Der COVID-19-MRNA-Impfstoff schützt vor SARS-CoV-2 Omicron BA.1-Infektion bei ernährungsbedingt fettleibigen Mäusen durch die Verstärkung der angeborenen antiviralen Reaktionen des Wirts
Dec 06, 2023
Zusammenfassung
Hintergrund
Fettleibigkeit ist eine weltweite Epidemie und gilt als Risikofaktor für eine schwere Manifestation der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19). Die Pathogenität des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) und die Wirtsreaktionen auf Infektion, erneute Infektion und Impfung bei Personen mit Fettleibigkeit sind nach wie vor unvollständig geklärt.
Methoden
Mithilfe des diätinduzierten fettleibigen (DIO) Mausmodells untersuchten wir SARS-CoV-2 Alpha- und Omicron BA.1-induzierte Krankheitsmanifestationen und Immunantworten des Wirts auf Infektion, erneute Infektion und COVID{ {6}} mRNA-Impfung.
Ergebnisse
Anders als bei mageren Mäusen replizierten sich Omicron BA.1 und Alpha in vergleichbaren Mengen in der Lunge von DIO-Mäusen und führten zu einem ähnlichen Ausmaß an Gewebeschäden. Wichtig ist, dass sowohl T-Zell- als auch B-Zell-vermittelte adaptive Immunantworten auf eine SARS-CoV-2-Infektion oder eine COVID-19-mRNA-Impfung bei DIO-Mäusen beeinträchtigt sind, was zu einer höheren Wahrscheinlichkeit einer erneuten Infektion und einer geringeren Impfwahrscheinlichkeit führt Wirksamkeit. Trotz des Fehlens neutralisierender Antikörper sind geimpfte DIO-Mäuse jedoch bei der Omicron-Exposition vor Lungenschäden geschützt, was mit einer deutlich höheren IFN- und IFN-Produktion im Lungengewebe einhergeht. Lungen-RNAseq und nachfolgende Experimente zeigten, dass die COVID-19-mRNA-Impfung bei DIO-Mäusen die antivirale angeborene Immunantwort, einschließlich der Expression von IFN-, im Vergleich zu den nicht geimpften Kontrollen verstärkte.
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Deutung
Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die COVID{0}}-mRNA-Impfung die angeborenen antiviralen Reaktionen des Wirts bei Fettleibigkeit verstärkt, was die DIO-Mäuse bis zu einem gewissen Grad schützt, wenn die adaptive Immunität nicht optimal ist.
Finanzierung
Eine vollständige Liste der Fördereinrichtungen, die zu dieser Studie beigetragen haben, finden Sie im Abschnitt Danksagungen.
Schlüsselwörter: Fettleibigkeit; Diätbedingt fettleibige Maus; SARS-CoV-2}}; COVID-19; Impfung; Omikron
Einführung
Die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) wird durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus-2 (SARS CoV-2) verursacht, das zu mehr als 630 Millionen Infektionen und über 6,5 Millionen Todesfällen geführt hat.1 –3 Fortgeschrittenes Alter und Komorbiditäten wie Bluthochdruck, Fettleibigkeit, bestimmte Krebsarten und Herz-Kreislauf-Erkrankungen gelten als Risikofaktoren für die Entwicklung einer schweren COVID-19-Erkrankung-19.4 Unter diesen Erkrankungen gilt Fettleibigkeit derzeit als weltweite Epidemie und ist mit der Art der Erkrankung verbunden Diabetes mellitus II, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Bluthochdruck und nichtalkoholische Fettlebererkrankung aufgrund des Zustands einer chronischen, geringgradigen systemischen Entzündung.5 Frühere Studien berichteten, dass ernährungsbedingt fettleibige (DIO) Mäuse dysregulierte angeborene Immunantworten entwickelten und danach schwere Lungenschäden entwickelten pandemische Influenza-H1N1-Infektion.6–8 Seit dem Ausbruch der COVID-19-Pandemie deuten klinische Berichte darauf hin, dass Menschen mit durch Fettleibigkeit bedingten Erkrankungen einem höheren Risiko für COVID-19 ausgesetzt sind und anfälliger für schwere Erkrankungen sind. 9,10 Darüber hinaus wies eine aktuelle Studie darauf hin, dass Fettleibigkeit mit einer verzögerten SARS-CoV-2-Clearance und einer ungünstigen Prognose bei COVID{25}}-Patienten verbunden ist.11 Allerdings ist die Pathogenität von SARS-CoV-2 und Wirtsreaktionen auf erneute Infektion und Impfung bei Menschen mit Adipositas sind noch nicht vollständig verstanden.12 Seit seinem Auftreten im Jahr 2019 entwickelt sich SARS-CoV-2 weiter und erzeugt neue besorgniserregende SARS-CoV-2-Varianten ( VOCs), einschließlich Alpha, Beta, Gamma, Delta und Omicron. Diese VOCs tragen Schlüsselmutationen in Spike- und anderen viralen Proteinen, die gemeinsam ihre Pathogenese, Immunevasivität und Übertragbarkeit modulieren. Ende November 2021 wurde erstmals in Südafrika über SARS-CoV-2 Omicron BA.1 berichtet, das sich schnell ausbreitete und Anfang 2022 Delta als vorherrschend zirkulierende SARS-CoV-2-Variante ablöste. Omicron BA .1 enthält über 30 Aminosäureveränderungen im Vergleich zum angestammten SARS-CoV-2, was zu seinen einzigartigen virologischen Merkmalen führt, einschließlich verringerter Pathogenität, erhöhter Übertragbarkeit13–17 und Umgehung der impfstoffinduzierten Immunität.18– 20 Da Omicron und seine Unterlinien heute die vorherrschenden SARS-CoV-2-Stämme sind, ist es wichtig, die Manifestation einer Omicron-Infektion in der adipösen Bevölkerung zu verstehen. Am wichtigsten ist, dass die Wirksamkeit der COVID-19-mRNA-Impfung bei adipösen Patienten noch nicht vollständig erforscht ist.
In dieser Studie verwendeten wir DIO-Mäuse als Tiermodell, um die Manifestation von Alpha und Omicron BA.1 im Kontext der SARS-CoV-2-Pathogenese, Reinfektion und COVID-19-mRNA-Impfstoff-vermittelt zu simulieren Schutz bei adipösen Personen. Erstens stellten wir fest, dass SARS-CoV-2 bei DIO-Mäusen zu schwerwiegenderen Krankheitsverläufen führte als bei mageren Mäusen. Unterdessen fanden wir heraus, dass serumneutralisierende Antikörperreaktionen und virusspezifische T-Zell-Interferonreaktionen, die entweder durch eine Virusinfektion oder eine COVID-19-mRNA-Impfung induziert wurden, bei DIO-Mäusen stark abgeschwächt waren, was zu einer höheren Anfälligkeit für eine erneute Infektion führte geringerer COVID-19-mRNA-Impfstoffschutz von DIO-Mäusen im Vergleich zu mageren Mäusen. Zweitens verursachte die Omicron BA.1-Infektion zwar abgeschwächte Erkrankungen bei mageren Mäusen, führte jedoch bei DIO-Mäusen zu einer schweren Erkrankung, die der von Alpha ähnelte. Drittens haben wir gezeigt, dass zwei Dosen von COVID-19-mRNA-Impfungen keinen serumneutralisierenden Antikörper gegen Omicron BA.1 induzieren konnten, aber in der Lage waren, den durch Omicron BA.1-induzierten Lungenschaden bei DIO-Mäusen zu lindern. Transkriptomische Studien an Lungengewebe zeigten, dass die angeborenen antiviralen Immunantworten bei DIO-Mäusen durch die Impfung deutlich erhöht wurden, was darauf hindeutet, dass die COVID-19-mRNA-Impfung den DIO-Mäusen Schutz bot, indem sie die angeborene antivirale Immunität des Wirts stärkte. Insgesamt lieferte unsere Studie wichtige Erkenntnisse über die SARS-CoV-2 Alpha- und Omicron BA.1-Infektion, Reinfektion und COVID{23}}-mRNA-Impfung bei DIO-Mäusen.
