Die Gesamtglykoside von Cistanche Deserticola fördern die Wiederherstellung der neurologischen Funktion, indem sie die neurovaskuläre Regeneration über den Nrf- 2/Keap-1-Weg in MCAO/R-Ratten induzieren

Hintergrund:

Die traditionelle chinesische Medizin Cistanche deserticola soll bei kardiovaskulären und zerebrovaskulären Erkrankungen wirksam sein. Seine aktiven Komponenten zum Schutz vor ischämischem Schlaganfall sind jedoch nicht klar. Unser Ziel war es, die aktiven Komponenten von C. deserticola gegen ischämischen Schlaganfall sowie seine potenziellen Mechanismen zu erforschen.

Methoden:

Wir untersuchten die hirnschützenden Wirkungen von Extrakten aus C. deserticola, Gesamtglykosiden (TGs), Polysacchariden (PSs) und Oligosacchariden (OSs) in einem Rattenmodell der Okklusions-Reperfusion der mittleren Hirnarterie (MCAO/R). 2, 3, 5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung wurde verwendet, um das Hirninfarktvolumen zu bestimmen, und der Evans-Blau-Assay wurde verwendet, um die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​zu bestimmen. Dann die Ausdrücke CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin, Keap-1 und Nrf{{ 13}} wurden unter Verwendung von Western-Blotting oder Immunfluoreszenz analysiert, und die Aktivitäten MDA, SOD, CAT und GSH-Px wurden unter Verwendung von Kits analysiert.

Ergebnisse:

Die TG-Behandlung verringerte bemerkenswert die neurologischen Defizitwerte und das Infarktvolumen, förderte die Angiogenese und den neuralen Umbau und hielt die Integrität der Blut-Hirn-Schranke im Vergleich zur Modellgruppe wirksam aufrecht. Darüber hinaus senkten TGs die MDA-Spiegel signifikant und erhöhten die antioxidativen Aktivitäten (SOD, CAT und GSH-Px) im Gehirn. Unterdessen regulierten TGs die Keap-1-Expression bemerkenswert herunter und erleichterten die Kerntranslokation von Nrf-2. Im Gegensatz dazu wurden keine Schutzwirkungen für PSs- und OSs-Gruppen beobachtet.

Abschluss:

TGs sind die wichtigsten aktiven Komponenten von C. deserticola gegen MCAO/R-induzierte Hirnverletzungen, und der Schutz erfolgt hauptsächlich über den Nrf-2/Keap-1-Weg.

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EINFÜHRUNG

Schlaganfälle gelten weltweit als eine der Hauptursachen für Tod und Behinderung (Donnan et al., 2008). Fast 87 Prozent aller Schlaganfälle werden durch einen ischämischen Schlaganfall ausgelöst (Ovbiagele und Nguyen-Huynh, 2011). Derzeit ist der wirksamste Wirkstoff und das einzige von der FDA zugelassene Medikament zur Behandlung des ischämischen Schlaganfalls ein rekombinanter Gewebe-Plasminogen-Aktivator. Aufgrund des engen therapeutischen Zeitfensters und des hohen Risikos für Blutungskomplikationen sprechen jedoch viele Schlaganfallpatienten nicht auf dieses Medikament an (Lee et al., 2012; Schellinger und Kohrmann, 2014). Eine große Herausforderung der thrombolytischen Behandlung ist die Verletzung durch Ischämie/Reperfusion (I/R), die als Hauptursache für Hirnverletzungen und Funktionszerstörung gilt. Reperfusion nach zerebraler Ischämie erhöht das Risiko einer Gehirnblutung, führt zu neurovaskulären Verletzungen und produziert übermäßig reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die die Blut-Hirn-Schranke schädigen (Alluri et al., 2015). Mehrere Studien haben bestätigt, dass die Unterbrechung der BBB eine Hauptursache für die Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls ist (Cao et al., 2016b).

Die BBB besteht hauptsächlich aus Endothelzellen, Perizyten, Astrozyten, Neuronen und Basalmembranen. Die Kernkomponenten der BBB sind zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen, die durch Tight Junctions verbunden sind und so exogene Moleküle in das Gehirn einschränken. Die pathologischen Veränderungen der Tight Junctions – insbesondere Occludin, Claudin-5 und Zonula occludens-1 (ZO-1) – beeinflussen signifikant die BBB-Funktion während eines ischämischen Schlaganfalls, insbesondere die Barrierepermeabilität (Liu et al., 2014; Hu et al., 2018; Liu et al., 2019). Während I/R-Perioden ist übermäßiges ROS einer der Hauptfaktoren, die zu einer direkten Schädigung von Gehirnneuronen führen (Ding et al., 2014). Die Überproduktion von ROS führt zum Abbau bestimmter Verbindungen und zur Unterbrechung der BHS, was dazu führt, dass exogene Moleküle durch die BHS in das Gehirn gelangen, was zu einer Verschlimmerung der Hirnschädigung führt (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Daher wurde der Schutz der BHS durch Antioxidantien als möglicher Weg zur Verhinderung von Reperfusionsschäden angesehen.

