabhängige Weise mit c-Abl interagiert und von diesem phosphoryliert wird, wodurch die Dimerisierung, die Kernlokalisierung und die nachgeschaltete Gentranskription von STAT1 reguliert werden. Diese Ergebnisse zeigten, dass c-Abl zusätzlich zur JAK-Kinase für die vollständige Aktivierung von STAT1 und die nachfolgenden IFN-vermittelten antiviralen Reaktionen unverzichtbar ist.

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ERGEBNISSE

Die Transkription von Interferon-Gamma-aktivierten Sequenz-Downstream-Genen wird durch Abl-Kinase reguliert

Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4 wurden in c-abl/arg-Double-Knockout- (DKO) und WT-MEFs identifiziert, von denen 960 hochreguliert und 784 herunterreguliert waren (Abbildung 1A, links). Um die potenziellen zellulären Funktionen und zugehörigen Signalwege dieser DEGs weiter zu untersuchen, führten wir eine Gen-Ontologie-Analyse (GO-Analyse) durch (für Begriffe im biologischen Prozess, in der molekularen Funktion und in der zellulären Komponente) (Abbildung S1A). Die durch c-Abl und Arg herunterregulierten Gene waren hauptsächlich mit Virusabwehrreaktionen (GO: 0009615, GO: 0051607 und GO: 0045071) und Immunreaktionen (GO: 0002376, GO: 0045087) verbunden. Weitere Analysen zeigten, dass IFN-spezifische Gene (Liu et al., 2012) unter den herunterregulierten Genen angereichert waren (Abbildungen 1A, rechts und S1B). Zur Validierung der differentiellen Expressionsprofile wurden die Transkriptniveaus antiviraler Gene, einschließlich cxcl10, psmb9, tap1 und isg15, über quantitative Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktionstests (RT-PCR) bestimmt und auf die Niveaus von psma5 normalisiert , was durch c-Abl nicht stark reguliert wird. Im Vergleich zu WT-MEFs zeigten c-abl/arg/MEFs deutlich niedrigere Transkriptmengen dieser Gene, aber die DKO-induzierten Reduktionen wurden durch die c-Abl-Rettung in dosisabhängiger Weise vollständig rückgängig gemacht (Abbildungen 1B und S1C). Diese Daten legen nahe, dass eine Reihe von IFN-induzierten Genen durch c-Abl und Arg reguliert wurde. Um die wichtigsten Transkriptionselemente zu untersuchen, die durch Abl-Kinasen als Reaktion auf IFN reguliert werden, wurde ein Luciferase-Reportersystem basierend auf dem gemeinsamen bidirektionalen Promotor tap1/psmb9 konstruiert, der durch IFNg reguliert wird (Abbildung 1C). Wie erwartet hemmte der c-Abl/Arg-selektive Inhibitor AMN107 die Transkriptionsaktivität des tap1-Promotors (rot) deutlich (Abbildung 1D). Bemerkenswerterweise hatte die AMN107-Behandlung im Gegensatz zur Deletion von NFkB-wirkenden (blau) oder IFN-Konsensussequenzelementen (gelb) kaum oder gar keine Auswirkungen auf die Aktivität des tap1-Promotors, wenn das gammaaktivierte Sequenzelement (GAS) (grün) gelöscht wurde (Abbildung 1D). ). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das STAT1--zielgerichtete GAS-cis-Element an der c-Abl-regulierten tap1-Transkription beteiligt ist, was stark darauf hindeutet, dass STAT1 für die c-Abl-vermittelte Regulierung der IFN-responsiven Genexpression verantwortlich ist.