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Methoden
Ethik-Erklärung
Alle Experimente mit lebendem SARS-CoV-2 wurden in der Biosafety Level-3-Einrichtung am Department of Microbiology der University of Hong Kong (HKU) gemäß den Standardarbeitsanweisungen durchgeführt. Alle Tierversuchsverfahren wurden vom Ausschuss für die Verwendung lebender Tiere in Lehre und Forschung der HKU gemäß CULATR 5786-21 und Einhaltung der Richtlinien zur Verwendung von Tieren genehmigt.
Virus und Biosicherheit
SARS-CoV-2 B.1.1.7/Alpha (GISAID: EPI_ISL_1273444) und B.1.1.529.1/Omicron BA.1 (GenBank: OM212469)18 wurden isoliert von im Labor bestätigten COVID-19-Patienten in Hongkong. Alpha und Omicron BA.1 wurden durch Plaque-Assay in VeroE6-TMPRSS2-Zellen kultiviert und titriert und vor der Verwendung bei –80 °C gelagert.
Tiere
C57BL/6N-Mäuse wurden vom Center of Comparative Medicine Research der HKU bezogen und im BSL- 2-Tierlabor mit einem 12--Stunden-Intervall Tag/Nacht-Zyklus gehalten.21 Die Adipositas-Induktion wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. 6 3 Wochen alte, frisch entwöhnte weibliche Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt. Eine Gruppe wurde 20 Wochen lang mit 45 Kcal % fettreichen Diäten (D12451, Research Diet Inc, New Brunswick, NJ) gefüttert, um eine Diät zu induzieren. induzierte fettleibige (DIO) Mäuse, und die Kontrollgruppe wurde als magere Mäuse mit Standard-Pelletfutter mit 13,2 Kcal-%-Diäten (PicoLab Rodent Diet 20, LabDiet Code 5053, PMI) gefüttert. Das durchschnittliche Körpergewicht der in dieser Studie verwendeten DIO-Mäuse betrug 40–50 g und das der Kontrollgruppe mit mageren Mäusen 25–30 g.
Zellkultur und Stimulation
Alveolarmakrophagen (AMs) wurden durch bronchoalveoläre Lavage (BAL) isoliert. Kurz gesagt: Nachdem die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital getötet wurden, wurden die Lungen dreimal mit 1 ml kühlem PBS gespült, um 3 ml bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) zu erhalten. BALF von Mäusen derselben Gruppe wurden gepoolt und 10 Minuten lang bei 4 °C und 500 × g zentrifugiert, um präzipitierte Zellen zu sammeln. AMs wurden mit einer Dichte von 50 000 Zellen/Vertiefung in 96- ausgesät. Well-Platten wurden in RPMI 1640 plus 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre von 5 % CO2 für 2 Stunden kultiviert, dann konnten Monoschichten von AMs an Kulturplatten anhaften, nicht anhaftende Zellen wurden mit PBS von den Platten gewaschen und AMs wurden kultiviert in RPMI 1640 plus 1 % Penicillin-Streptomycin und 10 % fetales Rinderserum (FBS) mit oder ohne Stimulation von 1 µg/ml mRNA-Impfstoff, 100 µg/ml Poly (I: C) oder 100 ng/ml Spike-Protein für 24 Stunden .22 Überstände wurden für den ELISA-Test gesammelt. Die Zellen wurden gründlich mit PBS gewaschen und zur RNA-Extraktion geerntet.
Alpha- und Omicron-BA.1-Herausforderung bei Mäusen
DIO und magere Mäuse unter Narkose mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg)23 erhielten eine intranasale Impfung mit 103 PFUs von Alpha oder Omicron BA.1, verdünnt in 20 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), Kontrollmäuse wurden mit der gleichen Menge PBS beimpft. Das Körpergewicht und die Symptome der infizierten Mäuse wurden 14 Tage lang überwacht. Zu den Krankheitssymptomen gehörten zerzaustes Fell, gebeugte Haltung und Atembeschwerden. Für jedes Anzeichen wurde eine Bewertung vergeben. Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital 2 und 4 Tage nach der Infektion (dpi) getötet. 3–6 Mäuse in jeder Gruppe wurden eingeschläfert, um Blutproben sowie Lungen- und Nasenmuschelgewebe für virologische, histopathologische und immunologische Untersuchungen zu entnehmen. Für die Untersuchungen wurden Lungenproben jeder Maus entnommen. Jeder Datenpunkt im Abbildungsbereich stellt das Ergebnis einer Maus dar.
Impfverfahren
Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in Gruppen eingeteilt und erhielten in Abständen von 14-Tagen ein Zwei-Dosen-Regime einer COVID-19-mRNA-Impfung (BNT162b2, Chargennummer 1B004A, BioNTech, Deutschland). Der Impfstoff basiert auf einer nukleosidmodifizierten mRNA, die in Lipid-Nanopartikeln formuliert ist und das ursprüngliche SARS-CoV-2 in voller Länge kodiert. DIO- und mageren Mäusen wurden 50 μl (5 μg) COVID-19-mRNA-Impfstoff oder normale Kochsalzlösung als Kontrolle intramuskulär injiziert.24,25 Am Tag 14 nach der ersten Impfdosis haben wir Blutproben entnommen und diese dann bereitgestellt die zweite Dosis des mRNA-Impfstoffs. 14 Tage nach der zweiten Dosis wurden Blutproben zur Beurteilung der Antikörperreaktionen entnommen. Anschließend wurden Mäuse intranasal mit 103 PFU Alpha oder Omicron BA.1 geimpft. Bei 2 dpi wurden Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital getötet und Proben, einschließlich Blutproben, Lungen- und Nasenmuschelgewebe, wurden zur virologischen, histologischen und immunologischen Beurteilung entnommen. Lungengewebe wurde in drei Teile getrennt, die linke Lunge wurde zur histologischen Beurteilung entnommen, der Schwanzlappen der rechten Lunge wurde als Lungenhomogenat gesammelt und der Rest der rechten Lunge diente der RNA-Extraktion.