Neben dem Zusammenbruch der BBB kann I/R zu neurovaskulären Verletzungen und neuronalem Tod führen (Jung et al., 2010). Während eines Schlaganfalls kann ein erhöhter neuronaler Zelltod aus oxidativem Stress resultieren (Chi et al., 2018), und zahlreiche Studien haben gezeigt, dass ROS die Schlaganfallschwere und neurologische Schäden verschlimmert (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Obwohl klinische Studien keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt haben, ist die Neuroprotektion immer noch eine vielversprechende Strategie zur Behandlung des akuten ischämischen Schlaganfalls (Moretti et al., 2015). Daher ist die Suche nach wirksamen Neuroprotektionsmedikamenten zur Behandlung von Schlaganfällen ein Vorteil für Schlaganfallpatienten.

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) ergreift Maßnahmen, um gegen das körpereigene Ungleichgewicht einzugreifen (Gaire, 2018). Aufgrund der komplexen Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls spielt die multifaktorielle Wirkung der TCM und ihrer Wirkstoffe eine entscheidende Rolle bei der Behandlung des Schlaganfalls. Cistanche deserticola YC Ma, weit verbreitet in trockenen oder halbtrockenen Gebieten in der gesamten Mongolei und im Nordwesten Chinas, ist seit mehr als 1,000 Jahren in China ein weit verbreitetes TCM-Kraut zur Behandlung verschiedener Krankheiten wie Vergesslichkeit und Depression . Moderne pharmakologische Studien zeigten, dass die Rohextrakte von C. deserticola mehrere pharmakologische Aktivitäten zeigten, wie z. B. Verbesserung der Lern- und Gedächtnisfunktion, Neuroprotektion, Stärkung der Immunität, Antioxidans-, Anti-Aging- und Anti-Müdigkeitseffekte (Ko und Leung, 2007; Wang et al. , 2012; Li et al., 2015). Die chemische Analyse von C. deserticola zeigte, dass seine Hauptbestandteile Phenylethanoidglykoside, Iridoidglykoside, Polysaccharide und Oligosaccharide umfassen (Jiang und Tu, 2009). Die aktiven Komponenten von C. deserticola zum Schutz des Gehirns sind jedoch nicht sehr klar.

Die neuroprotektive Eigenschaft von C. deserticola impliziert sein therapeutisches Potenzial bei kognitiven Erkrankungen wie Schlaganfall und Depression sowie der Alzheimer-Krankheit (Wang et al., 2017). Die Forschung über die Auswirkungen von C. deserticola auf Schlaganfälle, einschließlich seiner aktiven Komponenten und Wirkungsmechanismen, ist jedoch sehr begrenzt.

In der aktuellen Arbeit untersuchten wir die Schutzwirkung von drei Extrakten aus C. deserticola, Gesamtglykoside (TGs, Phenylethanoidglykoside und andere Glykoside), Polysaccharide (PSs) und Oligosaccharide (OSs) auf zerebrale I/R-Verletzungen. Unsere Ergebnisse können zur genauen klinischen Anwendung von C. deserticola beitragen und einen Wirkstoffkandidaten für die Therapie des ischämischen Schlaganfalls liefern.

MATERIALEN UND METHODEN

Chemikalien und Reagenzien

Die Stängel von Cistanche deserticola wurden von Alashan, Innere Mongolei, gekauft und von einem der Autoren (P.-F. Tu) identifiziert. TGs, PSs und OSs wurden gemäß unserer zuvor beschriebenen Methode hergestellt (Gao et al., 2015). Die quantitative Analyse von TGs wurde wie zuvor beschrieben (Li et al., 2019) durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) durchgeführt, und ihr Chromatogramm ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Hauptbestandteile von TGs sind Echinacosid, Tubulosid A, Acteosid, Isoacteosid, und 2'-Acetylacteosid; ihre Gehalte betragen 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g bzw. 12,045 mg/g. Die Gehalte an PS und OS betragen 69,42 Prozent bzw. 65,24 Prozent, wie durch HPLC bzw. die Phenol-Schwefelsäure-Analyse bestimmt (Zhang A. et al., 2018; Shi et al., 2019).

Die Standardreferenzen von Echinacosid (A0282), Tubulosid A (A0942), Acteosid (A0280), Isoacteosid (A0281) und 2'-Acetylacteosid (A0943) wurden von Chengdu Must Biotechnology (Sichuan, China) bezogen. Die Reinheiten aller Standards liegen bei über 98 Prozent. Nissl-Stain-H&E-Kits wurden von Boster (Wuhan, China) gekauft. Edaravon (T0407-1) ​​wurde von Target Mol (Shanghai, China) gekauft. Kaninchen-Antiratten-MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) und Maus-Antiratten-CD31 (ab24590) wurden gekauft von Abcam Inc (Cambridge, MA, USA). Kaninchen-Anti-Ratte Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) und Occludin (BS72035) wurden von Bioworld Technology (Nanjing, China) gekauft. Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) war die Quelle von Kaninchen-Anti-Ratten-Synapsin -1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) wurde von Proteintech Group, Inc. (Chicago, USA) erworben.

Sekundärantikörper wurden von Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, China) geliefert. Hoechst 33258 wurde von Beyotime (Jiangsu, China) erhalten.

