Die Gesamtglykoside von Cistanche Deserticola fördern die Wiederherstellung der neurologischen Funktion, indem sie die neurovaskuläre Regeneration induzieren
Mar 29, 2022
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Fujiang Wang1, Ruiyan Li 2, Pengfei Tu1, Jianping Chen3, Kewu Zeng1* und Yong Jiang1*
Hintergrund:Die traditionelle chinesische Medizin Cistanche deserticola soll bei kardiovaskulären und zerebrovaskulären Erkrankungen wirksam sein. Seine aktiven Komponenten zum Schutz vor ischämischem Schlaganfall sind jedoch nicht klar. Unser Ziel war es, die aktiven Komponenten von C. deserticola gegen ischämischen Schlaganfall sowie seine potenziellen Mechanismen zu erforschen.
Methoden:Wir untersuchten die hirnschützenden Wirkungen von Extrakten aus C. deserticola, Gesamtglycosiden (TGs), Polysacchariden (PSs) und Oligosacchariden (OSs) in einem Rattenmodell für Verschluss-Reperfusion der mittleren Hirnarterie (MCAO/R). 2, 3, 5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung wurde verwendet, um das Hirninfarktvolumen zu bestimmen, und Evansblue-Assay wurde verwendet, um die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu bestimmen. Dann die Ausdrücke CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin,Keap-1 und Nrf{{13 }} wurden unter Verwendung von Western-Blotting oder Immunfluoreszenz analysiert, und die Aktivitäten MDA, SOD, CAT und GSH-Px wurden unter Verwendung von Kits analysiert.
Ergebnisse:Die Behandlung mit TG verringerte bemerkenswert die Werte für neurologische Defizite und das Infarktvolumen, förderte die Angiogenese und den neuralen Umbau und hielt die Integrität der Blut-Hirn-Schranke im Vergleich zur Modellgruppe wirksam aufrecht. Darüber hinaus senkten TGs die MDA-Spiegel signifikant und erhöhten die antioxidativen Aktivitäten (SOD, CAT und GSH-Px) im Gehirn. Unterdessen regulierten TGs die Keep-1-Expression bemerkenswert herunter und erleichterten die Nrf-2-Kerntranslokation. Im Gegensatz dazu wurden keine Schutzwirkungen für PSs- und OSs-Gruppen beobachtet.
Fazit:TGs sind die wichtigsten aktiven Komponenten von C. deserticola gegen MCAO/R-induzierte Hirnschädigung, und der Schutz erfolgt hauptsächlich über den Nrf-2/Keap-1-Weg.
Schlüsselwörter:Cistanche Deserticola,Hirnverletzung, Gesamtglykoside, Polysaccharide, Oligosaccharide, Nrf-2/Keap-1-Weg
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EINLEITUNG
Schlaganfälle gelten weltweit als eine der Hauptursachen für Tod und Behinderung (Donnan et al., 2008). Fast 87 Prozent aller Schlaganfallfälle werden durch einen ischämischen Schlaganfall ausgelöst (Ovbiagele und Nguyen-Huynh, 2011). Gegenwärtig ist der rekombinante Gewebe-Plasminogen-Aktivator das wirksamste Mittel und das einzige von der FDA zugelassene Medikament zur Behandlung des ischämischen Schlaganfalls. Aufgrund des engen therapeutischen Zeitfensters und des erheblichen Risikos von Blutungskomplikationen sprechen jedoch viele Schlaganfallpatienten nicht auf dieses Medikament an (Lee et al., 2012; Schellinger und Kohrmann, 2014). Eine Hauptherausforderung der thrombolytischen Behandlung ist eine Ischämie/Reperfusions(I/R)-Verletzung, die als die Hauptursache von Hirnverletzungen und Funktionszerstörung angesehen wird. Reperfusion nach zerebraler Ischämie erhöht das Risiko einer Hirnblutung, führt zu neurovaskulären Verletzungen und produziert übermäßig reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die die Blut-Hirn-Schranke schädigen (Alluri et al., 2015). Eine Reihe von Studien hat bestätigt, dass die Unterbrechung der BBB eine Hauptursache für die Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls ist (Cao et al., 2016b).
Die BBB besteht hauptsächlich aus Endothelzellen, Perizyten, Astrozyten, Neuronen und Basalmembranen. Die Kernkomponenten der BBB sind zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen, die durch Tight Junctions verbunden sind, wodurch exogene Moleküle in das Gehirn eingeschränkt werden. Die pathologischen Veränderungen der Tightjunctions – insbesondere Occludin, Claudin-5 und Zonulaoccludens-1 (ZO-1) – beeinflussen signifikant die BBB-Funktion während eines ischämischen Schlaganfalls, insbesondere die Barrierepermeabilität (Liuet al., 2014 ; Hu et al., 2018; Liu et al., 2019). Während I/R-Perioden ist übermäßiges ROS einer der Hauptfaktoren, die zu einer direkten Schädigung von Gehirnneuronen führen (Ding et al., 2014). Die Überproduktion von ROS führt zum Abbau bestimmter Verbindungen und zur Unterbrechung der BHS, was dazu führt, dass exogene Moleküle durch die BHS in das Gehirn gelangen, was zu einer Verschlimmerung der Hirnschädigung führt (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Daher wurde der Schutz der BHS durch Antioxidantien als ein möglicher Weg zur Verhinderung einer Reperfusionsschädigung angesehen.