Bestimmung der SARS-CoV-2-Genkopien und des infektiösen Virustiters in Lungen- und Nasenmuschelgeweben
Gesamt-RNA aus Lungen- und Nasenmuschelgewebe (NT) von Mäusen mit Alpha- und Omicron BA.1-Infektion wurde mit dem MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (9766, Takara Bio Inc. Shiga, Japan) extrahiert. SARS-CoV-2 RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp)-Genkopien wurden mit einem QuantiNova Probe RT-PCR Kit (208354, Qiagen) quantifiziert. qRT-PCR zum Nachweis von SARS-CoV-2 RdRp-Genkopien und des Housekeeping-Gens -Actin zur Normalisierung wurden auf einem LightCycler 96-System (Roche Applied Sciences, Indianapolis, USA) durchgeführt.21 Für die Titration infektiöser Viren wurden Homogenate aus Die Lunge (Schwanzlappen der rechten Lunge) und NT-Gewebe, die mit Alpha und Omicron BA.1 infiziert waren, wurden durch einen 50 % Gewebekultur-Infektionsdosistest (TCID50) in VeroE6-TMPRSS2-Zellen durchgeführt.26 Homogenate waren {{ 19}fache serielle Verdünnung und Inkubation mit VeroE6-TMPRSS2-Zellen in einer 96-Well-Platte für 1 Stunde bei einem Inkubator bei 37 °C, Überstände wurden verworfen und die Zellen wurden 72 Stunden lang bei 37 °C weiter inkubiert H. Es wurde ein zytopathischer Effekt (CPE) beobachtet und der 50 %-Gewebeinfektionstiter wurde mit der Endpunktberechnungsmethode von Reed & Munch bestimmt.26
Histopathologie, Immunhistochemie und Immunfluoreszenzfärbung von Lungen- und Nasenmuschelgewebeschnitten
Bei histopathologischen Veränderungen wurde eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) von formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten (jeweils 4 μm) beobachtet. Der Schweregrad der Histopathologie in der Lunge wurde unter vollständiger Maskierung27 durch Beurteilung von Lungenstauung, interstitieller Infiltration, alveolärer Infiltration und Blutung bewertet und wie zuvor beschrieben mit 0–4 bewertet.26 Die folgenden Kriterien wurden für die Bewertung verwendet: 0, normaler Lungenabschnitt; 1, Blutgefäßverstopfung, perivaskuläre oder peribronchioläre Infiltration; 2, zusätzlich zu 1 mit diffuser Alveolarwandstauung und Infiltration; 3, Luftrauminfiltration, Exsudation, Blutung einer lokalisierten Alveolitis; 4, diffuse Alveolitis wurde beobachtet. Die immunhistochemische Färbung wurde mit einem DAB (3,3′-Diaminobenzidin)-Substratkit (Vector Laboratories) durchgeführt, wie wir zuvor beschrieben haben.28 Kurz gesagt, für den ACE2-Antigennachweis wurden ACE2-rekombinante monoklonale Kaninchenantikörper (MA5-32307, Invitrogen) verwendet verwendet und anschließend die Farbe mit dem DAB-Substrat-Kit entwickelt. Das ACE2-Protein wurde durch Hämatoxylin und anschließend die Gewebeschnitte mit dem permanenten Eindeckmedium VectaMount (Vector Laboratories) nachgewiesen. Für die SARS-CoV-2-Antigenexpression wurden Schnitte von Lungen- und NT-Geweben mit einem hauseigenen Antikörper des Kaninchen-Anti-SARS-CoV-2-Nukleokapsidproteins (NP) gefärbt, gefolgt von einem sekundären Antikörper von FITC –konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (65-6111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Die folgenden Kriterien wurden für die NP-Bewertung verwendet. Lunge: „Score 0“ – kein Fluoreszenzfärbungssignal; „Score 1“ – nur in 1–3 Bronchiolarepithel mit N-Antigen-positiven Zellen; „Score 2“ – mehr als 3 Bronchiolarepithel mit N-Antigen-positiven Zellen; „Score 3“ – Bronchioläres Epithel mit einigen positiven Zellen im nahegelegenen Alveolar; „Score 4“ – mehrere Herde oder große Bereiche von Alveolen mit N-Antigen-positiven Zellen. NT: „Score 0“ – kein Fluoreszenzfärbungssignal; „Score 1“ – einige im Epithel verstreute N-Antigen-positive Zellen; „Score 2“ – Epithel zeigt kontinuierlich positiven N-Antigen-Fokus in benachbarten Zellen; „Score 3“ – mehr N-Antigen-Positive von Epithelherden, die in einem anderen Bereich verteilt sind. Die Bilder wurden mit einem halbmotorisierten Fluoreszenz- oder Hellfeldmikroskop Olympus BX53 mit der OLYMPUS CellSense Standard-Software aufgenommen.
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RNA-Isolierung und Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion
Die Gesamt-RNA wurde aus Gewebehomogenaten extrahiert (die kranialen, mittleren und akzessorischen Lappen wurden für die Lunge entnommen) und die reverse Transkription der cDNA wurde mit dem MiniBEST Universal RNA Extraction Kit und dem RT Reagent Kit (RR036A Takara Bio Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt . Expressionsniveaus von Zytokinen, Chemokinen und Interferonen wurden durch qRT-PCR mit spezifischen Primern (Ergänzungstabelle S1) unter Verwendung eines SYBR Premix Ex Taq II Kits (RR820A, Takara Bio Inc.) nachgewiesen. Die Werte jedes Gens wurden mit dem Haushaltsgen-Aktin normalisiert und als 2−ΔCt dargestellt, wie wir zuvor beschrieben haben.28,29
Enzymimmunoassay (ELISA)
SARS-CoV-2-Nukleoprotein (N), Spike-Protein-Rezeptor-Bindungsdomäne (RBD) und inaktiviertes SARS-CoV-2 wurden in 96-well-Immunoblasten beschichtet (Nunc-Immuno Modules; Nunc A /S, Roskilde, Dänemark) in 0.05 M NaHCO3 und über Nacht bei 4 ◦C inkubiert. Serumproben wurden 2--fach seriell verdünnt und auf die beschichtete Platte gegeben, 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert, gefolgt von Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern (Kaninchen-Anti-Maus-IgG, Ziege-Anti-Maus-IgG1, IgG2a, IgG2b, ab6728, ab98693, M32307, M32507, Abcam und Invitrogen) bei 37 ◦C für 1 Stunde. Die Farbentwicklung wurde mit 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidinlösung (#N301, Thermo Fisher Scientific) bei 37 °C für 15 Minuten durchgeführt und mit H2SO4 gestoppt. Die Werte der optischen Dichte (OD) wurden bei 450 nm abgelesen. Die Antikörpertiter wurden durch einen OD-Grenzwert bestimmt, der auf die mittlere OD von nicht infiziertem Serum bei allen Verdünnungen plus 3 Standardabweichungen festgelegt wurde, und die höchste Verdünnung, die einen OD-Wert über dem Grenzwert erzeugt, wurde als Antikörpertiter bestimmt Serum.30 IFN-, IFN-, Albumin- und Hämoglobinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Maus-IFN- (Invitrogen, USA), IFN- (R&D Systems, USA), Albumin- und Hämoglobin-ELISA-Kits (Abcam, Cambridge, UK) gemäß bestimmt Herstelleranweisungen.
Mikroneutralisationstest (MNT).
Serumproben wurden seriell 2-fach verdünnt, beginnend mit 1:10 in PBS und mit 100 TCID 50 von SARS-CoV-2 für 1 Stunde bei 37 ◦C gemischt, die Mischung wurde in vorgeimpftes VeroE gegeben 6-TMPRSS2-Zellen in 96-Well-Platte bei 37 ◦C für 72 Stunden. CPE wurde beobachtet und neutralisierende Antikörpertiter wurden als die höchste Serumverdünnung bestimmt, die den zytopathischen Effekt vollständig hemmte.
Abb. 1: SARS-CoV-2 Alpha und Omicron BA.1 verursachen bei DIO-Mäusen schwerere Erkrankungen als bei mageren Mäusen.