Tiere

Sprague-Dawley-Ratten (männlich, 250–300 g schwer) wurden von Vital River Laboratory Animal Technology (Peking, China) bezogen und in einem klimatisierten Raum gehalten, der in einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten wurde. Alle Tierversuche wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien für Tierforschung (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee des Health Science Center der Universität Peking (LA2019123) genehmigt.

Tierversuchsprotokolle

Die Ratten wurden MCAO/R ausgesetzt, wie zuvor beschrieben (Wang et al., 2018). Kurz gesagt, die linke Arteria carotis communis (CCA), die Arteria carotis externa (ECA) und die Arteria carotis interna (ICA) wurden freigelegt, und eine 3-0-Nylon-Monofilament-Naht wurde von der ECA in die ICA eingeführt, bis sie die Mitte erreichte zerebrale Arterie (MCA). Nach 1,5 h MCA-Okklusion wurde Reperfusion durch Entfernen des Filaments simuliert. Während des chirurgischen Eingriffs wurde die Körpertemperatur aller Ratten auf 37,0 Grad gehalten.

Arzneimittelverwaltung

Die Ratten wurden unter Verwendung der SPSS-Softwareversion 22.0 wie beschrieben zufällig in sechs Gruppen aufgeteilt (Jiang et al., 2014): normale Gruppe (NOR); Modellgruppe (MOD); Edaravon-Gruppe (positives Medikament, 6 ml/kg, EDI); TGs-Gruppe (280 mg/kg, TGs); PSs-Gruppe (280 mg/kg, PSs) und OSs-Gruppe (280 mg/kg, OSs). TGs, PSs und OSs wurden einmal täglich nach MCAO/R für 14 Tage verabreicht. Die NOR- und MOD-Gruppen wurden mit normaler Kochsalzlösung behandelt. Die Tiernummern sind in Tabelle 1 gezeigt.

Gewichtsmessung und modifizierter neurologischer Defizit-Score (NSS)

Das Körpergewicht wurde am 14. Tag unter Verwendung einer ADVENTURE TM -Digitalwaage (OHAUS, New Jersey, USA) überwacht. Die Masse wurde nach der von FJ Wang (Wang et al., 2018) beschriebenen Methode mit geringfügigen Überarbeitungen bestimmt.

2, 3, 5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung

Das Infarktvolumen wurde wie zuvor beschrieben gemessen (Wang et al., 2015). Kurz gesagt wurden die Gehirne in sieben gleich beabstandete koronale Blöcke (2 mm) geschnitten. Diese Schnitte wurden mit 2 Prozent TTC (Coolaber, Peking, China) bei 37 Grad für 15 Minuten gefärbt. Infarktvolumen (Prozent)=(Volumen der ipsilateralen ischämischen Hemisphäre − Volumen der kontralateralen ischämischen Hemisphäre)/Volumen der kontralateralen ischämischen Hemisphäre × 100.

Nissl- und H&E-Färbung

Die Ratten wurden tief anästhesiert und das gesamte Gehirn wurde dann schnell aus dem Schädel entfernt und unter Verwendung von 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert und in Paraffinwachs eingebettet und in Scheiben von 7 &mgr;m Dicke geschnitten. Die Schnitte wurden mit Nissl und H&E gefärbt. In dieser Studie wurden sechs zufällige 200 × 200 µm große Felder in jeder Gewebeprobe mit einem Lichtmikroskop erfasst. Die Zahl der Leichen von Nissl wurde mit der IPP-Software Version 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, USA) gezählt.

Evans Blue-Assay

Ratten wurde nach MCAO/R 2 % EB (Coolaber Science & Technology Co., LTD) injiziert. Zwei Stunden später wurden die Ratten anästhesiert und das gesamte Gehirn wurde dann schnell entfernt und in Aceton homogenisiert. Die Überstände wurden bei 620 nm mit einem 800 TS-Absorptionslesegerät (BioTek, USA) analysiert.

Messung der Aktivitäten von Katalase (CAT), Superoxiddismutase (SOD), Malondialdehyd (MDA) und Glutathionperoxidase (GSH-Px)

Alle Serumproben wurden bei 4,000 × rpm für 15 min bei 4 Grad zentrifugiert und dann analysiert, um die Aktivitäten von MDA, CAT, SOD und GSH-Px nach den Anweisungen des Herstellers (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, China).

Western-Blotting-Analyse

Von jeder Ratte gesammeltes Hirngewebe (100 mg) wurde homogenisiert und in RIPA-Lysepuffer lysiert und dann analysiert, um die Proteinkonzentration unter Verwendung eines BCA-Kits (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.) nachzuweisen. Gesamtproteine ​​des Gewebes wurden auf 10-prozentige SDS-PAGE-Gele geladen und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membran wurde mit 5 % Magermilch blockiert und dann über Nacht mit primären Antikörpern bei 4 Grad inkubiert. Die Membran wurde dann mit einem sekundären Antikörper inkubiert. Die Western-Blot-Analyse wurde unter Verwendung des Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, China) analysiert.

