UMOD-Mutationen bei chronischen Nierenerkrankungen in Taiwan

Abstrakt:UMODist das erste identifizierte und am häufigsten mutierte Gen, das eine autosomal-dominante Erkrankung verursachttubulointerstitielle Nierenerkrankung(ADTKD). Neuere Studien haben gezeigt, dass ADTKD-UMODist eine relativ häufige Ursachechronisches Nierenleiden(CKD). Allerdings ist der Status von ADTKD-UMODin Taiwan bleibt unbekannt. In dieser Studie haben wir drei heterozygote Tiere identifiziertUMODMissense-Varianten, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp) und c.817G > T (p.Val273Phe), in insgesamt 221 ausgewählten CKD-Familien (1,36 %). Über zwei dieser Missense-Varianten, p.Cys41Arg und p.Gly60Asp, wurde bisher nicht berichtet. In-vitro-Studien zeigten, dass beide Uromodulin-Varianten Defekte im Zellmembrantransport und der Ausscheidung in das Kulturmedium aufweisen. Das Strukturmodell sagte eine veränderte Disulfidbindungsbildung in beiden Varianten voraus, es wurde jedoch vorhergesagt, dass nur p.Gly60Asp eine Proteindestabilisierung verursacht. Unsere Ergebnisse erweitern das Mutationsspektrum und weisen darauf hin, dass die ADTKD-UMODtrug zu einer kleinen, aber bedeutenden Ursache für CNI in der taiwanesischen Bevölkerung bei.

Schlüsselwörter: Uromodulin;chronisches Nierenleiden(CKD); autosomal-dominant vererbt, tubulointerstitiellNierenerkrankung(ADTKD); Nierenversagen (KF).

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1. Einleitung

ADTKD ist eine seltene dominante Erbkrankheit, die durch heterozygote Mutationen in UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] und SEC61A1 [5] verursacht wird. UMOD ist die erste identifizierte und häufigste Ursache von ADTKD und wurde ausführlich untersucht [1,6]. Obwohl selten, ist ADTKD die dritthäufigste monogene ErkrankungNierenerkrankungnach ADPKD und Kollagen-Typ-IV-Nephropathie, aber die Prävalenz von ADTKD-UMOD bleibt unklar, und neuere Studien zeigen, dass es bis zu 2 % der Patienten mit KF oder 0,3 % aller Personen mit CKD ausmacht [7, 8]. UMOD kodiert Uromodulin und ist das am häufigsten vorkommende Protein im menschlichen Urin [9]. Uromodulin ist ein nierenspezifisches Protein, das von den Epithelzellen des dicken aufsteigenden Schenkels der Henle-Schleife und dem frühen Teil des distalen gewundenen Tubulus produziert wird [10] und über seine Zona als hochmolekulares Polymer gebildet wird Pellucida-Domäne [11]. Darüber hinaus ist Uromodulin ein hochglykosyliertes Protein mit sieben N-Glykosylierungsstellen und einer Spaltung am Ende des C-Terminus durch die Serinprotease Hepsin, bevor es in das tubuläre Lumen ausgeschieden wird [9,12,13]. Die Funktion von Uromodulin umfasst den Schutz vor der Kristallisation von Calciumoxalat [14], die Abwehr von Infektionen im Harntrakt durch uropathogene Bakterien [15–18] und die Regulierung des Ca2+-K+-Ionenkanals [19]. Die Wirkung von UMOD-Mutationen ist eine verzögerte Reifung, eine Retention im endoplasmatischen Retikulum (ER), eine verminderte Expression an der Plasmamembran und eine verminderte Urinausscheidung, was zu ER-Stress und der entfalteten Proteinantwort führt [20–22].

Klinische Phänotypen von ADTKD-UMOD sind unspezifisch und umfassen CKD, Gicht, Hyperurikämie, normale bis leichte Proteinurie, das Vorhandensein oder Fehlen einer Familienanamnese und die meisten betroffenen Personen, die im Alter zwischen 30 und 50 Jahren an KF erkranken [23]. Die Nierenhistologie zeigt eine tubuläre Dilatation oder Atrophie, eine Aufhebung oder Verdickung der tubulären Basalmembran, interstitielle Fibrose und eine Akkumulation von mutiertem Uromodulin als polymorphes unstrukturiertes Material, das durch PAS-Färbung sichtbar wird [24,25].

Laut internationalen Vergleichen des USRDS-Berichts weist Taiwan die höchste Inzidenz und Prävalenz von CKD und KF auf [26]. Allerdings hat sich keine Studie auf den Status von ADTKD-UMOD in der CNI-Population in Taiwan konzentriert. In dieser Studie untersuchten wir die Prävalenz von ADTKD-UMOD-Mutationen in einer ausgewählten CKD-Kohorte in einem einzelnen Tertiärzentrum in Taiwan.

