Timing und Ischämie-Auswirkungen auf Nierenfibrose nach kontralateraler Nephrektomie

Einführung

Die Häufigkeit vonakute Nierenschädigung(AKI) hat in den letzten Jahren weltweit dramatisch zugenommen [1]. AKI kann in der klinischen Praxis durch Organtransplantation, postoperative Unterperfusion, Blutung, Dehydration, Schock und Sepsis verursacht werden [2]. Aktuelle epidemiologische und experimentelle Studien haben gezeigt, dass der Schweregrad, die Häufigkeit und die Dauer von AKI eng mit der späteren Inzidenz von AKI zusammenhängenchronische Nierenerkrankung(CKD). Nierenfibrose nach AKI kann zu CKD oder sogar führenNierenerkrankung im Endstadium(ESKD) [3–5], was impliziert, dass AKI und CKD miteinander verbundene Syndrome sind [6]. Trotz zahlreicher experimenteller und klinischer Studien sind die Mechanismen, die dem Übergang von AKI zu CKD zugrunde liegen, jedoch weiterhin unbekannt. Tiermodelle sind wichtige Instrumente zur Untersuchung der Mechanismen, durch die AKI zu CKD führt. Nierenischämie-Reperfusionsschäden (IRI) sind eine der Hauptursachen für AKI, und es wurden mehrere Tiermodelle für IRI-induzierte AKI entwickelt [7], darunter das bilaterale IRI-Modell (bIRI), das unilaterale IRI-Modell mit intakter kontralateraler Niere , das uIRI-Modell mit gleichzeitiger kontralateraler Nephrektomie und das uIRI-Modell mit verzögerter kontralateraler Nephrektomie.

Das bIRI-Modell ist weniger konsistent, da bei einer zu milden ischämischen Schädigung beider Nieren langfristig keine signifikanten fibrotischen Veränderungen auftreten. Wenn AKI zu schwer ist, können Mäuse in der akuten Verletzungsphase sterben. Darüber hinaus können kleine Unterschiede in der Schädigung der beiden Nieren nach einigen Wochen zu erheblichen Unterschieden in der chronischen Nierenpathologie führen [8,9]. Das uIRI-Modell mit gleichzeitiger kontralateraler Nephrotomie ähnelt dem bIRI-Modell, da aufgrund der Nephrektomie auf der anderen Seite nur die verletzte Niere verbleibt [10]. Im IRI-Modell mit intakter kontralateraler Niere ist die Fibrose der ischämischen Niere schwerwiegend [11,12]. Dieses Modell ist für die Langzeitbeobachtung durch Forscher sehr konsistent und zuverlässig. Aufgrund des Vorhandenseins einer kontralateralen unbeschädigten Niere kann es jedoch nicht zur Bewertung der geschätzten glomerulären Filtrationsrate (eGFR), des Serumkreatinins (SCr) und des Blutharnstoffstickstoffs (BUN) verwendet werden [11–14]. Im Vergleich zu den beiden oben genannten uIRI-Modellen überwindet das uIRI-Modell mit verzögerter kontralateraler Nephrektomie diese Probleme und kann sowohl für Langzeitbeobachtungen nach AKI als auch für die Überwachung der Nierenfunktion verwendet werden. Daher eignet sich dieses Modell zur Untersuchung des AKI-CKD-Übergangs [15].

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Dennoch können unterschiedliche ischämische Zustände und das Intervall zwischen kontralateraler Nephrektomie und uIRI erhebliche Auswirkungen auf das Fortschreiten und den Schweregrad der CKD nach AKI haben. Frühere Studien konzentrierten sich auf die Auswirkung der ischämischen Dauer auf die Nierenfibrose nach AKI und schenkten der Körperkerntemperatur während der Ischämie nicht viel Aufmerksamkeit. Skrypnyk et al. [12] kontrollierten die ischämische Temperatur durch ein Wasserbadsystem auf 38 °C, mit einer ischämischen Dauer von 30 Minuten, und die kontralaterale intakte Niere wurde 8 Tage nach uIRI entfernt. Das Ergebnis zeigte, dass die ischämische Niere 28 Tage nach uIRI signifikante fibrotische Veränderungen aufwies. Bei gleicher ischämischer Dauer haben Xiao et al. [8] zeigten, dass signifikante fibrotische Veränderungen 11 Tage nach uIRI auftraten, wenn die ischämische Temperatur auf 37 °C bis 38 °C kontrolliert wurde und das Zeitintervall zwischen uIRI und kontralateraler Nephrektomie 10 Tage betrug. Einige Forscher, wie Colombaro et al. [14] und Li et al. [16] erwähnten die ischämische Temperatur in ihren Studien nicht.