Immunfluoreszenzanalyse

Es wurden Immunfluoreszenzfärbungen für CD31, a-SMA, ZO-1, Claudin5, Occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 und Keap-1 durchgeführt. Primäre Antikörper gegen Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, Claudin5, Occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 und Keap-1 wurden auf 1 verdünnt :200 bzw. 1:100. Die sekundären Antikörper von Alexa Flur 488-Maus-Anti-Kaninchen-IgG und Rhodamin (TRITC)-Ziege-Anti-Kaninchen-IgG wurden beide auf 1:200 verdünnt. Die Kerne wurden mit Hoechst 33258 gefärbt. Bilder wurden unter Verwendung des Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA) aufgenommen. Die Proteinexpression wurde unter Verwendung der IPP-Softwareversion 6.0 analysiert.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung beschrieben. SPSS-Softwareversion 22.0 wurde für die statistische Analyse durchgeführt. Beim Vergleich verschiedener Gruppen wurde eine Einweg-ANOVA verwendet. P < 0,05 wurde als statistische Differenz angesehen.

ERGEBNISSE

TGs erhöhen das Körpergewicht und reduzieren Hirnschäden bei MCAO/R-Ratten

Nach 14 Tagen Heilung mit TGs, PSs, Oss und EDI wurden die Körpergewichte, neurologischen Defizite und Infarktvolumina von I/R-Ratten bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Körpergewichte in der MOD-Gruppe stark verringert waren, während die verringerten Gewichte in den TGs-, PSs- und EDI-Gruppen erhöht waren (Abbildung 2A). Neurologische Defizitwerte wurden durch EDI und TGs erheblich gesenkt (Abbildung 2B). Die Gehirnschnitte bei Ratten der NOR-Gruppe waren tiefrot und es gab keine Infarkte, während die Ratten der MOD-Gruppe einen großen ipsilateralen Hirninfarkt zeigten. Nach der TGs-Behandlung waren die Infarktvolumina signifikant reduziert (Abbildungen 2C, D). Die PSs- und OSs-Behandlung zeigte keine offensichtliche Wirkung auf die oben genannten Indizes. Die obigen Daten zeigten, dass TGs die I/R-induzierte zerebrale Verletzung deutlich lindern konnten, PSs und OSs jedoch nicht.

TGs verbessern den histopathologischen Schaden bei MCAO/R-Ratten

Um einige der Wirkungen der Behandlung mit TGs, PSs und OSs auf histopathologische Schäden zu bestimmen, wurde eine H&E-Färbung durchgeführt, um pathologische Schäden aufzudecken. Die histomorphologischen Strukturen der Gehirne in der NOR-Gruppe wurden regelmäßig angeordnet. Die morphologischen Veränderungen in den TGs-Gruppen waren geringer als in der MOD-Gruppe. Die PSs- und OSs-Behandlungsgruppen zeigten jedoch keine signifikante Besserung der morphologischen Veränderungen (Abbildung 3).

TGs dämpfen neuronale Verletzungen nach I/RI-induzierten Ratten

Die Nissl-Färbung zeigte die histopathologischen Veränderungen von Neuronen im Halbschatten des ischämischen Bereichs. Wie in Fig. 4 gezeigt, hatten die normalen Neuronen einen klaren Nukleolus und eine intakte Struktur. In der MOD-Gruppe hatten die Neuronen vergrößerte Interzellularräume. Die schönen Körper verschwanden, geschrumpft und tief befleckt. Diese Veränderungen wurden jedoch selten in den EDI-, TGs- und PSs-Gruppen beobachtet. Diese Ergebnisse veranschaulichten, dass TGs und PSs eine durch Ischämie/Reperfusion induzierte neuronale Verletzung signifikant abschwächen konnten.

TGs schwächen die BBB-Störung nach I/RT-behandelten Ratten ab

Evans Blue Assay ist eine klassische Methode zur Untersuchung der Veränderung der BBB-Permeabilität. Die Versuchsergebnisse zeigten, dass in der MOD-Gruppe ein erhöhtes Evans-Blau beobachtet wurde, während bei den mit TGs und EDI behandelten Ratten ein signifikant verringertes Evans-Blau auftrat. Darüber hinaus gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den PS- und OS-Therapiegruppen (Abbildung 5). Diese Ergebnisse legten nahe, dass TGs die BBB-Störung signifikant dämpfen könnten.

TGs fördern die Angiogenese in I/R-verletzten Ratten

Neuere Studien zeigen, dass die Angiogenese eine entscheidende Rolle bei der neurologischen Funktionswiederherstellung und den prognostischen Ergebnissen nach einem akuten ischämischen Schlaganfall spielt (Yuen et al., 2015). Um die Wirkungen von TGs, PSs und OSs auf die Angiogenese zu bewerten, wurden CD31 und a-SMA verwendet, um die Kapillarzahlen zu quantifizieren. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass die MOD-Gruppe im Vergleich zu den normalen Ratten eine bemerkenswerte Abnahme der Expression von CD31 ( 6A , B) und aSMA ( 6C , D) im Halbschatten ischämischer Bereiche von I/R-Ratten verursachte. Dieses Ergebnis veranschaulichte, dass I/R Gefäßschäden in der Cortex-Penumbra von ischämischen Hemisphären verursachen könnte. Die TGs und die EDI-Behandlung erhöhten jedoch bemerkenswert die Kapillardichte, Angiogenese und Arteriogenese, wie durch erhöhte Expressionen von CD31 und a-SMA angezeigt wird. Diese Ergebnisse legen nahe, dass TGs die Angiogenese im ischämischen Halbschatten von I/R-Ratten fördern könnten, die PSs und OSs dies jedoch nicht könnten.