Neben dem Zusammenbruch der BBB kann I/R zu neurovaskulären Verletzungen und neuronalem Tod führen (Jung et al., 2010). Während eines Schlaganfalls kann ein erhöhter neuronaler Zelltod durch oxidativen Stress (Chi et al., 2018) und zahlreiche Studien verursacht werden haben gezeigt, dass ROS die Schlaganfallschwere und neurologische Schäden verschlimmert (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Obwohl klinische Studien keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt haben, ist die Neuroprotektion immer noch eine vielversprechende Strategie zur Behandlung des akuten ischämischen Schlaganfalls (Moretti et al., 2015). Daher ist das Auffinden wirksamer Neuroprotektionsmedikamente zur Behandlung von Schlaganfällen ein Vorteil für Schlaganfallpatienten.
Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) ergreift Maßnahmen, um gegen das körpereigene Ungleichgewicht einzugreifen (Gaire, 2018). Aufgrund der komplexen Pathogenese ischämischer Schlaganfälle spielt die multifaktorielle Wirkung der TCM und ihrer Wirkstoffe eine entscheidende Rolle bei der Behandlung von Schlaganfällen. Cistanche deserticola YC Ma, weit verbreitet in trockenen oder halbtrockenen Gebieten in der gesamten Mongolei und im Nordwesten Chinas, ist seit mehr als 1,000 Jahren in China ein weit verbreitetes TCM-Kraut zur Behandlung verschiedener Krankheiten wie Vergesslichkeit und Depression. Moderne pharmakologische Studien zeigten, dass die Rohextrakte aus C. Deserticola zeigte mehrere pharmakologische Aktivitäten, wie z. B. Verbesserung der Lern- und Gedächtnisfunktion, Neuroprotektion, Verbesserung der Immunität, Antioxidantien, Anti-Aging- und Anti-Müdigkeitseffekte (Ko und Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015).Chemische Analyse von C. deserticola zeigte, dass seine Hauptbestandteile Phenylethanoidglykoside, Iridoidglykoside, Polysaccharide und Oligosaccharide umfassen (Jiang und Tu, 2009). Die aktiven Komponenten von C. deserticola zum Schutz des Gehirns sind jedoch nicht sehr klar.
Die neuroprotektive Eigenschaft von C. deserticola impliziert sein therapeutisches Potenzial bei kognitiven Erkrankungen wie Schlaganfall und Depression sowie der Alzheimer-Krankheit (Wang et al., 2017). Die Forschung über die Auswirkungen von C. deserticola auf Schlaganfälle, einschließlich seiner aktiven Komponenten und Wirkungsmechanismen, ist jedoch sehr begrenzt. In der aktuellen Arbeit untersuchten wir die Schutzwirkung von drei Extrakten aus C. deserticola, Gesamtglykoside (TGs, Phenylethanoidglykoside und andere Glykoside), Polysaccharide (PSs) und Oligosaccharide (OSs) auf zerebrale I/R-Verletzungen. Unsere Ergebnisse können zur genauen klinischen Anwendung von C. deserticola beitragen und einen Wirkstoffkandidaten für die Therapie des ischämischen Schlaganfalls liefern.
Cistanche hat ttherapeutisches Potenzialbei kognitiven Erkrankungen wie Schlaganfall und Depression,sowie die Alzheimer-Krankheit.
MATERIALEN UND METHODEN
Chemikalien und Reagenzien
Die Stängel von Cistanche deserticola wurden von Alashan, Innere Mongolei, gekauft und von einem der Autoren (P.-F. Tu) identifiziert. TGs, PSs und OSs wurden gemäß unserer zuvor beschriebenen Methode hergestellt (Gao et al., 2015). . Die quantitative Analyse von TGs wurde wie zuvor beschrieben (Li et al., 2019) durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) durchgeführt, und ihr Chromatogramm ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Hauptbestandteile von TGs sind Echinacosid, Tubulosid A, Acteosid, Isoacteosid und 2'- Acetylacteosid; ihre Gehalte betragen 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g bzw. 12,045 mg/g. Die Gehalte an PS und OS betragen 69,42 Prozent bzw. 65,24 Prozent, wie durch HPLC bzw. die Phenol-Schwefelsäure-Analyse bestimmt (Zhang A. et al., 2018; Shi et al., 2019).
Die Standardreferenzen von Echinacosid (A0282), Tubuloside A (A0942), Acteosid (A0280), Isoacteosid (A0281) und 2'-Acetylacteosid (A0943) wurden von Chengdu MustBiotechnology (Sichuan, China) bezogen. Die Reinheiten aller Standards liegen bei über 98 Prozent. Nissl-Stain-H&E-Kits wurden von Boster (Wuhan, China) gekauft. Edaravone (T0407-1) wurde von TargetMol (Shanghai, China) gekauft. Kaninchen-anti-Ratte-MAP-2 (ab32454), Nrf-2(ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) und Maus-anti-Ratte-CD31 (ab24590) wurden gekauft von Abcam Inc (Cambridge, MA, USA). Kaninchen-Anti-Ratte Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) und Occludin (BS72035) wurden von Bioworld Technology (Nanjing, China) gekauft. Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) war die Quelle von Kaninchen-Anti-Ratte-Synapsin -1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-SmoothMuscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) wurde von Proteintech Group, Inc. (Chicago, USA) erworben. Sekundärantikörper wurden von Zhongshan GoldenBridge Biotechnology (Peking, China) geliefert. Hoechst 33258 wurde von Beyotime (Jiangsu, China) erhalten.