c-Abl interagiert direkt mit STAT1

Die IFN-induzierte TAP1-Expression wird durch c-Abl reguliert, möglicherweise durch STAT1, was darauf hindeutet, dass STAT1 mit c-Abl assoziiert sein könnte. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurden Lysate von MCF-7-Zellen einer Anti-c-Abl-Immunpräzipitation und anschließendem Immunblotting mit einem Anti-STAT1-Antikörper unterzogen. STAT1 war in Anti-c-Abl-, aber nicht in IgG-Immunpräzipitaten vorhanden (Abbildung 2A). Als nächstes wurden 293T-Zellen mit Myc-cAbl und Flag-STAT1 oder Flag-Vector als Kontrolle cotransfiziert. Das Vorhandensein von Myc-c-Abl in Anti-Flag-Immunpräzipitaten, die aus Zellen hergestellt wurden, die Flag-STAT1, aber nicht Flag-Vector koexprimierten, zeigte einen Zusammenhang zwischen ektopisch exprimiertem Myc-c-Abl und Flag-STAT1 (Abbildung 2B, links). Ein ähnliches Ergebnis wurde auch in einem reziproken Experiment erzielt (Abbildung 2B, rechts). Darüber hinaus interagierte das andere Mitglied der Abl-Familie, Arg (Abl2), das in seiner N-terminalen Domäne (NTD) eine hohe Homologie zu c-Abl aufweist, ebenfalls mit STAT1 (Abbildung S2A).

Abbildung 1. c-Abl reguliert die Promotoren IFN-responsiver Gene über GAS-Elemente

Als nächstes wurden Lysate, die aus Flag-c-Abl exprimierenden 293T-Zellen hergestellt wurden, mit Agarose-konjugiertem GST-STAT1 oder GST allein inkubiert, und Flag-c-Abl wurde im GST-STAT1, jedoch nicht in den GST-Adsorbaten nachgewiesen (Abbildung 2C). Um eine durch andere Komponenten in den Zelllysaten vermittelte indirekte Bindung auszuschließen, wurden Anti-Flag-Immunpräzipitate, die aus Flag-c-Abl exprimierenden 293T-Zellen hergestellt wurden, einer SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) unterzogen und die Proteine ​​auf übertragen eine PVDF-Membran (Polyvinylidenfluorid) und dann mit löslichem GST-STAT1 oder GST (als Kontrolle) geblottet. Die Ergebnisse zeigten, dass GST-STAT1, aber nicht GST, c-Abl in vitro direkt band (Abbildung 2D). Um die c-Abl-Bindungsdomäne zu definieren, wurden Agarose-konjugiertes und GST-fusioniertes STAT1 voller Länge oder verkürztes STAT1 (Abbildung 2E, oberes Feld) mit den Lysaten von 293T-Zellen inkubiert, die Flag-c-Abl exprimieren. Die Analyse der Adsorbate durch Immunblotting mit einem Anti-Flag-Antikörper zeigte, dass die Aminosäuren 577–750 von STAT1, die eine Region bilden, die die SH2-Domäne und die Transaktivierungsdomäne enthält, für die c-Abl-Wechselwirkung verantwortlich waren (Abbildung 2E, unteres Feld). . In ähnlicher Weise wurde durch den Anti-Flag-Antikörper immunpräzipitiertes Flag-STAT1 durch SDS-PAGE fraktioniert und auf eine PVDF-Membran übertragen. Anschließend wurde die Membran nur mit löslichem GST-c-Abl SH3 oder GST-c-Abl SH2 und GST geblottet. Das Ergebnis zeigte, dass die c-Abl-SH3-Domäne die Hauptdomäne war, die für die STAT1-Assoziation verantwortlich war (Abbildung 2F). Darüber hinaus wurde die In-situ-Wechselwirkung von endogenem c-Abl mit STAT1 durch den Duolink Proximity Ligation Assay (PLA) bewertet. STAT1:c-Abl-Komplexe wurden hauptsächlich im Zytoplasma beobachtet, und die Bildung dieser Komplexe wurde durch IFNg-Stimulation erheblich verstärkt (Abbildung 2G). Zusammenfassend belegen diese Ergebnisse einen direkten Zusammenhang zwischen c-Abl und STAT1 sowohl in vitro als auch in vivo.