TGs erhöhen die Expression von Tight-Junction-Proteinen in I/R-verletzten Ratten

Eine Störung der BHS kann den Wassergehalt im Gehirn und Gewebeschwellungen erhöhen, was zu Hirnverletzungen führen kann. Tight Junction Proteine ​​sind wichtige strukturelle Komponenten der BBB (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Um zu testen, ob die Behandlung mit TGs, PSs und OSs nach einem Schlaganfall die BBB-Integrität beeinflussen könnte, wurden die Expressionen von ZO-1, Claudin-5 und Occludin durch Immunfluoreszenzanalyse durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von Claudin-5, Occludin und ZO-1 in der MOD-Gruppe sichtbar verringert war. Sie waren jedoch 14 Tage nach der Verabreichung wesentlich erhöht. PSs- und OSs-Gruppen zeigten keine signifikanten Veränderungen in diesen Proteinexpressionen (Abbildung 7). Diese Daten zeigten, dass die TGs die Expression von Tight Junction-Proteinen regulieren und die BBB-Integrität nach einer I/R-Verletzung aufrechterhalten konnten.

TGs erhöhen die Perizytenbedeckung auf Kapillaren bei I/R-verletzten Ratten

Die Bedeckung von Kapillaren mit Perizyten spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der BBB-Integrität (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Daher haben wir getestet, ob die Perizytenabdeckung durch TGs, PSs und OS-Behandlung erhöht werden kann. Die Ergebnisse der Immunfluoreszenz-Intensitätsanalyse zeigten, dass sowohl die PDGFRb- als auch die CD31-Expression in der MOD-Gruppe dramatisch verringert waren. Die Verabreichung von TGs an die I/R-Ratten erholte sich signifikant oder erhöhte sogar die Expressionsintensitäten von PDGFRb und CD31, aber es wurde kein Unterschied in den PSs- und OSs-Behandlungsgruppen beobachtet ( 8 ). Somit könnte die Behandlung von TGs die Perizytenbedeckung signifikant erhöhen. Diese Ergebnisse bestätigten weiter, dass TGs die Integrität von BBB nach I/R aufrechterhalten können.

TGs fördern neurales Remodeling in I/R-verletzten Ratten

Laut zahlreichen Studien kann die Neurogenese nach einem Schlaganfall die funktionelle Erholung signifikant verbessern (Grefkes und Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Synaptophysin (SYN), postsynaptische Dichte 95 (PSD-95)-Proteine ​​und Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP-2) wurden als Marker verwendet, um die neuronale Plastizität in der ischämischen Penumbra des Kortex zu untersuchen. Um die Auswirkungen der TGs-, PSs- und OSs-Behandlung auf die Neurogenese bei I/R-verletzten Ratten zu bewerten, wurden die Immunfluoreszenz und der Western Blot für SYN-, PSD95- und MAP-2-Expressionen durchgeführt. Wie in den Abbildungen 9 und 10 gezeigt, nahmen die SYN-, PSD95- und MAP-2-Expressionsniveaus bei I/R-Ratten nach 14 Tagen Reperfusion im Vergleich zu den NOR-Ratten ab, während die Heilung von TGs und PSs signifikant gesteigert werden konnte. regulieren ihre Expressionsniveaus. Die OSs-Gruppe hatte keine signifikante Veränderung im Vergleich zur MOD-Gruppe. Die Daten zeigten, dass die TGs- und PSs-Heilung in der Lage war, die neurale Remodellierung nach einer I/R-Verletzung dramatisch zu fördern.

TGs Alter Nrf-2- und Keep-1-Ausdrücke bei I/R-verletzten Ratten

Oxidativer Stress ist der wichtigste pathogene Mechanismus bei I/R-Verletzungen (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Die Studien bestätigten, dass Nrf-2 ein Hauptregulator antioxidativer Reaktionen ist (Thompson et al., 2015). Um die durch Nrf-2 und Keap-1 vermittelten oxidativen Reaktionen nach einer I/R-Verletzung zu untersuchen, untersuchten wir die zytoplasmatische Expression sowie die nukleare Translokation von Keap-1. Inzwischen wurde auch die Expression von Nrf-2 in Hirngeweben von I/R-verletzten Ratten untersucht (Fig. 10 und 11). Gemäß der Immunfluoreszenzanalyse wurde gefunden, dass Nrf-2 hauptsächlich im Zytoplasma in der NOR-Gruppe lokalisiert ist. In der TGs-Gruppe war die Expression von Nrf-2 in der zytoplasmatischen Lokalisation herunterreguliert, aber im Zellkern hochreguliert, und es wurde auch eine verringerte Keap-1-Expression beobachtet. Die Daten zeigten, dass der Gehirnschutz von TGs mit der Modulation von Nrf-2 und Keap-1 in Verbindung gebracht werden könnte.