ABBILDUNG 1|Die HPLC-Chromatogramme der TGs (A) und Standardreferenzen (B).
Tiere
Sprague-Dawley-Ratten (männlich, Gewicht 250–300 g) wurden von Vital River Laboratory Animal Technology (Peking, China) erhalten und in einem klimatisierten Raum gehalten, der auf einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten wurde. Alle Tierversuche wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien für Tierforschung (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee des HealthScience Center der Universität Peking (LA2019123) genehmigt.
Tierversuchsprotokolle
Die Ratten wurden MCAO/R ausgesetzt, wie zuvor beschrieben (Wang et al., 2018). Kurz gesagt, die linke gemeinsame Halsschlagader (CCA), die äußere Halsschlagader (ECA) und die innere Halsschlagader (ICA) wurden freigelegt, und eine 3-0 Nylon-Monofilamentnaht wurde von der ECA in die ICA eingeführt, bis sie die mittlere Hirnarterie erreichte ( MKA). Nach 1,5 h MCA-Okklusion wurde Reperfusion durch Entfernen des Filaments simuliert. Während des chirurgischen Eingriffs wurde die Körpertemperatur aller Ratten auf 37,0 Grad gehalten.
Arzneimittelverwaltung
Die Ratten wurden unter Verwendung der SPSS-Software Version 22.0 wie beschrieben zufällig in sechs Gruppen aufgeteilt (Jiang et al., 2014): Normalgruppe (NOR); Modellgruppe (MOD); Edaeavon-Gruppe (positiver Arzneistoff, 6 ml/kg, EDI); TGs-Gruppe (280 mg/kg, TGs); PSs-Gruppe (280 mg/kg, PSs) und OSs-Gruppe (280 mg/kg, OSs). TGs, PSs und OSs wurden 14 Tage lang einmal täglich nach MCAO/R verabreicht. Die NOR- und MOD-Gruppen wurden mit normaler Kochsalzlösung behandelt. Die Tiernummern sind in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1|Anzahl der Tiere für verschiedene Versuchsgruppen und verschiedene Parameter 14 d nach Verabreichung.
Gewichtsmessung und modifizierte neurologische Defizitwerte (mNSS)
Das Körpergewicht wurde am 14. Tag mit einer ADVENTURE™ Digitalwaage (OHAUS, New Jersey, USA) überwacht. Die NSS wurde nach der von FJ Wang (Wang et al., 2018) beschriebenen Methode mit geringfügigen Überarbeitungen bewertet.
2, 3, 5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung
Das Infarktvolumen wurde wie zuvor beschrieben gemessen (Wanget al., 2015). Kurz gesagt wurden die Gehirne in sieben gleich beabstandete koronale Blöcke (2 mm) geschnitten. Diese Schnitte wurden mit 2 Prozent TTC (Coolaber, Peking, China) bei 37 Grad für 15 Minuten gefärbt. Infarktvolumen (Prozent)=(ipsilaterales ischämisches Hemisphärenvolumen − kontralaterales ischämisches Hemisphärenvolumen)/kontralaterales ischämisches Hemisphärenvolumen × 100.
Nissl- und H&E-Färbung
Die Ratten wurden tief anästhesiert und das gesamte Gehirn wurde dann schnell aus dem Schädel entfernt und unter Verwendung von 4 % Paraformaldehyd fixiert und in Paraffinwachs eingebettet und in 7 um dicke Scheiben geschnitten. Die Schnitte wurden mit Nissl und H&E gefärbt. In dieser Studie wurden sechs zufällige 200 × 200-µm-Felder in jeder Gewebeprobe mit einem Lichtmikroskop erfasst. Die Zahl der Leichen von Nissl wurde mit der IPP-Software Version 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, USA) gezählt.
Evans Blue-Assay
Ratten wurde 2 % EB (Coolaber Science & Technology Co., LTD) nach MCAO/R injiziert. Zwei Stunden später wurden die Ratten anästhesiert und das gesamte Gehirn wurde dann schnell entfernt und in Aceton homogenisiert. Die Überstände wurden bei 620 nm mit einem 800 TS-Absorptionslesegerät (BioTek, USA) analysiert.
Messung der Aktivitäten von Katalase (CAT), Superoxiddismutase (SOD), Malondialdehyd (MDA) und Glutathionperoxidase (GSH-Px)
Alle Serumproben wurden bei 4,000 × rpm für 15 min bei 4 Grad zentrifugiert und dann analysiert, um die Aktivitäten von MDA, CAT, SOD und GSH-Px nach den Anweisungen des Herstellers (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd.) nachzuweisen , China).