Abbildung 2. c-Abl interagiert mit STAT1

c-Abl vermittelt die JAK-unabhängige STAT1-Phosphorylierung

Um zu untersuchen, ob STAT1 ein Substrat von c-Abl ist, wurde gereinigtes His-markiertes STAT1 mit rekombinantem c-Abl (das die katalytische Domäne bei den Aminosäuren 237–643 enthält) in Gegenwart von ATP für einen In-vitro-Kinase-Assay inkubiert. Immunoblotting des Reaktionsprodukts mit Anti-Phospho-Tyrosin und Anti-Phospho-STAT1 Y701 zeigte, dass STAT1 in vitro direkt durch c-Abl an Tyrosinresten, einschließlich Y701, phosphoryliert wurde (Abbildung 3A). Als nächstes fanden wir heraus, dass Flag-STAT1, das in 293T-Zellen exprimiert wurde, durch Myc-c-Abl, insbesondere am Rest Y701, mit Tyrosin phosphoryliert wurde, nicht jedoch durch die Kinase-inaktive Mutante Myc-c-Abl (K290R). Darüber hinaus wurde bei der Behandlung mit dem c-Abl/Arg-selektiven Inhibitor AMN107 die c-Abl-vermittelte STAT1-Phosphorylierung nahezu eliminiert, was darauf hindeutet, dass die Tyrosinphosphorylierung von STAT1 von der c-Abl-Kinaseaktivität abhängt (Abbildung 3B). Die c-Abl-vermittelte STAT1-Phosphorylierung wurde erheblich beeinträchtigt, als STAT1 Y701 durch Phenylalanin ersetzt wurde, was darauf hinweist, dass Y701 das Hauptphosphosit von Abl ist (Abbildung 3C). Darüber hinaus wurde STAT1 auch durch Arg phosphoryliert (Abbildung S2B). Um die spezifischen durch c-Abl phosphorylierten STAT1-Reste weiter abzugrenzen, wurde Flag-STAT1, das mit Myc-c-Abl koexprimiert wurde, einer Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit einer Tandem-Massenspektrometrieanalyse unterzogen. Zusätzlich zum wohldefinierten und funktionell wichtigen STAT1-Phosphosit Y701 (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993) wurden auch zwei weitere Phosphositen, Y106 und Y665, identifiziert (Abbildung S4A). Im Vergleich zu WT STAT1 zeigten sowohl Y106F- als auch Y701F-Mutanten eine beeinträchtigte Tyrosinphosphorylierung (Abbildung 3C). Allerdings wurde die Phosphorylierung von STAT1 Y701 durch die Phosphorylierung von Y106 und Y665 nicht wesentlich beeinflusst, was darauf hindeutet, dass Y106 und Y665 möglicherweise unterschiedliche Rollen spielen (Abbildung S4B). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Tyrosinreste von STAT1, einschließlich des zuvor beschriebenen Rests Y701, durch Kinasen der Abl-Familie phosphoryliert werden können.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