TGs dämpfen oxidativen Stress im Gehirngewebe bei I/R-verletzten Ratten

Um die antioxidativen Wirkungen von TGs zu bestätigen, wurden die Aktivitäten von SOD, CAT, GSH-Px und MDA bei I/R-verletzten Ratten bewertet. In 12 war der MDA-Gehalt in der MOD-Gruppe deutlich erhöht und gleichzeitig waren die Aktivitäten von SOD, CAT und GSH-Px im Vergleich zu den normalen Ratten verringert. Umgekehrt führte die Behandlung mit TGs zu einer signifikanten Abnahme des MDA-Gehalts und einer Zunahme der Aktivitäten von SOD, CAT und GSH-Px. Diese Ergebnisse bestätigten weiter die Antioxidationsaktivität von TGs.

DISKUSSION

Viele Studien legen nahe, dass TCM C. deserticola umfangreiche biologische Aktivitäten hat, z. B. die Verbesserung der Lernfähigkeit, des Gedächtnisses und der Immunität (Dong et al., 2007; Jiang und Tu, 2009; Wang et al., 2017; Xia et al., 2018). Die aktiven Komponenten von C. deserticola für die Neuroprotektion bleiben jedoch unklar. Die aktuelle Arbeit zielt darauf ab, die aktiven Komponenten von C. deserticola gegen ischämischen Schlaganfall auf dem MCAO/R-Modell zu screenen. Drei Extrakte aus C. deserticola (TGs, PSs und OSs) wurden verwendet, um ihre Auswirkungen auf MCAO/R-Ratten sowie mögliche Mechanismen zu bewerten. Der Schlaganfall ist eine häufige akute zerebrovaskuläre Erkrankung. Epidemiologische Studien zeigen, dass Schlaganfälle häufiger bei Männern als bei Frauen auftreten (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik und Bushnell, 2017).

Daher wurden in unserem Experiment männliche Ratten für die Tests angenommen. Unsere Ergebnisse bewiesen, dass die I/R-Induktion den oxidativen Stress und das Infarktvolumen beschleunigte, die BBB durchbrach und zu Nerven- und zerebrovaskulären Verletzungen führte. Nach dem Screening wurde festgestellt, dass TGs das Infarktvolumen verringern und die neurale Remodellierung und Angiogenese fördern. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass TGs die BBB-Integrität nach einer I/R-Verletzung aufrechterhielten. Im Gegensatz dazu lindern PSs und OSs die I/R-Verletzung nicht signifikant. Daher gelten TGs als die wichtigste aktive Fraktion von C. deserticola für die Neuroprotektion, möglicherweise durch die Förderung des neuralen Umbaus, der Angiogenese und der BBB-Integrität über die Aktivierung des Nrf2/Keap-1-Signalwegs.

Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass die Etablierung eines effektiven Kollateralkreislaufs von erheblicher Bedeutung ist, um die Bildung von Infarkten und ischämischen Halbschatten zu vermeiden, und eine entscheidende Behandlung in einem frühen Stadium eines ischämischen Schlaganfalls darstellt (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Die Proliferation von vaskulären Endothelzellen und glatten Muskelzellen nach einem ischämischen Infarkt bestimmt die Etablierung eines Kollateralkreislaufs.

Die Ischämiemodelle haben jedoch ein gemeinsames Phänomen – nämlich oxidativer Stress, der in der Mikrovaskulatur des Gehirns weit verbreitet war. Studiendaten haben gezeigt, dass eine Vielzahl von Antioxidantien die Funktion der BHS und die Eigenschaften der Angiogenese stören können (Mentor und Fisher, 2017). CD31 und a-SMA sind die Marker von vaskulären Endothelzellen bzw. glatten Muskelzellen (Saboor et al., 2016). Um die Wirkung der oben erwähnten Zellproliferation der Extrakte aus C. deserticola zu untersuchen, untersuchten wir die Expression von CD31 und a-SMA im zerebralen ischämischen Penumbra-Homogenat. Unsere Daten zeigten, dass TGs die Expression von CD31 und a-SMA deutlich verstärkten. Es gab jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen PSs- und OS-Gruppen. Daher folgerten wir, dass TGs Hirnschäden reduzieren können, indem sie die Angiogenese fördern, indem sie die Expression von CD31 und a-SMA erhöhen, während PSs und OSs keinen solchen Schutz vor Hirnschäden bieten. Diese Ergebnisse bestätigten weiter, dass nur TGs zerebrale I/R-Verletzungen verhindern konnten.