Western-Blotting-Analyse
Von jeder Ratte gesammeltes Hirngewebe (100 mg) wurde homogenisiert und in RIPA-Lysepuffer lysiert und dann analysiert, um die Proteinkonzentration unter Verwendung eines BCA-Kits (Beijing TransGenBiotech Co., Ltd.) nachzuweisen. Gesamtproteine des Gewebes wurden auf 10-prozentige SDS-PAGE-Gele geladen und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membran wurde unter Verwendung von 5-prozentiger Magermilch blockiert und dann über Nacht mit primären Antikörpern bei 4 Grad inkubiert. Die Membran wurde dann mit einem sekundären Antikörper inkubiert. Die Western-Blot-Analyse wurde unter Verwendung des Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, China) analysiert.
Immunfluoreszenzanalyse
Immunfluoreszenzfärbung für CD31, a-SMA, ZO-1, Claudin5, Occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 und Keap-1 wurden durchgeführt. Primärantikörper gegen Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, Claudin5, Occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 und Keap-1 wurden auf verdünnt 1:200 bzw. 1:100. Die sekundären Antikörper von Alexa Flur 488 Maus-Anti-Kaninchen-IgG und Rhodamin (TRITC)-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG wurden beide auf 1:200 verdünnt. Die Kerne wurden mit Hoechst 33258 gefärbt. Bilder wurden unter Verwendung des Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA) aufgenommen. Die Proteinexpression wurde unter Verwendung der IPP-Softwareversion 6.0 analysiert.
Statistische Analyse
Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung beschrieben. SPSS-Softwareversion 22.0wurde für die statistische Analyse durchgeführt. Beim Vergleich verschiedener Gruppen wurde eine Einweg-ANOVA verwendet. P < 0,05="" wurde="" als="" statistische="" differenz="">
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ERGEBNISSE
TGs erhöhen das Körpergewicht und reduzieren Hirnschäden bei MCAO/R-Ratten
Nach 14 Tagen Heilung mit TGs, PSs, Oss und EDI wurden die Körpergewichte, neurologischen Defizite und Infarktvolumina von I/R-Ratten bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Körpergewichte in der MOD-Gruppe stark verringert waren, während die verringerten Gewichte in den TGs-, PSs- und EDI-Gruppen offensichtlich erhöht waren (Abbildung 2A). Die neurologischen Defizitwerte wurden durch EDI und TGs erheblich gesenkt (Abbildung 2B). Die Gehirnschnitte bei Ratten der NOR-Gruppe waren tiefrot und es gab keine Infarkte, während die Ratten der MOD-Gruppe einen großen ipsilateralen Hirninfarkt zeigten. Nach der TGs-Behandlung waren die Infarktvolumina signifikant reduziert (Abbildungen 2C, D). Die Behandlung mit PSs und OSs zeigte keine offensichtliche Wirkung auf die obigen Indizes. Die obigen Daten zeigten, dass TG die I/R-induzierte zerebrale Verletzung deutlich mildern konnte, PS und OSs dies jedoch nicht konnten.
ABBILDUNG 2|TGs reduzieren den durch transiente fokale zerebrale Ischämie induzierten Hirnschaden.
TGs verbessern den histopathologischen Schaden bei MCAO/R-Ratten
Um einige der Wirkungen der TGs-, PSs- und OSs-Behandlung auf histopathologische Schäden zu bestimmen, wurde eine H&E-Färbung durchgeführt, um pathologische Schäden aufzudecken. Die histomorphologischen Strukturen der Gehirne in der NOR-Gruppe wurden regelmäßig angeordnet. Die morphologischen Veränderungen in den TGs-Gruppen waren geringer als in der MOD-Gruppe. Die PSs- und OSs-Behandlungsgruppen zeigten jedoch keine signifikante Besserung der morphologischen Veränderungen (Abbildung 3).
TGs dämpfen neuronale Verletzungen nach I/R-induzierten Ratten
Nissl-Färbung zeigte die histopathologischen Veränderungen von Neuronen im Halbschatten des ischämischen Bereichs. Wie in Abbildung 4 gezeigt, hatten die normalen Neuronen einen klaren Nukleolus und eine intakte Struktur. In der MOD-Gruppe hatten die Neuronen vergrößerte Interzellularräume. Die Nisslkörper waren verschwunden, geschrumpft und tief verschmutzt. Diese Veränderungen wurden jedoch selten in den EDI-, TGs- und PSs-Gruppen beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, dass TGs und PSs die durch Ischämie/Reperfusion induzierte neuronale Schädigung signifikant abschwächen konnten.
TGs dämpfen BBB-Unterbrechung nach I/R-behandelten Ratten
Evans Blue Assay ist eine klassische Methode zur Untersuchung der Veränderung der BBB-Permeabilität. Die Versuchsergebnisse zeigten, dass in der MOD-Gruppe ein erhöhtes Evans-Blau beobachtet wurde, während bei den mit TGs und EDI behandelten Ratten ein signifikant verringertes Evans-Blau auftrat. Darüber hinaus gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den PS- und OS-Therapiegruppen (Abbildung 5). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass TGs eine Unterbrechung der BHS signifikant abschwächen könnten.
ABBILDUNG 3|TGs verbessern histopathologische Schäden bei MCAO/R-Ratten.