JAKs sind hauptsächlich für die IFN-induzierte Phosphorylierung von STAT1 Y701 verantwortlich (Villarino et al., 2017). Wie erwartet wurde die Phosphorylierung von STAT1 Y701 durch IFNg induziert und durch Ruxolitinib, einen bispezifischen Inhibitor von JAK1 und JAK2, signifikant gehemmt (Abbildung 3D). Bemerkenswerterweise wurde auch eine beeinträchtigte Y701-Phosphorylierung bei der Abl-Hemmung beobachtet (Abbildung 3D, Spur 4), was darauf hinweist, dass c-Abl teilweise zur IFNg-induzierten STAT1-Aktivierung beiträgt. Darüber hinaus wurde die Phosphorylierung von STAT1 Y701 auch durch DPH, einen zellpermeablen c-Abl-Aktivator, in geringerem Maße als durch IFNg induziert, was durch AMN107 vollständig rückgängig gemacht werden konnte (Abbildung 3E). Zur Bestätigung der DPH-induzierten Abl-Aktivierung wurde auch die Phosphorylierung von c-Abl Y412, ein Indikator für die Abl-Aktivierung, nachgewiesen (Abbildung 3E). Es wurde gezeigt, dass die Aktivierung von JAK2 zuerst erfolgt und für die anschließende Aktivierung von JAK1 erforderlich ist (Briscoe et al., 1996). Um die Auswirkung von JAK2 auf die STAT1-Aktivierung auszuschließen, haben wir über CRISPR eine jak2-KO MCF-7-Zelllinie etabliert. In jak2-KO MCF-7-Zellen wurde im Vergleich zu den parentalen MCF-7-Zellen eine verringerte, aber nachweisbare STAT1 Y701-Phosphorylierung beobachtet, die in Gegenwart von Myc-c-Abl ähnlich verstärkt werden könnte jedoch nicht Myc-c-Abl (K290R) (Abbildung 3F) und war nach der Behandlung mit AMN107 weiter verringert. In c-abl/arg/Zellen war die IFNg-induzierte Phosphorylierung von STAT1 an Y701 zeit- und dosisabhängig stark beeinträchtigt (Abbildung 3G). Alle diese Beobachtungen zeigen, dass die c-Abl-Kinase STAT1 unabhängig vom IFNg-JAK-Signalweg direkt phosphorylieren und aktivieren kann und dass, was noch wichtiger ist, diese beiden Kinasen synergistische Wirkungen auf die STAT1-Phosphorylierung bei Y701 haben könnten.

Abbildung 3. STAT1 wird durch c-Abl phosphoryliert

Abbildung 4. c-Abl fördert die Bildung des STAT1-Dimers und den Kernimport

Die durch c-Abl vermittelte Phosphorylierung reguliert die STAT1-Transaktivierungsaktivität

Die Tyrosinphosphorylierung von STATs ist ein wesentlicher Schritt im JAK-STAT-Weg der IFN-Signalübertragung und ist an der STAT-Dimerisierung, der nuklearen Translokation und der DNA-Bindung beteiligt. Um zu untersuchen, ob die c-Abl-vermittelte Phosphorylierung die STAT-Dimerisierung reguliert, wurden GFP-STAT1 und Flag-STAT1 in 293T-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Myc-c-Abl koexprimiert. Die GFP-STAT1-Spiegel in Anti-Flag-Immunpräzipitaten wurden untersucht, um eine STAT1-Dimerisierung anzuzeigen. Wie in Abbildung 4A gezeigt, verstärkte die Koexpression von c-Abl die Bildung von STAT1-STAT1-Homodimeren. Immunfluoreszenzmikroskopie von MCF-7-Zellen zeigte außerdem, dass die Ablation von c-abl/arg oder die Behandlung mit AMN107 die IFNg-induzierte STAT1-Kerntranslokation signifikant beeinträchtigte (Abbildungen 4B und 4C).