Der ischämische Schlaganfall kann als Folge einer zerebralen Ischämie angesehen werden, die durch eine Beeinträchtigung der neuronalen Plastizität oder eine Umgestaltung von Gehirnbereichen verursacht wird. Die Mehrzahl der Schlaganfallpatienten leidet unter neurologischen Defiziten. Die Aktivierung der Neurogenese ist eine vielversprechende Strategie für Schlaganfallpatienten zur Verbesserung ihrer neurologischen Funktionen (Cramer und Chopp, 2000). Die Neurogenese ist direkt an der Wiederherstellung der neurologischen Funktion nach einer Hirn-I/R-Verletzung beteiligt (Zhang et al., 2019). Frühere Forschungen zeigen, dass TGs die Überlebensrate von Hippocampus-Pyramidenzellen verbessern und Neurogenese induzieren können (Lian et al., 2017). Oxidativer Stress verursacht den Verlust von Neuronen bei vielen Krankheiten wie Parkinson, Schlaganfall usw. (Duan und Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2 transkribiert viele Gene, die mit der Neuroprotektion in ihrer Promotorregion in Verbindung stehen, hauptsächlich einschließlich SOD, MDA, CAT und Glutamyl-Cystein-Ligasen usw. (Satoh et al., 2006). SYN-, PSD-95- und MAP-2-Proteine, die eng mit der synaptischen Bildung und Neurotransmission assoziiert sind, können als Marker für die neuronale Plastizität der Forschung in der ischämischen Halbschattenregion angesehen werden. Nach Studien fanden wir heraus, dass die Heilung mit TGs die Expression von PSD95, SYN und MAP-2 signifikant erhöhen konnte, was darauf hinweist, dass der zerebrale Schutz von TGs mit einer verbesserten neuronalen Plastizität während I/R korrelierte. Schade ist jedoch, dass es keinen offensichtlichen Unterschied zwischen PSs und OS-Gruppen gibt. Diese Ergebnisse zeigten, dass TGs die Neuroplastizität nach zerebraler I/R-Verletzung verstärken könnten.

Bildgebende Untersuchungen an Schlaganfallpatienten zeigten, dass die BHS-Dysfunktion als auffälliges Attribut des perischämischen Gehirns angesehen werden kann (Bang et al., 2007). Die TJs, die aus zytoplasmatischen Proteinen, Transmembranproteinen und Verbindungsadhäsionsmolekülen zwischen kapillaren Endothelzellen bestehen, sind sehr wichtig für die Aufrechterhaltung der BBB-Integrität (Ye et al., 2019). Unter ihnen sind ZO-1, Claudin-5 und Occludin die wichtigsten Proteine ​​in TJs. Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass die durch Ischämie induzierte erhöhte Permeabilität der BBB im Allgemeinen mit den Veränderungen von ZO-1, Claudin-5 und Occludin korreliert (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2017; Liu et al., 2018).

In dieser Arbeit zeigten die Ergebnisse, dass, obwohl TGs die Expression von ZO-1-, Claudin-5- und Occludin-Proteinen in MCAO-induzierten Hirngeweben signifikant steigern konnten, weder PSs noch OSs dies taten. Die BBB besteht aus zerebralen Endothelzellen und ist eng mit Perizyten assoziiert (Nyul-Toth et al., 2016). Perizyten sind für die BBB-Integrität von entscheidender Bedeutung (Bell et al., 2010). Ischämischer Schlaganfall löst Perizytentod und Ablösung von Hirnendothelzellen in der akuten Phase aus, wodurch die Mikrovaskulatur destabilisiert und die BBB-Eigenschaften verändert werden (Zechariah et al., 2013). Unsere Daten zeigten, dass TGs die Perizytenabdeckung auf Kapillaren erhöhen und die Expressionsniveaus von ZO-1, Claudin-5 und Occludin erhöhen können. Diese Phänomene bewiesen, dass TGs die BBB-Integrität nach zerebraler I/R-Verletzung wirksam schützen können. Zusammenfassend können TGs zerebrale Verletzungen auf vielfältige Weise abschwächen, wie z. B. die Förderung der Angiogenese, die Verbesserung der neuronalen Plastizität und die Aufrechterhaltung der Integrität der BBB.

Wir untersuchten dann den Signalweg, um den Mechanismus zu erforschen, der dem Gehirnschutz von TG zugrunde liegt. Der Prozess der I/R-Verletzung ist multifaktoriell, und somit sind zahlreiche Mechanismen an der Pathogenese beteiligt. Oxidativer Stress ist ein grundlegender Risikofaktor, der zu I/R-induzierten Hirnverletzungen beiträgt (Suda et al., 2013), wie z et al., 2019; Priestley et al., 2019).

Somit ist oxidativer Stress zu einem attraktiven therapeutischen Ziel bei I/R-induzierter Hirnverletzung geworden. Phase-2-Enzyme, die durch den Kernfaktor E2-verwandten Faktor-2 (Nrf-2) vermittelt werden, gelten als wichtiges Mittel, mit dem sich Neuronen vor oxidativem Stress schützen (Suzuki und Yamamoto , 2015; Ya et al., 2018). Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass die Aktivierung von Nrf-2 während I/R ein potenzielles therapeutisches Ziel für die Neuroprotektion ist (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2 vermittelt als wichtiger Regulator der endogenen antioxidativen Abwehr den Gehalt an Hämoxygenase 1 (HO-1) und anderen antioxidativen Enzymen wie NAD(P)H-Chinonoxidoreduktase 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH und MDA (Siow et al., 2007; Ding et al., 2014). Darüber hinaus spielt Nrf-2 eine wichtige regulatorische Rolle bei der Angiogenese. Die vorliegende Studie zeigt, dass Nrf-2 im Prozess der Gefäßentwicklung signifikant verstärkt und aktiviert werden kann (Wei et al., 2013).

Wie zuvor beschrieben (Jiang und Tu, 2009), enthalten TGs viele bioaktive Verbindungen, zum Beispiel Echinacosid, Tubulosid A, Acteosid, Isoacteosid und 2'-Acetylacteosid, und einige von ihnen zeigten neuroprotektive Funktionen nach zerebraler I/R-Verletzung ( Peng et al., 2016). Echinacosid hat viele pharmakologische Wirkungen, wie z. B. Antioxidation, Anti-Seneszenz, Neuroprotektion, Antientzündung, Förderung der Vernarbung, Hepatoprotektion, Förderung der Knochenbildung und Antitumoraktivitäten (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019).