TGs fördern die Angiogenese in I/R-verletzten Ratten
Neuere Studien zeigen, dass die Angiogenese eine entscheidende Rolle bei der neurologischen Funktionswiederherstellung und dem prognostischen Ergebnis nach einem akuten ischämischen Schlaganfall spielt (Yuen et al., 2015). Um die Wirkungen von TGs, PSs und OSs auf die Angiogenese zu bewerten, wurden CD31 und a-SMA verwendet, um die Kapillarzahlen zu quantifizieren. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass die MOD-Gruppe im Vergleich zu den normalen Ratten eine bemerkenswerte Abnahme der Expression von CD31 ( 6A , B) und a-SMA ( 6C , D) im Halbschatten ischämischer Bereiche von I/R-Ratten verursachte. Dieses Ergebnis veranschaulichte, dass I/R Gefäßschäden in der Cortex-Penumbra von ischämischen Hemisphären verursachen könnte. Die TGs und die EDI-Behandlung erhöhten jedoch bemerkenswert die Kapillardichte, Angiogenese und Arteriogenese, wie durch erhöhte Expressionen von CD31 und a-SMA angezeigt wird. Diese Ergebnisse legen nahe, dass TGs die Angiogenese im ischämischen Halbschatten von I/R-Ratten fördern könnten, die PSs und OSs dies jedoch nicht könnten.
TGs erhöhen die Expression von Tight-Junction-Proteinen in I/R-verletzten Ratten
Eine Störung der BHS kann den Wassergehalt im Gehirn und die Gewebeschwellung erhöhen, was zu Hirnverletzungen führt. Tight Junction Proteine sind wichtige strukturelle Komponenten der BBB (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Um zu testen, ob die Behandlung mit TGs, PSs und OSs nach einem Schlaganfall die BHS-Integrität beeinflussen könnte, wurden die Expressionen von ZO-1, Claudin-5 und Occludin durch Immunfluoreszenzanalyse durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von Claudin-5, Occludin und ZO-1 in der MOD-Gruppe sichtbar verringert war. Sie waren jedoch nach 14 Tagen TG-Verabreichung wesentlich erhöht. PSs- und OSs-Gruppen zeigten keine signifikanten Änderungen in diesen Proteinexpressionen (Abbildung 7). Diese Daten zeigten, dass die TGs die Expression von Tight Junction-Proteinen regulieren und wahrscheinlich die BBB-Integrität nach einer I/R-Verletzung aufrechterhalten können.
TGs erhöhen die Perizytenbedeckung auf Kapillaren bei I/R-verletzten Ratten
Die Bedeckung von Kapillaren mit Perizyten spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der BBB-Integrität (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Daher testeten wir, ob die Perizytenabdeckung durch die Behandlung mit TGs, PSs und OSs erhöht werden konnte. Die Ergebnisse der Immunfluoreszenz-Intensitätsanalyse zeigten, dass sowohl die PDGFRb- als auch die CD31-Expression in der MOD-Gruppe dramatisch verringert waren. Die Verabreichung von TG an die I/R-Ratten erholte sich signifikant oder erhöhte sogar die Expressionsintensitäten von PDGFRb und CD31, aber es wurde kein Unterschied in den PSs- und OSs-Behandlungsgruppen beobachtet ( 8 ). Somit könnte die Behandlung von TGs die Perizytabdeckung signifikant erhöhen. Diese Ergebnisse bestätigten weiter, dass TGs die Integrität von BBB nach I/R aufrechterhalten können.
TGs fördern neurales Remodeling in I/R-geschädigten Ratten
Laut zahlreichen Studien kann die Neurogenese nach einem Schlaganfall die funktionelle Erholung signifikant verbessern (Grefkes andWard, 2014; Zhang et al., 2019). Synaptophysin (SYN), postsynaptische Dichte 95 (PSD-95)-Proteine und Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP-2) wurden als Marker verwendet, um die neuronale Plastizität in der ischämischen Penumbra des Kortex zu untersuchen. Um die Wirkungen der TGs-, PSs- und OSs-Behandlung auf die Neurogenese bei I/R-verletzten Ratten zu bewerten, wurden die Immunfluoreszenz und der Western-Blot für SYN-, PSD95- und MAP-2-Expressionen durchgeführt. Wie in den Abbildungen 9 und 10 gezeigt, nahmen die SYN-, PSD95- und MAP-2-Expressionsniveaus in I/R-Ratten nach 14 Tagen Reperfusion im Vergleich zu den NOR-Ratten ab, während die TGs- und PSs-Heilung ihre Expressionsniveaus signifikant hochregulieren konnte . Die OSs-Gruppe hatte keine signifikante Veränderung im Vergleich zur MOD-Gruppe. Die Daten zeigten, dass die TGs- und PSs-Heilung in der Lage war, die neurale Remodellierung nach einer I/R-Verletzung dramatisch zu fördern.