Darüber hinaus wurden Elektromobilitäts-Shift-Assays eingesetzt, um die Promotorbindungsaktivität von STAT1 zu analysieren. Als Nachweissonde wurde eine mit Biotin markierte IRF1-Promotorregion verwendet, die die STAT1-Bindungskonsensussequenz enthielt (Aaronson und Horvath, 2002). Diese Sonde wurde mit Kernextrakten von 293T-Zellen inkubiert, die exogen STAT1 mit oder ohne c-Abl exprimierten, was anhand von Abbildung S5A ausgeglichen wurde. Wie in Abbildung 4D gezeigt, wurden zahlreiche IRF1-Sonden-gebundene Komplexe, die STAT1 enthielten, in Kernextrakten beobachtet (Abbildung 4D, Spur 1). Die Komplexbildung nahm mit der IFNg-Behandlung leicht zu (Abbildung 4D, Spur 2) und nahm in Zellen, die c-Abl ektopisch exprimierten, signifikant zu (Abbildung 4D, Spur 3). Im Vergleich zu WT STAT1 zeigte c-Abl jedoch kaum oder gar keinen Einfluss auf die Promotorbindung von STAT1, das Y701F beherbergt (Abbildung 4D, Spuren 7 und 8), während Y106F- und Y665F-Mutationen nahezu keinen Unterschied zu WT STAT1 zeigten. Die Spezifität der Komplexe, die STAT1 und die Nachweissonde enthielten, wurde durch Zugabe einer nicht markierten Konkurrenzsonde bestätigt (Abbildung 4D, Spur 9). Darüber hinaus führte die Zugabe eines Anti-STAT1-Antikörpers zur Bildung einer superverschobenen Bande (Abbildung 4D, Spur 11). Als die markierten Sonden mit Kernextrakten von 293T-Zellen als Kontrolle inkubiert wurden, wurden keine Komplexe beobachtet (Abbildung 4D, Spur 10). Diese Ergebnisse zeigen, dass die c-Abl-vermittelte Phosphorylierung von STAT1 Y701 die Bindung von STAT1 an seine Zielpromotoren verstärkt.

Abbildung 5. c-Abl reguliert die IFN-bezogene Genexpression

Anschließend wurde die IFNg-induzierte Transaktivierung der wichtigsten STAT1--regulierten Gene, einschließlich ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 und tap1, in WT oder c-abl/ bewertet. arg DKO MCF-7-Zellen über RT-PCR. Wie erwartet wurde die Gentranskription durch die c-abl/arg-Depletion erheblich beeinträchtigt (Abbildung 5A). Darüber hinaus konnten Gene, die typischerweise durch IFNg und IFNa induziert werden, in Gegenwart von AMN107 nicht durch IFNs stimuliert werden (Abbildungen 5B und 5C). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Transaktivierungsaktivität von STAT1 durch c-Abl positiv reguliert wird.

c-Abl fördert IFN-abhängige antivirale Wirkungen

TAP1 und PSMB9 sind an der Produktion und Präsentation von Peptiden im MHC-Klasse-I-Antigenverarbeitungsweg beteiligt (Ghannam et al., 2014; Vitale et al., 1998). In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen wurde die Antigenpräsentation von Ovalbumin durch JAWS II-Zellen gegenüber B3Z-Zellen durch AMN107 aufgrund der verringerten IL2-Produktion deutlich unterdrückt (Abbildung 6A). Um die antiviralen biologischen Konsequenzen der STAT1-Regulation durch c-Abl, WT und c-abl/arg/MEFs weiter zu bewerten, wurden sie mit oder ohne seriell verdünntem IFNg vorbehandelt und mit dem vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) infiziert. Eine VSV-Infektion verursachte einen schwereren Zelltod in mit AMN107 behandelten c-abl/arg/MEFs und WT-Zellen als in mit Vehikeln behandelten WT-MEFs (Abbildung 6B). Die IFNg-Behandlung verringerte den durch eine Virusinfektion verursachten Zelltod deutlich, hatte jedoch in Gegenwart von AMN107 eine weitaus weniger ausgeprägte Wirkung. In Übereinstimmung mit diesem Befund führte die c-Abl/Arg-Ablation in MEFs zu einer Unempfindlichkeit gegenüber der IFN-Stimulation, dieser Effekt wurde jedoch durch die c-Abl-Rescue deutlich umgekehrt (Abbildung 6B). Als nächstes wurden A549-Zellen, die mit oder ohne AMN107 behandelt wurden, mit dem Newcastle-Disease-Virus (NDV) infiziert, das GFP exprimiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Virusreplikation ebenfalls durch die AMN107-Behandlung verstärkt, aber durch die c-Abl-Expression unterdrückt wurde (Abbildung 6C). In Übereinstimmung mit der Erkenntnis, dass die DNA-Transfektion zur Aktivierung der endogenen IFN-Antwort führt (Park et al., 2003), hemmte die Transfektion mit dem pcDNA-Vektor die Virusproliferation. Bemerkenswerterweise führte die Transfektion mit Flag-c-Abl zu einer stärkeren Hemmwirkung auf die Virusproliferation als die Transfektion mit einem leeren Vektor (Abbildung 6C). Darüber hinaus hatte die IFNg-Behandlung in Gegenwart des c-Abl-selektiven Inhibitors AMN107 kaum oder gar keine Auswirkungen auf die Virusinfektion (Abbildung 6D). Diese Daten legen nahe, dass c-Abl eine wichtige Rolle bei STAT1-vermittelten antiviralen Wirkungen spielt. Als nächstes untersuchten wir die Rolle von c-Abl bei Virusinfektionen in Call/fl-Lck-Cre-Mäusen (c-abl-conditional knockout, c-abl-cKO), bei denen c-abl spezifisch in Thymozyten ausgeschaltet wurde (Abbildung S7A). ), da das Ausschalten des c-abl-Gens in der Keimbahn zum Laufen und zum Tod innerhalb der ersten zwei Wochen nach der Geburt führt (Koleske et al., 1998; Schwartzberg et al., 1991). Anschließend wurden WT- und c-abl-cKO-Mäuse intranasal mit dem Influenza-A-Virus (IAV) infiziert. Bei c-abl-cKO-Mäusen wurde eine statistisch nicht signifikant höhere Mortalität beobachtet als bei WT-Mäusen. WT-Mäusen, denen kontinuierlich AMN107 verabreicht wurde, das c-Abl/Arg-Kinasen in allen Geweben systematisch unterdrückt, zeigte eine deutlich erhöhte Empfindlichkeit gegenüber IAV (Abbildung 6E). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass c-Abl für die antivirale Immunität bei Tieren erforderlich ist.