Enzyme-linked Immuno Spot (ELISpot)-Assay
Virusspezifische IgG-produzierende Zellen wurden durch Aussäen einer Einzelzellsuspension (2,5 × 105 Zellen/pro Vertiefung) von Lungen- und Milzgewebe in eine ELISpot-Platte mit inaktiviertem SARS-CoV-2 (5 µg/ml) bei 37 °C nachgewiesen ◦C für 48 Stunden. IgG-produzierende Zellen wurden mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (62-6522, Invitrogen) bestimmt.31 Für den Nachweis virusspezifischer IFN-produzierender Zellen 2,5 × 105 Zellen/einzelne Vertiefung pro Zelle Suspensionen von Lungen- und Milzgewebe wurden in einer IFN-ELISpot-Platte unter Stimulation mit SARS-CoV-2 RBD-Peptidpool und N-Protein 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. IFN-produzierende Zellen wurden unter Verwendung eines Maus-IFN-ELISpot BASIC bestimmt Kit (3321-2A, Mabtech, Inc., Stockholm, Schweden) gemäß den Anweisungen des Herstellers.32
RNA-Sequenzierung und Datenanalyse
Gesamt-RNA aus Lungengewebezellen von DIO- und mageren Mäusen (n größer oder gleich 3 pro Gruppe) wurde mit dem NucleoSpin RNA Kit (740955,250, MACHEREY-NAGEL, Düren, Deutschland) isoliert. . DNA-abgereicherte und gereinigte RNA wurde zum Aufbau einer doppelsträngigen (ds) cDNA-Bibliothek unter Verwendung des MGIEasy RNA Library-Vorbereitungsreagenziensets (MGI, Shenzhen, China) gemäß dem Standardprotokoll verwendet. Sequenzierungsdaten wurden mit schnellem v0.20.1 gefiltert, um den Adapter und Lesevorgänge mit geringer Qualität zu entfernen.33 Ribosomale RNA (rRNA)-Lesevorgänge wurden mit URMAP v1.0 gefiltert. 1480 (Edgar, 2020) und 34 HISAT2 v2.2.0 wurde verwendet, um die Reads gegen das Maus-Referenzgenom (GRCm38/ENSEMBL 84) abzubilden.35 Die Alignment-Datei wurde zum Zusammenstellen von Transkripten, zum Schätzen ihrer Häufigkeit und zum Erkennen der unterschiedlichen Expression von verwendet Gene wurden die Genexpressionsniveaus mit StringTie v2.1.5.36 quantifiziert. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde mit R v4.0 durchgeführt. Differenziell exprimierte Gene (DEGs) und basierend auf der Genzahl mit DESeq2 v3.15.37 ermittelte DEGs zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen wurden durch ClusterProfile mit dem Schwellenwert |log2FC| identifiziert > 1 und FDR-Wert < 0,05 und wurde für die Anreicherungsanalyse mit Gene Ontology (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway (KEGG) verwendet.38 Alle Gene im Mausgenom wurden als Anreicherungshintergrund verwendet. ImmuCellAI_Maus wurde verwendet, um die Immunzellhäufigkeit basierend auf den RNAseq-Daten zu bestimmen.39
statistische Analyse
Die Daten stellen Mittelwerte und Standardabweichungen dar. Statistische Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden mit dem Student-t-Test unter Verwendung von GraphPad Prism 8 ausgewertet. Statistische Unterschiede zwischen drei oder mehr Gruppen wurden mit einfaktorieller oder zweifacher ANOVA unter Verwendung von GraphPad Prism 9 ausgewertet. Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn p < { {5}}.05. Die Abbildungen und Grafiken im Manuskript wurden mit GraphPad Prism 8, Adobe Illustrator oder BioRender.com erstellt.
Reagenzvalidierung
Die in der Studie verwendeten Antikörper wurden von der kommerziellen Quelle validiert, bei der sie gekauft wurden. Detaillierte Informationen zu den in der Studie verwendeten Reagenzien finden Sie in der Reagenzvalidierungsdatei der Ergänzungsdaten (Ergänzungstabelle S2).
Rolle der Geldgeber
Die Finanzierungsquellen spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Datenerhebung, der Analyse oder Interpretation oder der Erstellung des Berichts.
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Ergebnisse
SARS-CoV-2 Alpha und Omicron BA.1 führen bei DIO-Mäusen zu schwereren Erkrankungen als bei mageren Mäusen
Um die Pathogenität von SARS-CoV-2 im Zusammenhang mit Fettleibigkeit zu verstehen, wurden DIO- und magere Mäuse mit 103 PFU Omicron BA.1 (B.1.1.529.1) oder Alpha (B.1.1.529.1) geimpft .1.1.7) über den intranasalen Weg. Omicron BA.1 und Alpha tragen die N501Y-Substitution in einer Spitze, die es ihnen ermöglicht, Wildtyp-Mäuse zu infizieren.40,41 Bei einem {{16}tägigen Krankheitsverlauf beobachteten wir einen langsamen, aber konstanten Rückgang des Körpergewichts bei Alpha-infizierten mageren Mäusen mit einem mittleren Körpergewichtsverlust von 5 % bei 14 dpi (Abb. 1a). Im Gegensatz dazu beobachteten wir bei mit Omicron BA.1-infizierten mageren Mäusen eine durchschnittliche Körpergewichtszunahme von 1,5 %, was darauf hindeutet, dass die Pathogenität von Omicron BA.1 bei mageren Mäusen deutlich abgeschwächt war (Abb. 1a). Dies steht im Einklang mit aktuellen Studien von uns und anderen.14,42 Allerdings führte die Infektion sowohl von Alpha als auch von Omicron BA.1 zu einem stärkeren Körpergewichtsverlust bei ernährungsbedingt fettleibigen (DIO) Mäusen, der im Vergleich bei 9 dpi etwa 12 % betrug mit ihrem ursprünglichen Körpergewicht (100 %) bei 0 dpi (Abb. 1a). Interessanterweise gab es zwar einen deutlichen Unterschied in der mittleren Körpergewichtsveränderung zwischen Alpha- und Omicron BA.1-infizierten mageren Mäusen (14 dpi: −5,0 % vs. +1,5 %), aber das Körpergewicht Der Verlust von Alpha- und Omicron BA.1-infizierten DIO-Mäusen war weitgehend gleich (14 dpi: −11,1 % vs. −11,4 %) (Abb. 1a). In Übereinstimmung mit den Körpergewichtsmessungen führte die Infektion mit Alpha und Omicron BA.1 bei DIO-Mäusen zu vergleichbaren klinischen Symptomen, einschließlich zerzaustem Fell, gekrümmtem Rücken und erschwerter Atmung, die bei 4 dpi ihren Höhepunkt erreichte (Abb. 1b), während wir keine beobachteten Krankheitszeichen bei mageren Mäusen nach einer Alpha- oder Omicron BA.1-Infektion. Als nächstes beurteilten wir die histologischen Veränderungen im oberen und unteren Atemwegsgewebe. Als Kontrolle wurden scheininfizierte Nasenmuscheln (NT) und Lungengewebe von Mäusen gezeigt (ergänzende Abbildung S1). Wir beobachteten eine leichte virusinduzierte Epithelzerstörung und entzündliche Infiltration in NT sowohl von Alpha- als auch von Omicron BA.1-infizierten mageren Mäusen bei 2 dpi. Die Abschuppung des Epithels und die Immuninfiltration waren in den NT-Schnitten von DIO-Mäusen, die mit Alpha oder Omicron BA.1 bei 2 dpi infiziert waren, im Vergleich zu mageren Mäusen dramatischer (Abb. 1c). Bei 4 dpi wurde bei Alpha-infizierten mageren Mäusen eine leichte Zerstörung des NT-Epithels mit einigen luminalen Zelltrümmern festgestellt, während NT von Omicron BA.1-infizierten mageren Mäusen relativ intakt zu sein schien. Wir stellten jedoch am Tag 4 nach der Alpha- oder Omicron BA.1-Infektion weiterhin schwere Epithelzerstörung, Lumentrümmer und submuköse Immunzellinfiltration in den NT-Schnitten von DIO-Mäusen fest (Abb. 1c). Im Lungengewebe von mageren Mäusen führte die Alpha-Infektion bei 2 und 4 dpi zu einer lokalisierten interstitiellen Entzündung und einer leichten Verstopfung der Alveolarkapillaren, während die Omicron BA.1-Infektion bei 2 dpi zu einer interstitiellen Lungenentzündung führte, bei 4 dpi jedoch weitgehend abgeklungen war (Abb. 1d). Im scharfen Gegensatz dazu wurden im Lungengewebe von DIO-Mäusen nach einer Alpha- oder Omicron-BA.1-Infektion schwerwiegendere histologische Schäden an Alveolen beobachtet, die sich in einer schweren Lungenblutgefäßverstopfung bei 2 dpi äußerten. In den Alveolarsäcken wurde bei 4 dpi eine erhöhte Infiltration peribronchiolärer und perivaskulärer Immunzellen sowie von Immunzellen und flüssigen Exsudaten beobachtet (Abb. 1d). Die Albuminkonzentration in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit war am Tag 4 nach der Alpha-Infektion bei DIO-Mäusen signifikant höher als bei mageren Mäusen, was auf eine erhöhte Alveolarkapillarpermeabilität bei SARS-CoV-2--infizierten DIO-Mäusen hindeutet (ergänzende Abbildung S2). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigte die semiquantitative histologische Untersuchung des Lungengewebes, dass eine Infektion sowohl mit Omicron BA.1 als auch mit Alpha bei DIO-Mäusen zu einer schwerwiegenderen Lungenhistopathologie führte als bei mageren Mäusen (Abb. 1e). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine SARS-CoV-2-Infektion bei DIO-Mäusen zu schwerwiegenderen Krankheitsmanifestationen führt als bei mageren Mäusen. Während Omicron BA.1 bei schlanken Mäusen weniger pathogen ist als Alpha, sind die beiden SARS-CoV-2-Varianten pathogener und verursachen bei DIO-Mäusen ähnliche Krankheiten.