2. Materialien und Methoden

2.1. CKD-Individuen und DNA-Vorbereitung

Für diese Studie wurden 221 CKD-Familien (228 Personen) aus dem CKD Care Program des Kaohsiung Medical University Hospital rekrutiert. Zu den Einschlusskriterien gehörten Gicht-Episoden oder Hyperurikämie mit einer eGFR von weniger als 90 ml/min/1,73 m2 vor dem 40. Lebensjahr. Blutproben, Stammbauminformationen und Zugang zu Laborergebnissen wurden von Einzelpersonen nach Einwilligung nach Aufklärung eingeholt. Die Studie wurde gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt und vom Institutional Review Board der KMUH (KMUHIRB-G(II)-20160024) ​​genehmigt. DNA aus peripheren Blutproben wurde gemäß der Standardmethode extrahiert.

2.2. Exomsequenzierung und bioinformatische Analyse

Für die Erstellung der Exombibliothek wurde das Nextera Flex for Enrichment and Exome Panel (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, USA) verwendet. Größenauswahl, Sequenzerfassung, Anreicherung und Elution wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Größenverteilung der DNA-Bibliotheken wurde dann mit TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) gemessen, gefolgt von einer Sequenzierung auf einem Illumina NovaSeq 6000 mit 150 bp Paired-End-Reads. Die resultierenden Fastq-Daten wurden mit der Referenzsequenz des menschlichen Genoms (GRCh37/hg19) abgeglichen und wir führten einen Nukleotidvariantenaufruf mithilfe der DRAGEN Bio-IT-Plattform (Illumina) durch. Die VCF-Datei wurde in CLC Genomics Workbench (Qiagen, Germantown, MD, USA) analysiert. Identifizierte Varianten wurden gemäß der Klassifizierung des American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) mithilfe der VarSome-Software als pathogen/wahrscheinlich pathogen, Variante unsicherer Signifikanz (VUS) oder gutartig gekennzeichnet und wir verglichen Varianten, die im ClinVar vorhanden waren , HGMD- und dbSNP-Datenbanken. Erkannte pathogene, wahrscheinlich pathogene und VUS-Varianten wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt. Für die Sanger-Sequenzierung wurden die PCR-Produkte durch Behandlung mit alkalischer Garnelenphosphatase/Exonuklease I (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) gereinigt und dann einer Sequenzierung von beiden Enden durch Thermocycler-Sequenzierung unter Verwendung der BigDye® Terminator 3.1-Sequenzierung unterzogen Kit (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) nach Analyse auf einem ABI 3730XL DNA-Analysator (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Eine Segregationsanalyse wurde durchgeführt, wenn DNA von Familienmitgliedern verfügbar war. Die Exons 2, 3, 4 und 5 von UMOD wurden durch Sanger-Sequenzierung bei Probanden von 221 CKD-Familien gescreent, mit Ausnahme der DY5-Familie, die eine Exomsequenzierung erhielt. Für UMOD wird die NCBI-Ref-Sequenz NM_003361.4 verwendet. Für die Nummerierung von Nukleotiden und die Benennung von Mutationen oder Varianten wurde die von der Human Genome Variation Society (http//www.hgvs.org/; abgerufen am 18. Juli 2022) empfohlene Standardnomenklatur verwendet.

2.3. Zellkultur und vorübergehende Transfektion

HEK293-Zellen (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, USA) wurden in Kaighns Modifikation von Hams F-12-Medium (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlington) kultiviert , MA, USA), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin (10378016, Gibco, Thermo Fisher Scientific). ) und 10 Einheiten/ml -Interferon (IF002, Merck/Millipore Sigma). Die Zellen wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 gehalten.

Die vorübergehende Transfektion von HEK293-Zellen wurde unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Kurz gesagt, 2,5 µL Lipofectamine 2000 wurden direkt in 100 µL Optimum-Medium (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) gegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Insgesamt 1 µg DNA wurde der Lipofectamine 2000-Optimum-Mischung zugesetzt und weitere 20 Minuten inkubiert. Die DNA-Mischung wurde am Ende der Inkubation tropfenweise auf Zellkulturplatten mit serumfreiem Medium gegeben. Für den Gesundheitszustand der Zellen nach der vorübergehenden Transfektion verwendeten wir den automatischen Zellzähler LUNA-II™ (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Korea), um die Lebensfähigkeit der mit Trypanblau gefärbten Zellen zu einem anderen Zeitpunkt und in den meisten Fällen festzustellen transfizierte Zellen blieben bei unterschiedlicher Überexpression von Uromodulin am Leben (Daten nicht gezeigt).

2.4. Ortsgerichtete Mutagenese

Der HA-markierte Wildtyp-Uromodulin-Vektor wurde von Dr. Rampoldi erhalten [27]. Die Mutationskonstrukte von p.Cys41Arg und p.Gly60Asp wurden mit dem QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (200523, Agilent) gemäß den Anweisungen des Herstellers erstellt. Die Mutationen wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt

2.5. ELISA und Fraktionierung

Leere Vektor-, Wildtyp-Uromodulin-, p.Cys41Arg-Uromodulin- und p.Gly60Asp-Uromodulin-Expressionskonstrukte wurden vorübergehend in HEK293-Zellen transfiziert. Nach der vorübergehenden Transfektion wurde das Kulturmedium nach 8, 24 und 32 Stunden gesammelt und dann vor der Messung bei –80 °C gelagert. Für das Immunblotting wurde das Kulturmedium vor der SDS-PAGE-Elektrophorese mit Centri con (YM3, Icon, Merck/Millipore Sigma) kondensiert. Mittels ELISA wurden Messungen des Uromodulins im Kulturmedium gemäß den Herstellerangaben (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Kurz gesagt, das Kulturmedium und die Standards wurden in einem im Kit enthaltenen Assay-Verdünnungsmittel verdünnt und in zweifacher Ausfertigung in die Vertiefungen gegeben. Nach 2,5-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen mit PBS gewaschen und der biotinylierte Uromodulin-Antikörper hinzugefügt. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen erneut gewaschen und ein Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Sekundärantikörper hinzugefügt. Nach 45-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen erneut gewaschen und die Farbe durch Zugabe von TMB-Substratlösung und 30-minütige Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe der im Kit enthaltenen Stopplösung gestoppt und anschließend sofort bei OD450 und OD550 abgelesen. Die Uromodulinkonzentration des Kulturmediums wurde durch Interpolation auf der Standardkurve bestimmt.

Nachdem das Kulturmedium gesammelt worden war, wurden die an der Kulturschale befestigten Zellen mit einem subzellulären Proteinfraktionierungskit (78840, Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers fraktioniert. Kurz gesagt, wir haben gleiche Mengen von drei verschiedenen Arten von Uromodulin-Zelllysaten gesammelt und den gesamten Überstand entfernt, bis er so trocken wie möglich war. Wir fügten dem Zellpellet eiskalten zytoplasmatischen Extraktionspuffer mit Proteaseinhibitoren hinzu, inkubierten 10 Minuten bei 4 °C unter leichtem Mischen und zentrifugierten dann 5 Minuten bei 500 × g. Wir haben den Überstand (Zytoplasmaextrakt) sofort in ein sauberes, vorgekühltes Röhrchen auf Eis überführt und dem Pellet einen eiskalten Membranextraktionspuffer mit Proteaseinhibitoren zugesetzt. Der Membrananteil wurde 5 s lang auf höchster Stufe gevortext und 10 min lang bei 4 °C unter leichtem Mischen inkubiert. Wir haben den Überstand (Membranextrakt) nach 5-minütiger Zentrifugation bei 3000 × g in ein sauberes, vorgekühltes Röhrchen auf Eis überführt. Die subzelluläre Membran und das zytoplasmatische Protein wurden durch Western Blot analysiert.

2.6. Immunblotting-Analyse

Die Proteinproben wurden mit einem RIPA-Puffer (R0278, Merck/Millipore Sigma) oder dem Fraktionierungsschritt aus den Zellen gewonnen. Anschließend wurde die Proteinkonzentration unter Verwendung eines Protein-Assay-Farbstoffs (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) und Zugang zu einer gleichen Proteinmenge bestimmt und dann durch Elektrophorese auf SDS-PAGE aufgetrennt. Nachdem die Proteine ​​auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen (1620177, BIO-RAD) übertragen wurden, wurde die PVDF-Membran in 5 % Magermilch bei 1X TBST eingetaucht, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert und dreimal mit 1X TBST gewaschen 5 Minuten. Als nächstes inkubierten wir die PVDF-Membran mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4 °C, wuschen sie dreimal 5 Minuten lang mit 1X TBST und inkubierten sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit dem sekundären Antikörper. Nach der Inkubation des sekundären Antikörpers wurde es dreimal 5 Minuten lang mit 1X TBST gewaschen, dann fügten wir das Substratkit für verstärkte Chemilumineszenz (ECL) (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma) hinzu und detektierten das Proteinsignal mit einem Röntgenprozessor (MXP{{ 19}}, KODAK, Rochester, NY, USA) auf Röntgenfilm (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Primäre und sekundäre Antikörper wurden mit 5 % Magermilch in 1X TBST verdünnt, und die detaillierten Informationen lauten wie folgt: 1:2000 für Uromodulin (sc-20631, Santa Cruz, Dallas, TX, USA) und 1:20.000 für Kaninchen HRP 2. Antikörper (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, USA).

2.7. Vorhersage der Proteinstruktur

Dynamite wurde für die 3D-Strukturvorhersage des Wildtyps und des mutierten Uromodulins (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; abgerufen am 15. Juni 2022) unter Verwendung der Volllängenstruktur des nativen menschlichen Uromodulins (Protein) eingesetzt Datenbank: 7PFP) [28]. DiANNA wurde für die Vorhersage der Disulfidbindung (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/; abgerufen am 16. Juni 2022) des Wildtyps und des mutierten Uromodulins verwendet [29–31].

2.8. Statistische Analyse

Die ImageJ-Analysesoftware analysierte und quantifizierte die Western-Blot-Banden. Die statistischen Analysen und Grafiken wurden mit der GraphPad Prism8-Software (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, USA) durchgeführt und erstellt, und der Mittelwert ± SEM wurde dargestellt. Für einen Zwei-Gruppen-Vergleich wurde ein ungepaarter T-Test angewendet. Die statistischen Ergebnisse wurden wie folgt markiert: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt.

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