TGs Alter Nrf-2- und Keep-1-Ausdrücke in I/R-verletzten Ratten
Oxidativer Stress ist ein wichtiger pathogener Mechanismus bei I/R-Verletzungen (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Die Studien bestätigten, dass Nrf-2 ein Hauptregulator antioxidativer Reaktionen ist (Thompson et al., 2015). Um die durch Nrf-2 und Keap-1 vermittelten oxidativen Reaktionen nach einer I/R-Verletzung zu untersuchen, untersuchten wir die zytoplasmatische Expression sowie die nukleare Translokation von Keap-1. Inzwischen wurde die Expression von Nrf{{7 }} im Gehirngewebe von I/R-verletzten Ratten wurde ebenfalls untersucht (Fig. 10 und 11). Gemäß der Immunfluoreszenzanalyse wurde festgestellt, dass Nrf-2 hauptsächlich im Zytoplasma in der NOR-Gruppe lokalisiert ist. In der TGs-Gruppe war die Expression von Nrf-2 in der zytoplasmatischen Lokalisation herunterreguliert, aber im Zellkern hochreguliert, und es wurde auch eine verringerte Keap-1-Expression beobachtet. Die Daten zeigten, dass der Gehirnschutz von TGs mit der Modulation von Nrf-2 und Keap-1 assoziiert sein könnte.
ABBILDUNG 4|TGs dämpfen die neuronale Verletzung nach I/R-behandelten Ratten.
TGs dämpfen oxidativen Stress im Gehirngewebe bei I/R-verletzten Ratten
Um die antioxidativen Wirkungen von TGs zu bestätigen, wurden die Aktivitäten von SOD, CAT, GSH-Px und MDA bei I/R-verletzten Ratten bewertet. In Abbildung 12 war der MDA-Gehalt in der MOD-Gruppe deutlich erhöht, und gleichzeitig waren die Aktivitäten von SOD, CAT und GSH-Px im Vergleich zu den normalen Ratten verringert. Umgekehrt führte die Behandlung mit TGs zu einer signifikanten Verringerung im Gehalt von MDA und eine Zunahme der Aktivitäten von SOD, CAT und GSH-Px. Diese Ergebnisse bestätigten weiter die Antioxidationsaktivität von TGs.
DISKUSSION
Viele Studien legen nahe, dass die TCM C. deserticola umfangreiche biologische Aktivitäten hat, z. B. die Verbesserung der Lernfähigkeit, des Gedächtnisses und der Immunität (Dong et al., 2007; Jiang und Tu, 2009; Wanget al., 2017; Xia et al., 2018 ). Die aktiven Komponenten von C. Deserticola für die Neuroprotektion bleiben unklar. Die aktuelle Arbeit zielt darauf ab, die aktiven Komponenten von C. deserticola gegen ischämischen Schlaganfall auf dem MCAO/R-Modell zu screenen. Drei Extrakte aus C. deserticola (TGs, PSs und OSs) wurden verwendet, um ihre Wirkungen auf MCAO/R-Ratten sowie mögliche Mechanismen zu bewerten.
Schlaganfall ist eine häufige akute zerebrovaskuläre Erkrankung. Epidemiologische Studien zeigen, dass Schlaganfälle häufiger bei Männern als bei Frauen auftreten (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik und Bushnell, 2017). Daher wurden in unserem Experiment männliche Ratten für die Tests angenommen. Unsere Ergebnisse bewiesen, dass die I/R-Induktion den oxidativen Stress und das Infarktvolumen beschleunigte, die BBB brach und zu Nerven- und zerebrovaskulären Verletzungen führte. Nach dem Screening wurde festgestellt, dass TGs das Infarktvolumen verringern und neurale Remodellierung und Angiogenese fördern. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass TGs die BBB-Integrität nach einer I/R-Verletzung aufrechterhielten. Im Gegensatz dazu bringen PSs und OSs keine signifikante Linderung der I/R-Verletzung. Daher gelten TGs als die wichtigste aktive Fraktion von C. deserticola für die Neuroprotektion, möglicherweise durch Förderung der neuralen Umgestaltung, Angiogenese und BHS-Integrität durch Aktivierung des Nrf-2/Keap-1-Signalwegs.
ABBILDUNG 5|TGs dämpfen BHS-Unterbrechung nach I/R-Verletzung.
Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass die Etablierung eines effektiven Kollateralkreislaufs von erheblicher Bedeutung ist, um die Bildung von Infarkten und ischämischen Halbschatten zu vermeiden, und eine entscheidende Behandlung in einem frühen Stadium eines ischämischen Schlaganfalls darstellt (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Die Proliferation von vaskulären Endothelzellen und glatten Muskelzellen nach einem ischämischen Infarkt bestimmt die Etablierung einer kollateralen Zirkulation. Die Ischämiemodelle haben jedoch ein gemeinsames Phänomen – nämlich oxidativer Stress, der in der Mikrovaskulatur des Gehirns weit verbreitet war. Studiendaten haben gezeigt, dass eine Vielzahl von Antioxidantien die Funktion der BHS und die Eigenschaften der Angiogenese stören können (Mentor und Fisher, 2017). CD31 und a-SMA sind die Marker von vaskulären Endothelzellen bzw. glatten Muskelzellen (Saboor et al., 2016). Um die Wirkung der Extrakte aus C. deserticola auf die oben erwähnte Zellproliferation zu untersuchen, untersuchten wir die Expression von CD31 und a-SMA im zerebralen ischämischen Penumbra-Homogenat. Unsere Daten zeigten, dass TGs die Expression von CD31 und a-SMA deutlich verstärkten. Es gab jedoch keine signifikanten Unterschiede für PSs- und OSs-Gruppen. Daher folgerten wir, dass TGs Hirnschäden reduzieren können, indem sie die Angiogenese fördern, indem sie die Expression von CD31 und a-SMA erhöhen, wohingegen PSs und OSs keinen solchen Schutz vor Hirnschäden bieten. Diese Ergebnisse bestätigten weiter, dass nur TG zerebrale I/R-Verletzungen verhindern konnte.