Mittlerweile haben nur wenige Menschen die Auswirkung des Zeitintervalls zwischen kontralateraler Nephrektomie und uIRI in diesem Modell untersucht, was zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen zwischen verschiedenen Labors führte, was sich auch dramatisch auf nachfolgende Experimente auswirkte. In dieser Studie untersuchten wir die Auswirkungen der Hauptfaktoren, die die Nierenfibrose nach AKI beeinflussen, einschließlich des Zeitintervalls zwischen kontralateraler Nephrektomie und uIRI, der Körperkerntemperatur während der Ischämie und der ischämischen Dauer. Unser Ziel war es, eine Referenz bereitzustellen, um ein geeignetes Tiermodell für die Untersuchung des AKI-CKD-Übergangs zu erstellen

Materialien und Methoden Tiermodelle

Männliche C57BL/6J-Mäuse (8–10 Wochen alt, ca. 22 g Gewicht; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, China) erhielten im Tierversuchszentrum der Shanxi Medical University freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Zuchtbedingungen waren wie folgt: Luftfeuchtigkeit 40–70 %, Temperatur 23 °C, Luftreinheitsklasse 7, kontrollierter 12-stündiger Licht-/Dunkelzyklus unter pathogenfreien Bedingungen, Futter-Co60-Bestrahlung und gereinigtes Wasser. Alle Verfahren für diese Studie wurden von der Tierethikkommission des Zweiten Krankenhauses der Shanxi Medical University genehmigt (Ethiknummer: DW2022028).

Protokolle

In Anbetracht der Tatsache, dass die Dauer der Ischämie, die Körperkerntemperaturen während der Ischämie und der Zeitpunkt der Resektion der kontralateralen unverletzten Niere Auswirkungen auf den Schweregrad der AKI und der nachfolgenden Nierenfibrose haben können, haben wir die Auswirkungen der oben genannten drei Faktoren einzeln untersucht, während die anderen beiden Faktoren unverändert blieben. Drei Experimente wurden wie folgt durchgeführt.

Protokoll 1: Um die Auswirkung des Intervalls zwischen kontralateraler Nephrektomie und uIRI auf die Nierenfunktion und die Post-AKI-Fibrose zu beobachten, wurde die ischämische Zeit der linken Niere auf 24 Minuten und die Körperkerntemperatur während der Niere auf 37 °C festgelegt inzwischen Ischämie. Die Resektion der rechten Niere wurde am Tag 7, Tag 10 bzw. Tag 14 (n=8 pro Gruppe) nach der IRI der linken Niere durchgeführt. Wir haben die Dauer der Ischämie und Nierenresektion basierend auf den Ergebnissen früherer Studien [8,10,12,15] und unseren vorexperimentellen Ergebnissen bestimmt. Das Studienprotokoll finden Sie in Abbildung 1(A–C).

Protokoll 2: Um die Auswirkung der Körperkerntemperatur während der Ischämie auf den AKI-CKD-Übergang zu beobachten, wurde die Ischämiezeit der linken Niere auf 24 Minuten festgelegt und die rechte Niere wurde 14 Tage nach der IRI der linken Niere entfernt. Die Körperkerntemperatur wurde auf 36 °C, 36,5 °C, 37 °C, 37,5 °C bzw. 38 °C kontrolliert (n=8 pro Gruppe). Das Studienprotokoll finden Sie in Abbildung 1(D).