Abbildung 6. c-Abl fördert IFN-abhängige antivirale Wirkungen

DISKUSSION

IFNg ist eines der wichtigsten immunmodulierenden Zytokine und spielt eine entscheidende Rolle bei der angeborenen Immunität gegen Virusinfektionen. Bei der kanonischen IFNg-Signalisierung werden JAK1 und JAK2 bei IFNg-Stimulation an den zytoplasmatischen Enden aggregierter IFNg-Rezeptoren (IFNGRs) rekrutiert und durch sequentielle Autophosphorylierungs- und Transphosphorylierungsereignisse aktiviert (Stark, 2007; Villarino et al., 2017). Anschließend dockt STAT1 an IFNGR an, indem seine SH2-Domäne mit einer Erkennungssequenz in IFNGR (Y440DKPH444) assoziiert wird, in der Y440 durch JAKs phosphoryliert wird (Greenlund et al., 1995). Nach seiner Phosphorylierung an Y701 durch JAKs dimerisiert STAT1 und verlagert sich in den Zellkern, wo es die Transkription einer Reihe von IFNg-responsiven Genen fördert (Aaronson und Horvath, 2002; Stark und Darnell, 2012). Die Stat1-Ablation bei Mäusen führt zu einem Fehlen von Transkriptionsreaktionen auf IFN und einem Mangel an IFN-induzierten antimikrobiellen und antiviralen Aktivitäten in Zellen (Meraz et al., 1996). Stat1/Mäuse zeigen auch eine erhöhte Anfälligkeit für die Entwicklung spontaner und chemischer (3-Methylcholanthren)-induzierter Tumoren (Kaplan et al., 1998) und eine Überempfindlichkeit gegenüber bestimmten entzündlichen Pathologien (Bettelli et al., 2004; Villarino et al ., 2010). Darüber hinaus schützt die STAT1-Signalübertragung T-Zellen vor der durch natürliche Killerzellen vermittelten Zytotoxizität (Kang et al., 2019).Diese Ergebnisse legen nahe, dass STAT1 die Aktivierung des angeborenen Immunsystems und die Tumorimmunität vermittelt.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