Abb. 2: SARS-CoV-2 repliziert sich bei DIO-Mäusen effizienter als bei mageren Mäusen.
SARS-CoV-2 repliziert sich bei DIO-Mäusen effizienter als bei mageren Mäusen
Als nächstes fragten wir, ob sich Omicron BA.1 und Alpha im Atmungsgewebe von DIO-Mäusen im Vergleich zu mageren Mäusen effektiver replizieren. Wir fanden heraus, dass sich sowohl Alpha als auch Omicron BA.1 im Lungengewebe von DIO-Mäusen bei 2 und 4 dpi in höheren Mengen replizierten als bei mageren Mäusen (Abb. 2a und b). In Übereinstimmung mit früheren Berichten replizierte sich Omicron BA.1 im Lungengewebe magerer Mäuse in geringeren Mengen als Alpha. Insbesondere war der Infektionstiter von Omicron BA.1 bei 2 bzw. 4 dpi 26,1- bzw. 3,{10}}mal niedriger als der von Alpha. Im Gegensatz dazu replizierten Omicron BA.1 und Alpha in ähnlichen Mengen im Lungengewebe von DIO-Mäusen, indem RdRp-Genkopien und Infektionstiter gemessen wurden (Abb. 2a und b). Darüber hinaus haben wir auch ein ähnliches Muster des viralen RdRp-Gens und des Infektionstiters in den NT-Geweben festgestellt, wobei Omicron BA.1 und Alpha bei DIO-Mäusen, jedoch nicht bei mageren Mäusen, in vergleichbaren Mengen replizierten (Abb. 2c und d). Durch Immunfluoreszenzfärbung stellten wir im Vergleich zu mageren Mäusen bei 2 und 4 dpi eine stärkere Expression des viralen Nukleokapsids (N) in den Lungen- und NT-Geweben von mit Omicron BA.1 oder Alpha infizierten DIO-Mäusen fest (Abb. 2e und f und Ergänzung). Abb. S3). Parallel dazu haben wir die Expression wichtiger Interferone (IFNs) und proinflammatorischer Zytokine im Lungengewebe quantifiziert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Omicron BA.1 und Alpha bei DIO-Mäusen im Vergleich zu ihren mageren Gegenstücken deutlich niedrigere IFN-Spiegel auslösten (Abb. 2g und ergänzende Abb. S4). Im Gegensatz dazu wurden proinflammatorische Zytokine, einschließlich IL-6 und IP-10, bei DIO-Mäusen durch Omicron BA.1- und Alpha-Infektion im Vergleich zu mageren Mäusen in höheren Konzentrationen ausgelöst (Abb. 2h). Darüber hinaus untersuchten wir die Grundexpression von ACE2 und TMPRSS2 in nicht infizierten Lean- und DIO-Mäusen und stellten fest, dass ACE2 und TMPRSS2 in Lean- und DIO-Mäusen in vergleichbaren Mengen exprimiert wurden. Bei der immunhistochemischen Färbung der ACE2-Antigenexpression wurde jedoch eine höhere Intensität von ACE2 im bronchiolären und alveolären Epithel nicht infizierter DIO-Mäuse im Vergleich zu mageren Mäusen festgestellt (ergänzende Abbildung S5). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die beeinträchtigte IFN-Expression und die höhere ACE2-Expression bei DIO-Mäusen zu einer höheren Virusreplikation und einer verstärkten proinflammatorischen Reaktion beitragen könnten, was zu schwereren Gewebeschäden bei den DIO-Mäusen führt.
Abb. 3: Die durch eine frühere SARS-CoV-2-Infektion erworbene adaptive Immunität schützt DIO-Mäuse ineffizient. A
Die durch eine frühere SARS-CoV-2-Infektion erworbene adaptive Immunität schützt DIO-Mäuse ineffizient
Um die Schutzwirkung der adaptiven Immunität gegen eine erneute Infektion im adipösen Zustand zu verstehen, wurden anschließend rekonvaleszente DIO-Mäuse und magere Mäuse am Tag 28 nach der Primärinfektion erneut mit 103 PFU Alpha belastet und die Proben wurden 2 Tage nach der erneuten Infektion entnommen ( dpr) (Abb. 3a). Wir analysierten den IgG-Antikörper gegen das SARS-CoV-2-Antigen in den Serumproben, die am Tag 14 nach der primären Alpha-Infektion entnommen wurden, und stellten fest, dass der Titer von IgG gegen SARS-CoV-2 N und die Spike-Rezeptor-Bindungsdomäne ( RBD) waren bei DIO-Mäusen um das 1,9--fache (p=0,0128) und 3,{16}}fache (p=0,0362) signifikant niedriger als bei mageren Mäusen. bzw. (Abb. 3b). Darüber hinaus waren der Titer des viral bindenden Gesamt-IgG und der Subtypen IgG1, IgG2a und IgG2b bei DIO-Mäusen im Vergleich zu mageren Mäusen signifikant niedriger (Abb. 3b). Bei 5 von 6 mageren Mäusen wurde ein Serumneutralisationstiter von 1:10–1:20 festgestellt, bei keiner der 6 DIO-Mäusen jedoch (Abb. 3b), was auf eine beeinträchtigte adaptive Immunantwort bei DIO-Mäusen auf SARS hindeutet. CoV-2-Infektion. Bei 2 dpr konnte eine Kopie des viralen RdRp-Gens problemlos in allen NT-Geweben und in 3/6 (50 %) der Lungengewebe erneut belasteter DIO-Mäuse nachgewiesen werden (Abb. 3c), wohingegen keine Kopie des viralen RdRp-Gens aus dem NT und der Lunge entnommen wurde Gewebe von erneut belasteten mageren Mäusen. Konsequenterweise konnten wir bei DIO-Mäusen, jedoch nicht bei mageren Mäusen, häufig virales N-Protein im Epithel von NT- und Lungengeweben nachweisen (Abb. 3d). Histologische Untersuchungen ergaben eine Epithelzerstörung in NT-Geweben sowie eine Verstopfung der Alveolarwand, eine peribronchioläre Infiltration und eine lokalisierte Alveolarblutung im Lungengewebe von DIO-Mäusen, jedoch nicht von mageren Mäusen (Abb. 3e). Als nächstes untersuchten wir die Erinnerung an Immungedächtnisreaktionen nach einer erneuten Infektion bei mageren Mäusen und DIO-Mäusen und stellten fest, dass die virusspezifischen IFN- und IgG-produzierenden Zellen sowohl im Lungen- als auch im Milzgewebe von DIO-Mäusen signifikant niedriger waren als bei mageren Mäusen 2dpr (Abb. 3f und g). Wichtig ist, dass wir am Tag 2 nach der erneuten Infektion mit Alpha keinen neutralisierenden Antikörpertiter gegen Alpha im Serum von DIO-Mäusen nachweisen konnten, während 4/6 (66,7 %) der erneut infizierten mageren Mäuse einen neutralisierenden Titer von 1 hatten :10 (Abb. 3h). Unsere Ergebnisse legen daher nahe, dass DIO-Mäuse aufgrund der unzureichend ausgeprägten adaptiven B-Zell- und T-Zell-Immunantworten bei einer SARS-CoV-2-Infektion anfälliger für erneute Infektionen sind.