Kürzlich wurde Echinacosid als starkes Antioxidans im zentralen Nervensystem identifiziert (Lu et al., 2016). Echinacosid kann den MDA-Gehalt reduzieren und die Aktivitäten von SOD und GSHPx bei Ischämie-Hirnverletzungen verbessern, und molekulare Docking-Analysen zeigten, dass Echinacosid möglicherweise an Keap-1 bindet, was zur Nrf-2-Kerntranslokation führt (Li et a., 2018). Die Studie Xia zeigte, dass Acteosid das Infarktvolumen und den Gehirnwassergehalt verringern kann, um neurologische Defizite bei MCAO/R-Ratten durch Minderung von oxidativem Stress zu verbessern (Xia et al., 2018). Andere Studien haben gezeigt, dass Isoacteosid die Aktivitäten von zellulären antioxidativen Enzymen, SOD und CAT in H2O2--behandelten V79-4-Zellen erhöhen könnte (Chae et al., 2005). Basierend auf den obigen Berichten über die in TG enthaltenen Wirkstoffe ist es möglich abzuleiten, dass TG über die Antioxidationswege vor ischämischem Schlaganfall schützen könnten.

Ich habe über die neuroprotektiven Wirkungen von Phenylethanoidglykosiden (PhGs) auf die H2O2--induzierte Apoptose auf PC12-Zellen über den Nrf2/ARE-Weg berichtet (Li et al., 2018). Diese PhGs wurden signifikant unterdrückt, indem die Nrf2-Kerntranslokation ausgelöst und die Expression von HO-1, NQO1, der katalytischen Untereinheit der Glutamat-Cystein-Ligase (GCLC) und der Untereinheit der Glutamat-Cystein-Ligase (GCLM) erhöht wurde (Li et al., 2018 ; Gong et al., 2019).

Daher legen diese Ergebnisse nahe, dass der Nrf-2/ARE-Weg eine entscheidende Rolle bei den PhGs-vermittelten Schutzwirkungen auf neuronale Zellen spielt. In ähnlicher Weise fanden wir in dieser Studie heraus, dass TGs den MDA-Spiegel senken und die SOD-, CAT- und GSH-Px-Spiegel in den I/R-Ratten erhöhen konnten. In der Zwischenzeit konnten TGs die Nrf2-Expression im Zellkern hochregulieren, die entsprechende Expression im Zytoplasma herunterregulieren und die Keap-1-Expression signifikant verringern. Daher kann der Nrf-2/Keap-1-Weg an TGs-vermittelten neuroprotektiven Wirkungen beteiligt sein. Eine weitere Validierung dieses Signalwegs würde in Zukunft in einer In-vitro-Zellkultur mit Sauerstoff-Glucose-Entzugs-/Reoxygenierungs-Verletzungsmodellen durchgeführt. Darüber hinaus wurden C. deserticola-Extrakte in unserer Studie für 14 Tage kontinuierlich verabreicht. Da die Neurogenese bei Erwachsenen die Interpretation der neuroprotektiven Wirkungen während 14 Tagen Reperfusion beeinflussen würde, kann die Neurogenese bei der Untersuchung der neuroprotektiven Wirkung von CTs nicht aus unserem aktuellen Versuchsdesign ausgeschlossen werden. Dies ist die Grenze unserer Forschung.

Zusammenfassend sind es die TGs von C. deserticola, die die Angiogenese und Neurogenese verstärken können sowie die Integrität der BBB bei Ratten mit I/R-Verletzung aufrechterhalten können, aber nicht die PSs und OSs. Die Effekte könnten durch die Aktivierung des Nrf-2/Keap-1-Signalwegs vermittelt werden.

DATENVERFÜGBARKEITSERKLÄRUNG

Die Rohdaten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, werden von den Autoren ohne unangemessenen Vorbehalt jedem qualifizierten Forscher zur Verfügung gestellt.

ETHIK-ERKLÄRUNG

Diese Arbeit wurde gemäß den Richtlinien für Tierversuche der Peking-Universität durchgeführt. Die Studienprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Peking University Health Science Center (LA2019123) genehmigt.

AUTORENBEITRÄGE

YJ, KZ und PT gestalteten die Forschung. FW hat die Recherche durchgeführt. FW und RL analysierten die Daten. FW, RL und JC schrieben das Manuskript und die HPLC-Analyse. JC, KZ, YJ und PT überarbeiteten das Manuskript.

FINANZIERUNG

Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Project (2017YFC1702400, 2019YFC1711000), der National Natural Science Foundation of China (81773932) und dem National Key Technology R&D Program „New Drug Innovation“ of China (2018ZX09711001-008-003) unterstützt. ).

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Interessenkonflikt:

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Der behandelnde Herausgeber erklärte zum Zeitpunkt der Überprüfung eine gemeinsame Zugehörigkeit, jedoch keine andere Zusammenarbeit, mit den Autoren KZ und YJ.

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