Schlatterer et al. berichteten, dass c-Abl, aber nicht Arg, einen neuronalen Verlust auslösen könnte, indem es die STAT1-Aktivierung und die Interferonproduktion auslöst. Der genaue Mechanismus, der für die c-Abl-abhängige STAT1-Aktivierung verantwortlich ist, wurde jedoch nicht aufgeklärt (Schlatterer et al., 2012). Hier zeigen wir, dass c-Abl STAT1 bindet und phosphoryliert und in vitro direkt mit STAT2 interagiert (Abbildungen 2 und 3, S8A, S9A und S10A). STAT1 Y701 wird ausschließlich durch JAK-Kinasen phosphoryliert, was die Bildung des STAT1-Dimers (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993) und den nukleozytoplasmatischen Shuttle während der IFNg-Signalisierung (Mao et al., 2005; Mertens et al., 2006; Zhong et al., 2005). Unsere Studie ergab unerwartet, dass c-Abl, eine andere Kinase neben JAKs, auch unabhängig zur Phosphorylierung von STAT1 Y701 beiträgt (Abbildung 3). Obwohl die c-Abl-vermittelte Y701-Phosphorylierung nicht so stark ist wie die von JAKs, scheint sie für Y701 notwendig zu sein, um die maximale Phosphorylierung zu erreichen, da in c-abl/arg/Zellen bei IFNg-Stimulus eine stark beeinträchtigte Y701-Phosphorylierung beobachtet wurde und IFNg- Die induzierte Phosphorylierung von STAT1 Y701 wurde durch AMN107 dosisabhängig von 1,25 mM auf 5 mM gehemmt (Abbildungen 3G und S11A). Allerdings wird die Y701-Phosphorylierung nicht wesentlich durch den Phosphorylierungszustand von Y106 und Y665, den anderen beiden Phosphosites von c-Abl, beeinflusst, was darauf hindeutet, dass eine verstärkte STAT1-Y701-Phosphorylierung nicht aus einer c-Abl-vermittelten Multi-Site-Phosphorylierung von STAT1 resultiert, sondern möglicherweise auf eine erhöhte JAK-Aktivität zurückgeführt. Frühere Studien haben gezeigt, dass in BCR-Abl-exprimierenden Zellen eine konstitutive Aktivierung von JAK1 und eine variable Aktivierung von JAK2 beobachtet wurden (Chai et al., 1997; Henderson et al., 1997; Shuai et al., 1996). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass BCR-Abl STAT1 und STAT2 durch die Tyrosinphosphorylierung von JAK1, JAK2 und JAK3 geringfügig aktiviert (Henderson et al., 1997). Aktuelle Erkenntnisse belegen, dass Abl und JAKs ausgeprägte synergistische Wirkungen auf die STAT1-Phosphorylierung bei Y701 haben könnten (Abbildung 3E).

Zusätzlich zu Y701 wurde gleichzeitig die Phosphorylierung von Y106 und Y665 identifiziert (Abbildungen 3C und S4A). Diese Phosphosite waren nicht an der Phosphorylierung oder Homodimerisierung von STAT1 Y701 beteiligt (Abbildungen S4B und S4C). Murphy und Kollegen fanden jedoch heraus, dass die Interaktion zwischen den NTDs (N-terminale Protein-Interaktionsdomäne, Aminosäuren 1–136) von Monomeren für die Dimerisierung nichtphosphorylierter STAT-Moleküle voller Länge notwendig ist (Ota et al., 2004). STAT1-Mutanten (F77A und/oder L78A) bilden keine nichtphosphorylierten Dimere, und diese Mutanten zeigen eine phänotypbeständige Phosphorylierung in IFN-behandelten Zellen und eine Resistenz gegenüber TC45--vermittelter Dephosphorylierung in vitro (Mertens et al., 2006). Y106 im NTD, das sich in der Nähe von F77 und L78 befindet, ist möglicherweise dafür verantwortlich, dass STAT1 in einem phosphorylierten Dimerzustand bleibt und dass STAT1 im Zellkern unter ionisierender Strahlung erhalten bleibt (Abbildungen S6A und S6B). Darüber hinaus interagiert die SH2-Domäne mit der phosphorylierten Tyrosin-haltigen Domäne, wenn die Bildung phosphorylierter Homodimere durch IFN induziert wird (Shuai et al., 1994). Y665, das in der SH2-Domäne liegt, kann die Dimerisierung beeinflussen. Die Funktionen der c-Abl-vermittelten Phosphorylierungsstellen (Y106 und Y665) erfordern weitere Untersuchungen.