Ischämischer Schlaganfall kann als Folge einer zerebralen Ischämie angesehen werden, die durch eine Beeinträchtigung der neuronalen Plastizität oder Umgestaltung von Gehirnbereichen verursacht wird. Die Mehrzahl der Schlaganfallpatienten leidet unter neurologischen Defiziten. Die Aktivierung der Neurogenese ist eine vielversprechende Strategie für Schlaganfallpatienten zur Verbesserung ihrer neurologischen Funktionen (Cramer und Chopp, 2000). Die Neurogenese ist direkt an der Wiederherstellung der neurologischen Funktion nach Hirn-I/R-Verletzung beteiligt (Zhang et al., 2019). Frühere Forschungen zeigen, dass TGs die Überlebensrate von Hippocampus-Pyramidenzellen verbessern und Neurogenese induzieren können (Lian et al., 2017). Oxidativer Stress verursacht den Verlust von Neuronen bei vielen Krankheiten wie Parkinson, Schlaganfall usw. (Duan und Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2transkribiert viele Gene, die mit der Neuroprotektion in ihrer Promotorregion zusammenhängen, hauptsächlich einschließlich SOD, MDA, CAT und g-Glutamylcystein-Ligasen usw. (Satoh et al., 2006). SYN-, PSD-95- und MAP-2-Proteine, die eng mit Synapsenbildung und Neurotransmission assoziiert sind, können als Marker für die neuronale Plastizität der Forschung in der ischämischen Halbschattenregion betrachtet werden TGs konnten die Expression von PSD95, SYN und MAP-2 signifikant erhöhen, was darauf hindeutet, dass der zerebrale Schutz von TGs mit der verbesserten neuronalen Plastizität während I/R korrelierte. Schade ist jedoch, dass es auch für PSs keinen offensichtlichen Unterschied gibt als Betriebssystemgruppen. Diese Ergebnisse zeigten, dass TGs die Neuroplastizität nach zerebraler I/R-Verletzung verbessern könnten.
Bildgebende Untersuchungen bei Schlaganfallpatienten zeigten, dass eine BHS-Dysfunktion als auffälliges Attribut des periischämischen Gehirns angesehen werden kann (Bang et al., 2007). Die TJs, die aus zytoplasmatischen Proteinen, Transmembranproteinen und Verbindungsadhäsionsmolekülen zwischen kapillaren Endothelzellen bestehen, sind sehr wichtig für die Aufrechterhaltung der BBB-Integrität (Ye et al., 2019). Darunter sind ZO-1, Claudin-5 und Occludin die wichtigsten Proteine in TJs. Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass die durch Ischämie induzierte erhöhte Permeabilität der BBB im Allgemeinen mit den Veränderungen von ZO-1, Claudin-5 und Occludin korreliert (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al ., 2017; Liu et al., 2018). In dieser Arbeit zeigten die Ergebnisse, dass, obwohl TGs die Expression von ZO-1-, Claudin-5- und Andoccludin-Proteinen in MCAO-induzierten Gehirngeweben signifikant erhöhen konnten, weder PSs noch OSs dies taten. Die BBB besteht aus zerebralen Endothelzellen und ist eng mit Perizyten assoziiert (Nyul-Toth et al., 2016). Perizyten sind für die Integrität der BBB von entscheidender Bedeutung (Bell et al., 2010). Der ischämische Schlaganfall löst in der akuten Phase das Absterben der Perizyten und die Ablösung von den Endothelzellen des Gehirns aus, wodurch das Mikrogefäßsystem destabilisiert und die BBB-Eigenschaften verändert werden (Zechariahet al., 2013). Unsere Daten zeigten, dass TGs die Perizytenabdeckung auf Kapillaren erhöhen und die Expressionsniveaus von ZO-1, Claudin-5 und Occludin erhöhen können. Diese Phänomene bewiesen, dass TGs die BBB-Integrität nach zerebraler I/R-Verletzung wirksam schützen konnten. Zusammenfassend können TGs zerebrale Verletzungen auf vielfältige Weise abschwächen, wie z. B. die Förderung der Angiogenese, die Verbesserung der neuronalen Plastizität und die Aufrechterhaltung der Integrität der BBB.