Protokoll 3: Um die Auswirkung der Nierenischämiedauer auf den Übergang von AKI zu CKD zu beobachten, wurde die Körperkerntemperatur während der Ischämie auf 37 °C fixiert und die rechte Niere wurde 14 Tage nach der IRI der linken Niere entfernt. Wir haben diesen Zeitpunkt gewählt, weil die Nierenfibrose, die die typische Veränderung nach AKI zu CKD darstellte, den Berichten [8,10,12,15] und unseren vorexperimentellen Ergebnissen zufolge sehr offensichtlich war. Die Ischämiezeit der linken Niere wurde auf 21 Minuten, 24 Minuten, 27 Minuten bzw. 30 Minuten kontrolliert (n=8 pro Gruppe). Das Studienprotokoll finden Sie in Abbildung 1(E).

Alle Mäuse wurden 8 Wochen nach der IRI der linken Niere eingeschläfert. Ein Teil des linken Nierengewebes wurde für die anschließende RT-PCR- und Western-Blot-Analyse bei 70 °C gelagert, der andere Teil wurde zur histopathologischen Analyse in neutralem Formalin fixiert. Für biochemische Tests wurden Blutproben über den Sinus retroorbitalis entnommen.

Abbildung 1. Protokolle der einseitigen Ischämie-Reperfusionsverletzung (uIRI) mit verzögerter kontralateraler Nephrektomie. (A–C): Die linke Niere wurde am Tag 0 einer IRI unterzogen, und die Resektion der rechten Niere wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Tag 7, Tag 10 und Tag 14) entsprechend der ischämischen Dauer durchgeführt auf 24 Minuten festgelegt, wobei die Körperkerntemperatur während der Nierenischämie auf 37 °C festgelegt wurde. (D): Die linke Niere wurde am Tag 0 einer IRI unterzogen und die Resektion der rechten Niere wurde bei unterschiedlichen Körperkerntemperaturen (36 °C, 36,5 °C, 37 °C, 37,5 °C und 38 °C) mit der Ischämie durchgeführt Die Zeit der linken Niere wurde auf 24 Minuten festgelegt, und die rechte Niere wurde 14 Tage nach der IRI der linken Niere entfernt. (E): Die linke Niere wurde am Tag 0 einer IRI unterzogen, und die Resektion der rechten Niere wurde bei unterschiedlichen ischämischen Dauern (21 Min., 24 Min., 27 Min. und 30 Min.) durchgeführt, wobei die Körperkerntemperatur während der Niere auf 37 °C fixiert wurde Ischämie und die rechte Niere wurde 14 Tage nach der IRI der linken Niere entfernt. Nierengewicht, Nierenfunktion, histologische Nierenschädigung und Nierenfibrose wurden bis zum 56. Tag beurteilt.