Ähnlich wie bei JAKs reguliert die c-Abl-vermittelte Phosphorylierung die Bildung des STAT1-Dimers (einschließlich der Bildung des STAT1- STAT1-Homodimers und des STAT1-STAT2-Heterodimers (Abbildungen 4A, S12A und S12B)), die Kerntranslokation und die DNA-Bindung und Transkription von IFN-stimulierten Genen. Die Abl-Störung trug zu einer verstärkten Virusproliferation und einem erhöhten virusinduzierten Zelltod bei (Abbildungen 6B, 6C und 6D). Darüber hinaus fanden wir heraus, dass ionisierende Strahlung (IR) die nukleare Translokation von STAT1 in Abwesenheit des c-Abl-Inhibitors induzierte (Abbildungen S6A und S6B). IR aktiviert c-Abl direkt (Pendergast, 2002) und anschließend die STAT1-abhängige IFNg-Signalisierung, die möglicherweise einen zugrunde liegenden Mechanismus darstellt, durch den die Strahlentherapie einen IFN-kaskadierenden angeborenen und adaptiven Immunangriff auf den Tumor auslöst (Burnette et al ., 2011) und bietet einen stärkeren angeborenen Immunstatus als Reaktion auf IR-Reize. Im Vergleich zu WT-Wurfgeschwistern zeigten Mäuse, bei denen c-abl in Thymozyten bedingt ausgeschaltet war, eine höhere, aber statistisch nicht signifikante Mortalität. Bemerkenswert ist, dass Mäuse, denen systematisch der c-Abl/Arg-Inhibitor AMN107 verabreicht wurde, eine höhere Mortalität aufwiesen (Abbildung 6E), was darauf hindeutet, dass die c-Abl-Expression in einer Vielzahl von Geweben zur antiviralen Immunität bei Tieren beitrug. Aufgrund dieser Daten legen wir nahe, dass endogenes Abl eine latente Grundresistenz gegen Virusinfektionen bietet und dass aktiviertes Abl, das durch ionisierende Strahlung stimuliert wird, Zellen abschirmt. Abl-Kinasen sind bei den meisten Patienten mit CML konstitutiv aktiviert. Die Abl-Kinase-Inhibitoren STI571 und AMN107 stellen die Erstlinientherapie für die CML-Therapie dar. Allerdings werden häufig Infektionen der oberen Atemwege und Immunsuppression beobachtet, die durch die Unterdrückung des STAT-vermittelten Immunregulationswegs verursacht werden können (Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Unsere Erkenntnisse lieferten eine theoretische Grundlage zur Optimierung der Therapie.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

Zusammenfassend wurde festgestellt, dass die Tyrosinkinase c-Abl in vivo und in vitro mit STAT1 assoziiert, die STAT1-Phosphorylierung an Y701 unabhängig von JAKs fördert, die Transaktivierung verstärkt und angeborene Immunantworten gegen Infektionen vermittelt, insbesondere im Zusammenhang mit c -Abl-bedingter Stress. Unser Befund bietet einen ergänzenden Ansatz für die STAT1-Aktivierung, der zum wachsenden Wissensschatz über die Regulierung des IFN-Downstream-Signalwegs beiträgt.

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