Abb. 4: Die COVID-19-mRNA-Impfung bietet aufgrund der abgeschwächten adaptiven Immunantwort weniger Schutz vor Alpha-Infektionen bei DIO-Mäusen. A
Die COVID-19-mRNA-Impfung bietet aufgrund der abgeschwächten adaptiven Immunantwort weniger Schutz vor Alpha-Infektionen bei DIO-Mäusen
Um die Wirksamkeit des Schutzes für DIO-Mäuse nach der Immunisierung mit mRNA-Impfstoffen zu untersuchen, injizierten wir DIO und mageren Mäusen intramuskulär ein Zwei-Dosen-COVID-19-mRNA-Impfschema, gefolgt von einer Alpha-Provokation 14 Tage nach der Impfung, wie in Abb. 4a. Bei NT-Geweben konnten wir bei 3/6 (50 %) der geimpften mageren Mäuse ein virales RdRp-Gen und bei 2/6 (33,3 %) einen Infektionstiter nachweisen, während wir bei allen geimpften Mäusen ein virales RdRp-Gen und einen Infektionstiter nachwiesen DIO-Mäuse (Abb. 4b), was darauf hindeutet, dass eine Durchbruchinfektion nach der Impfung bei DIO-Mäusen im Vergleich zu mageren Mäusen deutlich häufiger auftrat. Im Einklang mit früheren Berichten, die darauf hinwiesen, dass Impfungen in menschlichen und tierischen Modellen einen besseren Schutz der unteren Atemwege im Vergleich zu den oberen Atemwegen bieten43,44, konnten wir in keinem der Lungengewebe der Geimpften virale Genkopien oder infektiöse Viren nachweisen magere Mäuse (Abb. 4c). Im Gegensatz dazu konnten wir das virale RdRp-Gen in 3/6 (50 %) und einen infektiösen Titer in 4/6 (66,7 %) der Lungengewebe von DIO-Mäusen nachweisen. Histologisch beobachteten wir eine ausgedehnte Epithelzerstörung in NT-Geweben geimpfter DIO-Mäuse nach der Exposition gegenüber dem Alpha-Virus, während bei geimpften mageren Mäusen ein geringerer Grad an NT-Gewebeschäden beobachtet wurde (Abb. 4d). Im Lungengewebe geimpfter DIO-Mäuse stellten wir eine Verstopfung und Infiltration im Alveolarraum fest, begleitet von Alveolarblutungsherden bei Alpha-Infektion, während diese histopathologischen Schäden im Lungengewebe geimpfter magerer Mäuse weitgehend fehlten (Abb. 4e). Im Einklang mit diesen Erkenntnissen reduzierte die COVID-19-mRNA-Impfung die SARS-CoV- 2 N-Expression sowohl bei mageren als auch bei DIO-Mäusen in den NT-Geweben (Abb. 4f). In Lungengeweben wurden virale N-Signale nur bei geimpften DIO-Mäusen, nicht jedoch bei geimpften mageren Mäusen nachgewiesen (Abb. 4g). Als nächstes fanden wir heraus, dass die virusspezifischen IFN- und IgG-produzierenden Zellen im Milzgewebe geimpfter DIO-Mäuse im Vergleich zu denen geimpfter magerer Mäuse am Tag 2 nach der Alpha-Infektion signifikant niedriger waren (Abb. 4h). Wichtig ist, dass der Mikroneutralisationstest nur neutralisierende Antikörper gegen Alpha im Serum von DIO-Mäusen 14 Tage nach der zweiten Impfdosis und 2 Tage nach der Virusprovokation nachwies, der Wert betrug jedoch das 2,{36}fache (p < 0,0001) und 21 .8- ist um ein Vielfaches (p=0.0053) niedriger als bei den mageren Mäusen (Abb. 4i). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die adaptiven Antikörperreaktionen auf die COVID-19-mRNA-Impfung bei DIO-Mäusen beeinträchtigt sind.
Die COVID-19-mRNA-Impfung lindert Lungenschäden, die durch die Omicron BA.1-Provokation bei DIO-Mäusen verursacht wurden, wenn kein nachweisbarer neutralisierender Antikörper vorhanden ist
Als nächstes fragten wir, inwieweit die COVID{{0}}-mRNA-Impfung DIO-Mäuse vor SARS-CoV-2 Omicron BA.1 schützt. Zu diesem Zweck testeten wir zunächst den neutralisierenden Antikörpertiter im Serum gegen Omicron BA.1 und stellten 14 Tage nach der Auffrischungsimpfung bei mageren Mäusen einen niedrigen Titer fest, während bei DIO-Mäusen selbst nach den beiden Dosen der COVID-Impfung kein neutralisierender Antikörpertiter festgestellt wurde{{ 6}} mRNA-Boost oder 2 Tage nach der Omicron BA.1-Infektion (Abb. 5a und b), was darauf hindeutet, dass die Impfung bei DIO-Mäusen wenig Kreuzantikörper gegen Omicron BA.1 induzierte. Als nächstes wurden DIO- und magere Mäuse 14 Tage nach der Auffrischungsimpfung über den intranasalen Weg mit 103 PFU Omicron BA.1 herausgefordert (Abb. 5a). In den NT-Geweben reduzierte die COVID-19-mRNA-Impfung die Omicron BA.1-Replikation und den Infektionstiter bei mageren Mäusen geringfügig, hatte jedoch bei DIO-Mäusen im Vergleich zu ungeimpften Kontrollen nur geringe Auswirkungen (Abb. 5c). Interessanterweise reduzierte die COVID-19-mRNA-Impfung die Replikation von Omicron BA.1 im Lungengewebe von DIO-Mäusen im Vergleich zu ihren ungeimpften Kontrollen deutlich, wenn auch nicht so wirksam wie die vollständige Hemmung von Omicron BA.1 im Lungengewebe von geimpften mageren Mäusen Mäuse (Abb. 5d). Insbesondere war die Kopie des Omicron BA.1 RdRp-Gens um das 867--Fache (p=0,0087) und der Infektionstiter um das 7979,{27}}-Fache (p < 0,0001) reduziert . In Übereinstimmung mit den oben genannten virologischen Befunden war die COVID-19-mRNA-Impfung bei der Reduzierung der Omicron BA.1-Antigenexpression in NT-Geweben von mageren und DIO-Mäusen weniger wirksam, verringerte jedoch die Omicron BA.1-Antigenexpression in Lungengewebe von mageren und DIO-Mäusen (Abb. 5e). Bei 2 dpi führte die Omicron BA.1-Infektion bei ungeimpften DIO-Mäusen zu einem gewissen Grad an Stauung und Infiltration im Alveolarraum, begleitet von Lungenblutungen und Epithelschäden, die durch die COVID-19-mRNA-Impfung reduziert wurden (Abb. 5f). Wichtig ist, dass wir herausfanden, dass die Konzentration von IFN- und IFN- im Lungengewebe von geimpften DIO-Mäusen im Vergleich zu den ungeimpften Mäusen bei 2 dpi nach der Omicron BA.1-Provokation deutlich erhöht war, während neutralisierende Antikörper im Serum bei den geimpften Mäusen nicht nachweisbar blieben DIO-Mäuse (Abb. 5g). Die Gesamtschwere der Erkrankung anhand von Körpergewichtsveränderungen zeigte, dass die COVID-19-mRNA-Impfung den maximalen Körpergewichtsverlust bei DIO-Mäusen auf 9 % reduzierte, verglichen mit 13 % bei ungeimpften DIO-Mäusen (ergänzende Abbildung S6). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die COVID-19-mRNA-Impfung trotz der Auslösung einer nicht nachweisbaren Antikörperreaktion die angeborenen antiviralen Reaktionen verstärken kann, um Omicron BA.1-induzierte Lungengewebeschäden bei DIO-Mäusen zu lindern.