Chirurgischer Eingriff

Vor der Operation fasteten alle Mäuse 12 Stunden lang mit freiem Zugang zu Wasser und erhielten intraperitoneale Injektionen mit 3 % Pentobarbital-Natrium (5 0 mg/kg). Während der Anästhesie wurde die Rektaltemperatur in verschiedenen Versuchsgruppen bei 36 °C, 36,5 °C, 37 °C, 37,5 °C bzw. 38 °C gehalten. Um dies zu erreichen, wurde die Maus mit dem Rücken auf ein Heizkissen (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Zhejiang, China) in einer Position mit ausgestrecktem Kopf und Hals gelegt, um sicherzustellen, dass ihre Atemwege erhalten blieben Die Augen waren mit warmer Kochsalzlösung bedeckt, um ein Austrocknen während des Eingriffs zu verhindern. Nach der Narkose wurden die Haare auf dem linken Rücken der Maus mit der Haarschneidemaschine rasiert. Anschließend wurde die Haut im Operationsbereich mit einem 75-prozentigen Alkoholtupfer abgewischt. Generell sinkt die Körpertemperatur der Maus nach der Haarrasur. Der chirurgische Eingriff wurde durchgeführt, als die Körperkerntemperatur konstant war, was etwa 15 Minuten dauern konnte. Die linke Niere konnte durch Einschneiden der linken Rückenhaut 0,5 cm neben der Mittellinie und 0,5 cm am unteren Rand des Brustkorbs der Maus sichtbar gemacht werden. Dann drückten wir den linken Bauch mit einer Hand zusammen, um die linke Niere aus der Körperhöhle herauszuholen, hoben die Niere mit einer stumpfen, gebogenen Pinzette an (wobei wir darauf achteten, dass die Niere nicht beschädigt wurde), lösten den Nierenstiel, klemmten ihn schnell ab und platzierten die Klemme Niere unter der Haut, um sie warm und mit Feuchtigkeit zu versorgen. Eine erfolgreiche Ischämie war durch einen allmählichen Farbwechsel der Niere von Rot nach Dunkelviolett gekennzeichnet, der in verschiedenen Versuchsgruppen jeweils 21 Minuten, 24 Minuten, 27 Minuten und 30 Minuten anhielt. Die Nierenfarbe änderte sich innerhalb von 2–5 Minuten nach Lösen der Klemme wieder zu Rot. Anschließend verschlossen wir die Bauchhöhle mit Lagennähten. Die rechte Rückenhaut und der rechte Muskel wurden jeweils am 7., 10. und 14. Tag nach uIRI in verschiedenen Versuchsgruppen eingeschnitten und die rechte Niere wurde reseziert. Anschließend wird die Wunde mit Standardnähten verschlossen. Nach jeder Operation wurden 500 lL Kochsalzlösung intraperitoneal injiziert, um den Flüssigkeitsverlust während der Operation auszugleichen. Gleichzeitig wurde die Maus etwa 2–3 Stunden lang auf einem Heizkissen gehalten, bis sie das volle Bewusstsein erlangte, bevor sie in den Wohnkäfig überführt wurde. Die Scheingruppe klemmte den Nierenstiel nicht ab und die übrigen chirurgischen Eingriffe entsprachen denen der uIRI-Gruppe. Alle chirurgischen Eingriffe wurden von derselben Person mit mehr als 2 Jahren Erfahrung in der Bedienung dieses Modells durchgeführt.

Nierenfunktionstest

Die SCr-Werte wurden mit dem Creatinine Kit (Jaffe Method, 100020170, Biosino Biotechnology and Science) gemessen. Die BUN-Werte wurden mit dem Urea Kit (Urease-Glutamat-Dehydrogenase-Methode, Biosino Biotechnology and Science) gemessen.

Bestimmung des Nierengewichts

Nach dem Urinieren wurde das Körpergewicht der Mäuse mit einer elektronischen Präzisionswaage gemessen. Frische Nieren wurden dreimal in vorgekühlter Kochsalzlösung gespült, dann wurde überschüssiges Wasser auf den Nieren mit Filterpapier abgetupft. Die Nierenkapseln wurden auf dem Eis abgezogen und die Nieren sofort gewogen. Zur Ermittlung des korrigierten Nierengewichts in mg/g wurde das Verhältnis von Nierengewicht zu Körpergewicht berechnet.

Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und Nierenschädigungs-Score

Mit neutralem Formalin fixiertes Nierengewebe wurde routinemäßig dehydriert, in Paraffin eingebettet, geschnitten (3 lm) und mit HE gefärbt, um die Schädigung des Nierengewebes zu beobachten. Zehn zufällig ausgewählte Felder der Nierenrinde jedes Abschnitts wurden mit Lichtmikroskopie bei 400-Vergrößerung erfasst. Zwei Pathologen beurteilten die Verletzung des Glomerulus und der Nierentubuli getrennt. Die tubuläre Verletzung wurde auf einer Skala von {{20}}–4 unter Verwendung der folgenden Kriterien bewertet [17]: 0, keine Verletzung; 1, betrifft 1–25 % der Nierenfläche; 2, betrifft 26–50 % der Nierenfläche; 3, betrifft 51–75 % der Nierenfläche; und 4, die 75–100 % der Nierenfläche betreffen. Der Grad der Tubulusverletzung wurde semiquantitativ durch Berechnung der Fläche der Nierentubulusverletzung bewertet. Die glomeruläre Verletzung wurde bewertet und auf einer Skala von 0–4 entsprechend der prozentualen Fläche der mesangialen Ausdehnung oder Sklerose unter Verwendung der folgenden Kriterien bewertet [17]: 0, normale Glomeruli; 1, 1–25 % der Fläche verletzt; 2, 26–50 % der Fläche verletzt; 3, 51–75 % der Fläche verletzt; und 4, 76–100 % der Fläche verletzt. Der endgültige glomeruläre Schadenswert beträgt ¼ 0 (% Glomeruli Grad 0) þ 1 (% Glomeruli Grad 1) þ 2 (% Glomeruli Grad 2) þ 3 (% Glomeruli Grad 3) þ 4 (% Glomeruli Grad 4). Pro Maus wurden mehr als 50 Glomeruli bewertet.