Wir untersuchten dann den Signalweg, um den Mechanismus zu erforschen, der dem TG-Gehirnschutz zugrunde liegt. Der Prozess der I/R-Verletzung ist multifaktoriell, und somit sind zahlreiche Mechanismen an der Pathogenese beteiligt. Oxidativer Stress ist ein grundlegender Risikofaktor, der zu I/R-induzierten Hirnverletzungen beiträgt (Suda et al., 2013), wie z al., 2019; Priestley et al., 2019). Daher ist oxidativer Stress zu einem attraktiven therapeutischen Ziel bei I/R-induzierten Hirnverletzungen geworden. Enzyme der Phase 2, die durch den Kernfaktor E 2-related factor-2 (Nrf-2) vermittelt werden, haben als wichtiges Mittel angesehen, mit dem sich Neuronen vor oxidativem Stress schützen (Suzuki und Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass die Aktivierung von Nrf-2 während I/R ein potenzielles therapeutisches Ziel für die Neuroprotektion ist (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2 vermittelt als wichtiger Regulator der endogenen antioxidativen Abwehr den Gehalt an Hämoxygenase 1 (HO-1) und anderen antioxidativen Enzymen wie NAD(P)H-Chinonoxidoreduktase1 (NQO1), SOD, CAT, GSH und MDA (Siow et al., 2007; Dinget al., 2014). Darüber hinaus spielt Nrf-2 eine wichtige regulatorische Rolle bei der Angiogenese. Die vorliegende Studie zeigt, dass Nrf-2 im Prozess der Gefäßentwicklung signifikant verstärkt und aktiviert werden kann (Wei et al., 2013).
Wie zuvor beschrieben (Jiang und Tu, 2009), enthalten TGs viele bioaktive Verbindungen, zum Beispiel Echinacosid, Tubulosid A, Acteosid, Isoacteosid und 2'-Acetylacteosid, und einige von ihnen zeigten neuroprotektive Funktionen nach zerebraler I/R-Verletzung (Penget al ., 2016). Echinacosid hat viele pharmakologische Wirkungen, wie Antioxidation, Anti-Seneszenz, Neuroprotektion, Anti-Entzündung, Förderung der Vernarbung, Hepatoprotektion, Förderung der Knochenbildung und Anti-Tumor-Aktivitäten (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019). Kürzlich wurde Echinacosid als starkes Antioxidans im zentralen Nervensystem identifiziert (Lu et al., 2016). Echinacosid kann den MDA-Gehalt reduzieren und die Aktivitäten von SOD und GSH Px bei ischämischen Hirnverletzungen verbessern, und molekulare Docking-Analysen zeigten, dass Echinacosid möglicherweise an Keap-1 bindet, was zur Nrf-2-Kerntranslokation führt (Li et al. , 2018). Die Studie von Xia zeigte, dass Acteosid das Infarktvolumen und den Gehirnwassergehalt verringern könnte, um neurologische Defizite bei MCAO/R-Ratten durch Minderung von oxidativem Stress zu verbessern (Xia et al., 2018). Andere Studien haben gezeigt, dass Isoacteosid die Aktivitäten von zellulären antioxidativen Enzymen, SOD und CAT in mit H2O 2- behandelten V79-4-Zellen erhöhen kann (Chae et al., 2005). Basierend auf den obigen Berichten über die in TG enthaltenen Wirkstoffe ist es möglich abzuleiten, dass TG über die Antioxidationswege vor ischämischem Schlaganfall schützen könnten.
Li berichtete über die neuroprotektiven Wirkungen von Phenylethanoidglykosiden (PhGs) auf die H2O2--induzierte Apoptose auf PC12-Zellen über den Nrf2/ARE-Weg (Li et al., 2018). Diese PhGs wurden durch das Auslösen der Nrf2-Kerntranslokation und die Erhöhung der Expression von HO-1, NQO1, der katalytischen Glutamat-Cystein-Ligase-Untereinheit (GCLC) und der Glutamat-Cystein-Ligase-Modifikatoruntereinheit (GCLM) signifikant unterdrückt (Li et al., 2018; Gong et a., 2019). Daher legen diese Ergebnisse nahe, dass der Nrf-2/ARE-Weg eine entscheidende Rolle bei den PhGs-vermittelten Schutzwirkungen auf neuronale Zellen spielt. In ähnlicher Weise fanden wir in dieser Studie heraus, dass TGs den MDA-Spiegel senken und die SOD-, CAT- und GSH-Px-Spiegel in den I/R-Ratten erhöhen konnten. In der Zwischenzeit konnten TGs die Nrf2-Expression im Zellkern hochregulieren und die entsprechende Expression in herunterregulieren im Zytoplasma und verringern die Keap-1-Expression signifikant. Daher kann der Nrf-2/Keap-1-Weg an den TG-vermittelten neuroprotektiven Wirkungen beteiligt sein. Eine weitere Validierung dieses Weges würde in der Zukunft in vitro-Zellkulturen mit Sauerstoff-Glucose-Entzugs-/Reoxygenierungs-Verletzungsmodellen durchgeführt werden. Außerdem C. Deserticola-Extrakte wurden in unserer Studie 14 Tage lang kontinuierlich verabreicht. Da die Neurogenese bei Erwachsenen die Interpretation der neuroprotektiven Wirkungen während 14 Tagen Reperfusion beeinflussen würde, kann die Neurogenese in unserem aktuellen Experimentdesign zur Untersuchung der neuroprotektiven Wirkung von CTs nicht ausgeschlossen werden. Dies ist die Grenze unserer Forschung.
Zusammenfassend sind es die TGs von C. deserticola, die die Angiogenese und Neurogenese verstärken können sowie die Integrität der BBB in Ratten mit I/R-Verletzung aufrechterhalten können, aber nicht die PSs und OSs. Die Effekte könnten durch die Aktivierung des Nrf-2/Keap-1-Signalwegs vermittelt werden.