Abb. 5: Der mRNA-Impfstoff COVID-19 lindert Lungenschäden in Abwesenheit einer neutralisierenden Antikörperantwort bei Omicron BA.1-infizierten DIO-Mäusen. A
Die COVID-19-mRNA-Impfung reguliert die antiviralen Reaktionen in der Lunge von DIO-Mäusen hoch
Um die Immunantworten im Lungengewebe von DIO-Mäusen mit COVID-19-mRNA-Impfung besser zu verstehen, haben wir Lungenproben von Mäusen entnommen und ihre Transkriptomprofile am Tag 2 nach der Omicron BA.1-Infektion untersucht (Abb. 6a und ergänzende Abb. S7). Interessanterweise beobachteten wir eine bemerkenswerte Anreicherung von Genen, die an Signalwegen im Zusammenhang mit angeborenen antiviralen Reaktionen beteiligt sind, einschließlich der „zellulären Reaktion auf IFN- und IFN-“ und der „positiven Regulierung der IFN- und IFN--Produktion“ im Lungengewebe geimpfter DIO-Mäuse ( Abb. 6b). Die Analyse der Immungensätze ergab außerdem, dass die geimpften DIO-Mäuse unter allen untersuchten Gruppen die höchste Häufigkeit an M1-Makrophagen aufwiesen (Abb. 6c). Um zu beurteilen, ob der mRNA-Impfstoff COVID-19 die antiviralen Interferonreaktionen in Alveolarmakrophagen verstärkt, isolierten wir Alveolarmakrophagen aus mageren Mäusen und DIO-Mäusen und stimulierten sie mit mRNA-Impfstoff (Abb. 7a). Wir fanden heraus, dass die mRNA-Impfstoff-In-vitro-Stimulation von Maus-Alveolarmakrophagen eine signifikante Hochregulierung von RIG-I, MDA5, STAT1, STAT2, ISG15, IFIT3 und OAS3 induzierte, während nur die Alveolarmakrophagen von DIO-Mäusen eine signifikante Steigerung der IFN-Produktion auf mRNA zeigten und Proteingehalt (Abb. 7b und c). Diese Ergebnisse lassen auf ein unterschiedliches Reaktionsprofil von Alveolarmakrophagen von DIO-Mäusen und mageren Mäusen schließen. Als nächstes isolierten wir Maus-Alveolarmakrophagen aus geimpften oder ungeimpften Lean- und DIO-Mäusen und stimulierten die Zellen anschließend mit Poly (I: C) oder SARS-CoV-2-Spike-Protein (Abb. 7d). In-vitro-Stimulation mit Poly(I:C) steigerte die Expression angeborener Immunantwort-bezogener Gene in Alveolarmakrophagen von geimpften mageren und DIO-Mäusen weiter. Interessanterweise waren die Interferon-stimulierten Gene, einschließlich ISG15, IFIT3 und OAS3, in mit Impfstoffen vorbereiteten Alveolarmakrophagen von DIO-Mäusen im Vergleich zu denen von mageren Mäusen stärker hochreguliert (Abb. 7e). Parallel dazu erhöhte die Stimulation des rekombinanten SARS-CoV-2-Spike-Proteins die Expression von RIG-I, TLR3, IL-6, TNF-, IFN-, IFN-, IRF7 und STAT2-mRNA-Expression in Impfstoff- vorbereitete Alveolarmakrophagen von DIO-Mäusen, jedoch nicht von mageren Mäusen (Abb. 7g). Wichtig ist, dass die IFN-Produktion in Alveolarmakrophagen geimpfter DIO-Mäuse als Reaktion auf die Stimulation von Poly (I: C) oder S-Proteinen dramatisch anstieg (Abb. 7f und h). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die COVID-19-mRNA-Impfung die angeborene antivirale Reaktion in der Lunge von DIO-Mäusen wiederherstellen kann, indem sie die Expression von Typ-I-Interferon-verwandten Genen in Alveolarmakrophagen moduliert.
Abb. 6: Die COVID-19-mRNA-Impfung reguliert die antiviralen Reaktionen in der Lunge von DIO-Mäusen hoch. A
Diskussion
Fettleibigkeit geht mit verstärkten Entzündungsreaktionen und einer Störung des Immunsystems einher, was für COVID{0}}-Patienten ein hohes Risiko für Schweregrade und Krankenhauseinweisungen zur Folge hat.45 Es bleibt unklar, wie diese chronischen, geringgradigen Entzündungen und Funktionsstörungen der Immunantworten auftreten modulieren den Verlauf einer SARS-CoV-2-Infektion. Um die Pathogenese von SARS-CoV-2 zu erforschen und die Effizienz der COVID-19-mRNA-Impfung bei adipösen Personen zu beurteilen, werden dringend geeignete Kleintiermodelle benötigt, um die klinischen Merkmale von COVID-19-Patienten nachzuahmen . Das angestammte SARS-CoV-2 infiziert jedoch keine Wildtyp-Labormäuse, da die RBD des angestammten Spike nicht effizient an Maus-ACE2 bindet.21,40,41 Interessanterweise sind kürzlich SARS-CoV-2-Varianten aufgetaucht , darunter Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1) und Omicron BA.1 (B.1.1.529.1), haben die N501Y-Mutation in Spike erworben, die eine Kreuz- Artenübertragung von SARS-CoV-2 auf Wildtyp-Mäuse.41,46–50 In dieser Studie verwenden wir ein ernährungsbedingt fettleibiges Wildtyp-Mausmodell, um SARS-CoV-2 Alpha und zu untersuchen Pathogenese, Reinfektion und Impfung von Omicron BA.1.
Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem
Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Omicron BA.1-Infektion bei schlanken Mäusen gemäß der Veränderung des Körpergewichts, der Viruslast, des Virustiters, der proinflammatorischen Marker der Lunge und der histopathologischen Befunde weniger schwerwiegend ist als die von Alpha. Diese Ergebnisse stimmen mit aktuellen Berichten überein, die im Vergleich zu früheren SARS-CoV-2-Varianten in Tiermodellen ein geringeres Infektionsniveau durch Omicron BA.1 beobachteten.14,42 Der erhöhte Schweregrad von SARS-CoV{{7} }-Infektion bei DIO-Mäusen im Vergleich zu mageren Mäusen im Einklang mit den Ergebnissen kürzlich durchgeführter Studien an ernährungsinduzierten fettleibigen Mäusen und Hamstern.51–53 Interessanterweise haben wir festgestellt, dass sich Omicron BA.1 im Vergleich zu Alpha bei DIO-Mäusen in einem ähnlichen Ausmaß replizierte. Dies führt zu einer vergleichbaren Pathogenität von Omicron BA.1 und Alpha bei DIO-Mäusen. Insbesondere repräsentative proinflammatorische Zytokine, darunter IP-10 und IL-6, wurden durch die Omicron BA.1-Infektion bei DIO-Mäusen stark ausgelöst, was auf eine erhöhte Entzündungsschädigung und Morbidität hinweist.54 Unterdessen kommt es zu einer Produktion von antiviralem IFN im Lungengewebe der DIO-Mäuse war sowohl bei Alpha- als auch bei Omicron BA.1-Infektion signifikant niedriger als bei mageren Mäusen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Omicron BA.1-Infektion bei DIO-Mäusen schwere Erkrankungen ähnlich der von Alpha verursachen kann. Es ist derzeit noch nicht vollständig geklärt, wie Fettleibigkeit zu schweren Erkrankungen bei COVID beiträgt-19. Der erhöhte Leptinspiegel ist ein Kennzeichen von Fettleibigkeit, das den Stoffwechsel, die Jak/STAT- und Akt-Signalwege reguliert und die T-Zell-Funktionen moduliert, was zum schweren Verlauf beitragen kann.55,56 Die durch Antikörper vermittelte humorale Immunität ist für die Abwehrkräfte des Wirts von wesentlicher Bedeutung. 57–59, während eine optimale Virusbeseitigung bei SARS-CoV-2-infizierten Mäusen auch CD4+- und CD8+-T-Zell-Reaktionen erfordert.60 In dieser Studie haben wir deutlich geringere B-Zell-Werte festgestellt und T-Zell-Reaktionen von DIO-Mäusen im Vergleich zu mageren Mäusen, was zur erhöhten Anfälligkeit für eine erneute Infektion bei DIO-Mäusen beitragen kann. Der zugrunde liegende Mechanismus der verringerten B-Zell- und T-Zell-Reaktion bei DIO-Mäusen ist noch nicht vollständig erforscht, könnte jedoch mit einer Beeinträchtigung der Funktionalität dendritischer Zellen verbunden sein, wie in früheren Influenzavirus-Studien gezeigt wurde.61–63
Trotz des Erfolgs der COVID-19-mRNA-Impfung mit hoher Wirksamkeit zum Schutz vor schweren SARS-CoV-2-Erkrankungen kann das Auftreten einer Immunevasivität bei SARS-CoV-2-Varianten die Wirksamkeit des Impfstoffs gefährden.43 In unserem DIO-Mausmodell mit einem Zwei-Dosen-Immunisierungsschema wurde der neutralisierende Antikörper bei mageren Mäusen leicht nachgewiesen und durch die zweite Impfdosis gegen Alpha und Omicron BA.1 deutlich verstärkt. Im Gegensatz dazu führte das Zwei-Dosen-Immunisierungsschema der COVID-19-mRNA-Impfung bei DIO-Mäusen zu nicht nachweisbaren neutralisierenden Serumantikörpern gegen Alpha und Omicron BA.1, und selbst am zweiten Tag wurden keine neutralisierenden Antikörper gegen Omicron BA.1 nachgewiesen auf Omicron BA.1 Herausforderung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die adaptiven B-Zell-Reaktionen auf den mRNA-Impfstoff bei DIO-Mäusen stark geschwächt sind, was auf Beeinträchtigungen in der B-Zell-Entwicklung, -Aktivierung und -Funktion zurückzuführen sein könnte.64–66 Interessanterweise bot die Impfung einen gewissen Schutz für Omicron BA .1-belastete DIO-Mäuse in den unteren Atemwegen, jedoch nicht in den Nasenmuscheln infizierter Tiere. Der unzureichende Schutz im Nasenmuschelgewebe kann auf unzureichende mukosale Immunantworten bei intramuskulärer Impfung zurückzuführen sein, die keine ausreichende schützende Immunität an den Schleimhautstellen hervorrufen konnten.67,68
Abb. 7: Alveolarmakrophagen (AMs) von DIO-Mäusen tragen zu den hochregulierten antiviralen Reaktionen bei. A
Durch transkriptomische Analyse haben wir herausgefunden, dass die COVID-19-mRNA-Impfung die antiviralen Reaktionen in der Lunge von DIO-Mäusen hochregulierte. Nachfolgende Experimente ergaben, dass die IFN-Produktion als Reaktion auf die Stimulation durch Poly (I: C) oder SARS-CoV-2-Spike-Protein in den Alveolarmakrophagen geimpfter DIO-Mäuse erhöht war. Zusammen mit der verringerten Viruslast und histopathologischen Veränderungen sowie der erhöhten Konzentration von IFN- / in der Lunge von Omicron BA.1- geimpften DIO-Mäusen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die mRNA-Impfung die angeborene Immunität des Wirts bei fettleibigen Tieren stärkt trägt zum beobachteten Schutz bei. Insgesamt offenbart unsere Studie wichtige Erkenntnisse über die Infektion, Reinfektion und Impfung mit SARS-CoV-2 Alpha und Omicron BA.1 bei ernährungsbedingt fettleibigen Mäusen, die Einblicke in die Management-, Behandlungs- und Impfstrategien dafür liefern die fettleibigen Bevölkerungsgruppen. Unsere Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Zunächst führten wir 28 Tage nach der Primärinfektion eine erneute Belastung durch. In realen Szenarien sollten die Gedächtnislebensdauer und der Schutz vor einer erneuten Infektion bei Patienten über einen längeren Zeitraum überwacht werden. Zweitens wurden in dieser Studie weibliche Mäuse verwendet, da bekannt ist, dass Weibchen stärkere angeborene und adaptive Immunantworten entwickeln als Männchen.69 Die unterschiedlichen Immunantworten gegen SARS-CoV-2 zwischen den Geschlechtern und ihre Rolle bei der Krankheitsentstehung von COVID{{ 19}} sollte weiter untersucht werden. Drittens haben wir für diese Studie nur das Wildtyp-Mäusemodell verwendet. In zukünftigen klinischen Studien sollten zusätzliche Untersuchungen am Menschen durchgeführt werden, um unsere Erkenntnisse darüber zu bestätigen und weiter zu untersuchen, ob die COVID-19-mRNA-Impfung die angeborenen Immunantworten verbessert SARS-CoV-2-Infektion bei geimpften adipösen menschlichen Patienten. Dennoch liefert unsere Studie wichtige Erkenntnisse, die darauf hindeuten, dass adipöse Patienten bei einer SARS-CoV-2-Infektion möglicherweise schwerwiegendere klinische Erkrankungen entwickeln und anfälliger für erneute Infektionen oder Impfdurchbruchinfektionen sind. Wichtig ist, dass unsere Daten darauf hindeuten, dass COVID-19-mRNA-Impfstoffe bei adipösen Personen trotz der geringen oder fehlenden Antikörperreaktion wirksam bleiben könnten, was die Bedeutung der Impfung in diesen Bevölkerungsgruppen weiter unterstreicht.
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