Massons Trichrom-Färbung

Mit neutralem Formalin fixiertes Nierengewebe wurde routinemäßig dehydriert, in Paraffin eingebettet, geschnitten (3 µm) und mit Massons Trichrom gefärbt, um Nierenfibrose zu beobachten. In Massons Trichrom-gefärbten Schnitten wurden zwanzig nicht überlappende Felder der Nierenrinde bei 200-facher Vergrößerung erfasst. Für die automatische Messung und Analyse wurde die Bildanalysesoftware Image-Pro Plus verwendet. Der Prozentsatz der fibrotischen Fläche wurde verwendet, um das Ausmaß der interstitiellen Nierenfibrose zu ermitteln [8].

RT-PCR

Die gesamte mRNA wurde mit Trizol aus dem Nierengewebe jeder Gruppe extrahiert und ihre Konzentration gemessen, dann wurde sie in cDNA umgewandelt (Taka Reverse Transcription Kit). Die Taqman-Fluoreszenzmethode (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR) wurde verwendet, um die RNA-Expression von Fibronektin (FN) und Kollagen I (COL-I) in Nierengeweben zu quantifizieren. Spezifische Primer wurden für FN (vorwärts: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 und rückwärts: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30) und COL-I (vorwärts: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{) verwendet. {9}} und umgekehrt: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (bereitgestellt von Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China). Die Verstärkungsbedingungen sind wie folgt: 95 °C für 30 s, 95 °C für 5 s, 60 °C für 30 s, 40 Zyklen; 95 C für 10 s, 65 C für 5 s und 95 C/5 C. Nach der Analyse der Amplifikationskurven und Löslichkeitskurven der Produkte wurden die relativen mRNA-Spiegel mit der vergleichenden CT-Methode (2-DDCt) bestimmt. mit 18SrRNA (vorwärts: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 und rückwärts: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) als interne Referenz.

Western-Blot

Zur Lyse des Nierengewebes wurde Radio-Immunpräzipitationsassay (RIPA)-Lysepuffer verwendet und die Proteinkonzentration wurde mit der BCA-Methode bestimmt. Mithilfe einer Gradientengelelektrophorese wurden die Proteine ​​aus 5 0 μg Proben abgetrennt. Anschließend wurden die Proteine ​​auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Nach dem Blockieren mit 5 % fettfreier Milch für 2 Stunden wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit monoklonalem Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper gegen a-Glattmuskel-Aktin (a-SMA) (1:1000, Nr. 19245, Cell Signaling Technology) geblottet ), FN (1:1000, Nr. ab2413, ABCam) bzw. COL-I (1:1000, Nr. 72026, Cell Signaling Technology). Am nächsten Tag wurden die Membranen erneut für 0,5 Stunden bei Raumtemperatur erwärmt. Nach dem Waschen mit TBST wurden die Membranen mit HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG(H þ L) (1:1000, Nr. BA1054, BOSTER Biological Technology) 2 Stunden lang inkubiert. Nach erneutem Waschen mit TBST wurden sie mit dem hochempfindlichen ECL-Chemilumineszenzreagenz angefärbt, um die Immunoblots sichtbar zu machen. b-Actin wurde auf derselben Membran wie die interne Referenz gemessen. Die Proteinexpression wurde durch Quantifizierung der relativen Expression von Zielproteinen im Vergleich zu b-Actin bestimmt.

Daten und statistische Analyse

Alle untersuchten Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Vergleiche zwischen den beiden Gruppen wurden durch einen unabhängigen T-Test ermittelt. Auf Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurde durch eine einfaktorielle ANOVA zugegriffen, wenn die Datenverteilung normal und die Varianz homogen war. Bei heterogener Varianz wurde die Welch-ANOVA zur Bewertung der statistischen Signifikanz verwendet, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche. Alle statistischen Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 8.0 durchgeführt. p < 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen.