Urin-Metabolomik deckt anormale Erholung nach maximaler Anstrengung bei weiblichen ME/CFS-Patienten auf, Teil 3

Warum werden wir müde sein? Wie können wir die Ermüdungsprobleme lösen?

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3. Diskussion

Dies ist das erste Mal, dass das Urinmetabolom von ME/CFS-Patienten vor und nach einer körperlichen Belastung charakterisiert wurde, wenn ME/CFS-Patienten unter PEM leiden. Viele dieser Metaboliten wurden noch nie zuvor bei ME/CFS-Patienten gemessen, da frühere Studien zur Urinmetabolomik bei ME/CFS auf weniger als 50 Metaboliten beschränkt waren und in der aktuellen Studie 1403 gemessen wurden. Darüber hinaus ist die Verwendung sitzender gesunder Kontrollpersonen zu berücksichtigen Das Niveau der körperlichen Aktivität, das sich auf die Metabolitenwerte zu Studienbeginn und nach dem Training auswirken kann, ist ein wesentlicher Vorteil des aktuellen Studiendesigns, der in früheren Studien nicht genutzt wurde. Unsere Ergebnisse zeigten einen weit verbreiteten Anstieg der Metabolitenspiegel im Urin der Kontrollpersonen 24 Stunden nach dem Training, der bei ME/CFS-Patienten nicht beobachtet wurde, wobei 110 dieser Verbindungen eine signifikante Wechselwirkung zwischen dem Krankheitsstatus (ME/CFS oder Kontrollgruppe) aufwiesen ) und Zeit (Grundlinie vs. nach dem Training) (Ergänzende Abbildung S2). Zusätzlich zu zahlreichen Analysen der Metabolitenspiegel im Urin lieferte die Korrelation der Metabolitenspiegel in Urin und Plasma zusätzliche Hinweise auf eine metabolische Dysregulation bei ME/CFS-Patienten nach dem Training. Diese Analyse lieferte weitere Hinweise auf pathophysiologische Veränderungen in mehreren Unterwegen sowie Hinweise auf Unterschiede in weiteren Unterwegen, die bei isolierter Betrachtung der Metabolitenspiegel im Urin keine großen signifikanten Unterschiede zwischen den ME/CFS-Patienten und den Kontrollpersonen aufwiesen.

Cistanche kann als Anti-Müdigkeits- und Ausdauerverstärker wirken, und experimentelle Studien haben gezeigt, dass das Abkochen von Cistanche tubulosa die Leberhepatozyten und Endothelzellen, die bei schwimmenden Mäusen unter Belastung geschädigt wurden, wirksam schützen, die Expression von NOS3 hochregulieren und das Leberglykogen fördern kann Synthese und übt so eine Anti-Ermüdungswirkung aus. Phenylethanoidglykosid-reicher Cistanche tubulosa-Extrakt könnte die Kreatinkinase-, Laktatdehydrogenase- und Laktatspiegel im Serum erheblich senken und den Hämoglobin- (HB) und Glukosespiegel bei ICR-Mäusen erhöhen. Dies könnte eine Anti-Müdigkeitsrolle spielen, indem es die Muskelschädigung verringert und Verzögerung der Milchsäureanreicherung zur Energiespeicherung bei Mäusen. Die zusammengesetzten Cistanche Tubulosa-Tabletten verlängerten die Schwimmzeit unter Belastung erheblich, erhöhten die Glykogenreserve in der Leber und senkten den Harnstoffspiegel im Serum nach dem Training bei Mäusen, was ihre Anti-Ermüdungswirkung zeigte. Das Abkochen von Cistanchis kann die Ausdauer verbessern und die Beseitigung von Müdigkeit bei trainierenden Mäusen beschleunigen. Außerdem kann es den Anstieg der Serumkreatinkinase nach Belastungsübungen verringern und die Ultrastruktur der Skelettmuskulatur von Mäusen nach dem Training normal halten, was darauf hinweist, dass es die Wirkung hat zur Verbesserung der körperlichen Stärke und zur Bekämpfung von Müdigkeit. Cistanchis verlängerte auch die Überlebenszeit von mit Nitrit vergifteten Mäusen erheblich und erhöhte die Toleranz gegenüber Hypoxie und Müdigkeit.

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3.1. Vergleich mit früheren Urin-Metabolomics-Studien bei ME/CFS-Patienten

Insgesamt stimmen unsere Ergebnisse nicht mit den wenigen früheren Studien überein, in denen Urinmetaboliten bei ME/CFS-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen ohne ME/CFS gemessen wurden. Um unsere Ergebnisse besser mit früheren Studien vergleichen zu können, in denen weniger Metaboliten gemessen wurden, haben wir die Ergebnisse zu Studienbeginn für p < 0.05 im LMM mit den vorherigen Studien verglichen. Die einzige Verbindung, die sich in einer anderen und unserer Studie als signifikant herausstellte, war Alanin, obwohl die vorherige Studie ergab, dass Alanin bei weiblichen Patienten niedriger war als bei Kontrollpersonen (BH-adjustierter p-Wert < 0,05) und in In unserer Studie war die mittlere normalisierte Konzentration bei den ME/CFS-Patienten höher als bei den Kontrollpersonen [20]. Allerdings fanden wir in mehreren Studien zu Studienbeginn Unterschiede bei den Verbindungen, die sich unserer Meinung nach bei den ME/CFS-Patienten und den Kontrollpersonen während der körperlichen Erholung unterschiedlich veränderten, darunter Phenylalanin (geringer bei ME/CFS-Patienten [23,24]) und Valin (geringer bei ME/CFS-Patienten [20]). Sowohl Phenylalanin als auch Valin waren bei den sesshaften Kontrollpersonen nach dem Training in der aktuellen Studie ebenfalls signifikant erhöht, sodass es möglich ist, dass die Kontrollpersonen in anderen Studien aktiver waren und bereits höhere Phenylalaninwerte im Urin aufwiesen. Keine anderen Studien rekrutierten speziell sesshafte Nicht-ME/CFS-Probanden, obwohl eine Studie versuchte, dem „allgemeinen Lebensstil“ zu entsprechen [23]. Armstrong et al. untersuchten Pearsons Korrelationen zwischen Urin- und Plasmametaboliten bei ME/CFS-Patienten und Kontrollpersonen zu Studienbeginn und fanden Unterschiede bei Acetat, Laktat und Phenylalanin mit einem Schwellenwert von |R| > 0,4 ​​in beiden Gruppen [20]. Acetat ist zu klein, um in unserem Test nachgewiesen zu werden, und wir konnten keine Unterschiede in den Plasma- und Urinkorrelationen bei Laktat oder Phenylalanin feststellen.

McGregor und Kollegen untersuchten auch Veränderungen im Urin- und Plasmametabolom bei ME/CFS-Patienten mit PEM [19]. Mithilfe einer Umfrage trennten sie die ME/CFS-Patienten, die in den letzten sieben Tagen aktuell unter PEM litten, und stellten fest, dass acht von dreißig gemessenen Urinmetaboliten in der ME/CFS-Gruppe im Vergleich zu den Kontrollpersonen deutlich niedrigere Konzentrationen aufwiesen. Von diesen wies in unseren Analysen nur Serin signifikante Unterschiede auf; es stieg nach dem Training in der Kontrollgruppe an (Supplementary Data File S2 – LMM-Ergebnisse). Auch die Konzentrationen von zwei Urinmetaboliten, Acetat und Methylhistidin, unterschieden sich in der PEM-Gruppe signifikant von der Gruppe ohne PEM [19]. Die Konzentrationen der in dieser Studie untersuchten Methylhistidine unterschieden sich in der LMM-Analyse nicht signifikant, wir fanden jedoch Unterschiede in den Plasma- und Urinkorrelationen von 1-Methylhistidin und N-Acetyl-3-Methylhistidin (Abbildung 9). McGregor et al. fanden auch Zusammenhänge zwischen den Sieben-Tage-PEM-Scores und mehreren Metaboliten im Plasma und Urin [19].

3.2. Der Anstieg der Metabolitenwerte im Urin bei Personen mit sitzender Tätigkeit nach dem Training steht im Einklang mit früheren Studien

Das Urinmetabolom bei Frauen 24 Stunden nach dem Training ist nicht gut charakterisiert. Nach unserem besten Wissen haben keine Studien das Urinmetabolom zu Studienbeginn im Vergleich zu 24 Stunden nach dem Training bei Frauen gemessen. In einer Studie wurden 32 Metaboliten im Urin vor dem Training und 24 Stunden nach dem Training bei Männern gemessen. Dabei wurden neun Wettkampfradfahrer mit acht gesunden, aber untrainierten Männern im gleichen Alter (50–60 Jahre alt) verglichen (48). Während sich ihre Studie auf den Vergleich der Athleten mit den untrainierten Probanden konzentrierte, stellten sie bei den Kontrollprobanden nach dem Training einen starken Anstieg der Laktat-, Acetat- und Hypoxanthinspiegel um ein Vielfaches fest (signifikanter als das Zweifache). Acetat wurde in unserer Studie nicht gemessen und weder Laktat noch Hypoxanthin unterschieden sich in unserer weiblichen Kontrollgruppe vom Ausgangswert bis nach dem Training. Mukherjee et al. fanden signifikante Unterschiede zwischen der Sportler- und der Kontrollgruppe bei acht der gemessenen Metaboliten, die mit verschiedenen biochemischen Signalwegen zusammenhängen [48]. Eine Stärke der aktuellen Studie ist daher die Auswahl sesshafter gesunder Kontrollpersonen im Gegensatz zu aktiveren Personen, die aufgrund regelmäßiger körperlicher Betätigung möglicherweise ein verändertes Urinmetabolom aufweisen.

Während es einen Mangel an veröffentlichter Literatur zum Urinmetabolom 24 Stunden nach dem Training gibt, gibt es mehrere Studien, in denen Urinmetaboliten sowohl bei Männern als auch bei Frauen zu früheren Zeitpunkten nach dem Training gemessen wurden (Übersicht in [49]). Eines der Ergebnisse, das zwischen den Studien konsistent war, ist, dass die Konzentration der meisten Lipide in Bioflüssigkeiten nach dem Training ansteigt, auch im Urin. Insbesondere wurde gezeigt, dass die Acylcarnitin-Konzentrationen in Blut und Urin als Reaktion auf körperliche Betätigung ansteigen. Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen unserer Studie, in der mehrere Acylcarnitin-Verbindungen nach dem Training im Urin der Kontrollpersonen signifikant erhöht waren (Abbildung 7A).

Die größte Studie, an der Frauen teilnahmen (insgesamt 255 Probanden, 107 weiblich), fand auch umfangreiche Stoffwechselveränderungen im Urin nach dem Training, wobei 37 von 47 gemessenen Metaboliten nach der FDR-Korrektur signifikant verändert waren und 33 davon nach dem Training erhöht waren [50] . Dies steht im Einklang mit unserer Feststellung, dass sich der Urin von Kontrollpersonen nach dem Training stark verändert hat, wobei bei der Mehrzahl der veränderten Verbindungen erhöhte Konzentrationen festgestellt wurden. Diese Studie führte auch eine geschlechtsstratifizierte Vergleichsanalyse durch, fand jedoch nur zwei Metaboliten mit signifikant unterschiedlichen Post-Training/Baseline-Verhältnissen bei Frauen und Männern.

Im Artikel von Schranner et al. In einer Übersichtsarbeit sind die Ergebnisse für Aminosäuren nicht so konsistent wie die für Lipide, die im Allgemeinen nach dem Training ansteigen [49]. Einige Ergebnisse im Urin waren jedoch in mindestens zwei Studien konsistent (obwohl alle Zeitpunkte nach dem Training zusammengefasst wurden), einschließlich der Tatsache, dass die folgenden Verbindungen im Urin nach dem Training zunahmen: Alanin, O-Acetylhomoserin, 5- Hydroxyindolpyruvat, Xanthurenat, L-Metanephrin, N-Acetylvanilalanin und N-(Carboxyethyl)-Arginin. In mindestens zwei Studien wurde festgestellt, dass die folgenden Verbindungen im Urin nach dem Training verringert waren: Glycin, Histidin, Trimethylamin-n-oxid. Vergleicht man diese Ergebnisse mit unserer Studie, so waren die meisten Metaboliten entweder vor und nach dem Training nicht signifikant unterschiedlich oder wurden in unserer Studie nicht gemessen. Allerdings fanden wir auch bei den Kontrollen einen signifikanten Anstieg des Alaninspiegels, was mit den überprüften Studien übereinstimmt. In unserer Studie waren die Glycinspiegel bei den Kontrollpersonen auch nach dem Training erhöht statt verringert. Allerdings haben Kistner et al. In einer Studie, an der viele Frauen teilnahmen, wurde auch festgestellt, dass der Glycinspiegel nach dem Training deutlich erhöht war [50].

3.3. Unterschiede zwischen sitzenden Kontrollpersonen und ME/CFS-Patienten im Lipid-Superpathway

Viele Lipid-Unterwege unterschieden sich im Urin der Patienten und Kontrollpersonen in dieser Studie signifikant, einschließlich des Acylcarnitin-Fettsäurestoffwechsels. Acylcarnitin-Metaboliten waren bei gesunden Kontrollpersonen nach dem Training im Urin erhöht und die durch das Training hervorgerufenen Veränderungen unterschieden sich signifikant zwischen den Kontrollpersonen und ME/CFS-Patienten (Abbildungen 3, 7 und S4). Obwohl Desoxycarnitin kein Acylcarnitin ist, korrelierte Desoxycarnitin im Lipid-Unterweg des Carnitinstoffwechsels bei den ME/CFS-Patienten anders zwischen Plasma und Urin als bei den Kontrollen (Abbildung 9). Acylcarnitine sind im Energiestoffwechsel sehr wichtig, da sie für den Transport von Fettsäuren in die Mitochondrien zur Oxidation benötigt werden. Die Oxidation langkettiger Fettsäuren ist die primäre Form des Energiestoffwechsels bei Aerobic-Übungen. Ein gestörter Acylcarnitin-Stoffwechsel während des Trainings könnte bei ME/CFS-Patienten zu Belastungsintoleranz und PEM beitragen. In einer anderen Studie, die sich nur mit Probanden zu Studienbeginn befasste und in der keine speziell sesshaften Kontrollpersonen rekrutiert wurden, wurde festgestellt, dass der Acylcarnitin-Unterweg bei ME/CFS-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen signifikant unterschiedlich ist, wobei fünf von acht Verbindungen bei den Patienten eine niedrigere Konzentration aufwiesen [11]. Wenn nur Studienteilnehmer analysiert wurden, zeigten spezifische Messungen von Acylcarnitin im Serum in einem Bericht, dass die Verbindung bei ME/CFS-Patienten niedriger war als bei den Kontrollpersonen [51], in einer anderen Studie wurden jedoch keine Unterschiede im Urin- oder Plasmaspiegel festgestellt [52]. Im Plasma der größeren Kohorte, zu der die Probanden der aktuellen Studie gehören, war der chemische Carnitin-Cluster auch bei weiblichen Kontrollpersonen mit sitzender Tätigkeit während der Erholung signifikant verändert (definiert als der Unterschied zwischen 24 Stunden nach dem Training und 15 Minuten nach dem Training). ), wobei die Mehrzahl der Verbindungen nach dem Training zunimmt [25]. Es wurde festgestellt, dass sich der chemische Carnitin-Cluster während der körperlichen Erholung bei ME/CFS-Patienten nicht signifikant verändert. Während dieser Cluster mehr als nur Acylcarnitine umfasst, sind Acylcarnitine Mitglieder und tragen auch in der aktuellen Studie zu seiner Bedeutung bei der Analyse der Anreicherung chemischer Ähnlichkeiten bei (ergänzende Abbildung S4). Es wurde auch ex vivo gezeigt, dass Palmitoylcarnitin, das im Muskel vorübergehend nach dem Training erhöht ist, als Belastungssignal vom Muskel an eine Untergruppe von Neuronen wirken kann [53].

Acylglycin-Fettsäure-Metaboliten sind die einzigen Verbindungen, die bei ME/CFS zu einem bestimmten Zeitpunkt (24 Stunden nach dem Training) in signifikant unterschiedlichen Konzentrationen im Urin im Vergleich zu Kontrollen gefunden wurden, und eine andere Acylglycin-Verbindung, 3-Hydroxybutyroylglycin , hatte eine signifikante negative Korrelation bei den ME/CFS-Patienten, wenn U3/U1 mit P3/P1 korreliert wurde (Abbildungen 5 und 9). Darüber hinaus veränderte sich cis-3,4-Methylenheptanoylglycin während der körperlichen Erholung bei den ME/CFS-Patienten anders als bei den Kontrollpersonen (LMM, ergänzende Abbildung S2). Während der Acylglycin-Metabolismus nicht zu den Unterwegen gehört, die nach dem Training allein bei den Kontrollpersonen signifikant erhöht waren, war er bei den ME/CFS-Patienten im Vergleich zu den Kontrollpersonen sowohl zum Zeitpunkt 24 Stunden nach dem Training als auch bei der Analyse des Unterschieds signifikant unterschiedlich im Verhältnis nach dem Training/Grundlinie (Abbildung 3). Die Urinausscheidung bestimmter Acylglycine wird auch durch Störungen im Zusammenhang mit der Fettsäureoxidation in den Mitochondrien verändert, einschließlich eines Mangels an mittelkettiger Acyl-Coenzym-A-Dehydrogenase (CoA) (MCAD) [54]. Unsere Gruppe hat beobachtet, dass sich die Fettsäureoxidation in Immunzellen von ME/CFS-Patienten im Vergleich zu Kontrollzellen unterscheidet [55].

3.4. Unterschiede zwischen sitzenden Kontrollpersonen und ME/CFS-Patienten im Aminosäure-Superpathway

Wir fanden auch viele Unterschiede im Urin in Bezug auf Aminosäuren bei ME/CFS-Patienten und Kontrollpersonen nach dem Training. Zwei dieser Signalwege stachen hervor, weil sie in allen unseren Analysen, einschließlich der KEGG-Signalweganalyse, signifikante Veränderungen bei den ME/CFS-Patienten im Vergleich zu den Kontrollpersonen aufwiesen und weiter unten erörtert werden.

Der Harnstoffzyklus in der Leber ist ein wichtiger Teil des Trainingsstoffwechsels, da er benötigt wird, um große Mengen an Ammoniak zu entfernen, die während des Trainings entstehen [56,57]. Germain und Kollegen fanden außerdem heraus, dass der Harnstoffzyklus und die Ammoniak-Recycling-SMPDB-Pfade im Plasma zwischen weiblichen ME/CFS-Patienten und Kontrollpersonen in einer Pfadanalyse signifikant verändert waren, als sie den Unterschied zwischen den Metabolitenspiegeln 24 Stunden nach der CPET (P3) und verglichen 15 Minuten nach CPET (P2) [25]. Die Ansammlung von Ammoniak wurde zuvor mit Neurotoxizität und durch körperliche Betätigung verursachter Müdigkeit in Verbindung gebracht [56,57]. Die Fehlregulation des Harnstoffzyklus im Urin und in den Plasmametabolomen nach dem Training bei ME/CFS-Patienten kann zu einer Ammoniakbildung führen, aber die 1403 mit Metabolon® im Urin gemessenen Verbindungen enthielten kein Ammoniak, da es sich um eine flüchtige Verbindung handelt und außerdem kleiner ist als die Nachweisgrenze der Metabolon®-Plattform.

Cystein, Methionin, SAM und Taurin sind wichtige Aminosäuren, da sie die einzigen sind, die Schwefel enthalten, und Cystein ist einzigartig in seiner Fähigkeit, Disulfidbindungen zu bilden. Cystein kann auch in Glutathion und Taurin umgewandelt werden. Cystein und Methionin spielen zahlreiche Rollen im Zellstoffwechsel, sind aber auch Schlüsselbausteine ​​von Proteinen [37]. Aufgrund seiner Thiolgruppe ist Cystein an der Katalyse vieler enzymatischer Reaktionen und der Aufrechterhaltung der Redoxhomöostase beteiligt. Veränderungen im Cysteinstoffwechsel treten bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen auf, darunter der Alzheimer-Krankheit, der Huntington-Krankheit und der Parkinson-Krankheit [58]. Während der Cystein-, Methionin-, SAM- und Taurin-Metabolismus in unseren Urin-Metabolomanalysen viele Unterschiede zwischen den Patienten und den Kontrollpersonen aufwies, zeigten die Urin- und Plasmakorrelationen zusätzliche Verbindungen mit signifikanten Unterschieden zwischen den ME/CFS-Patienten und den Kontrollpersonen, einschließlich Cystein entsteht, wenn zwei Cysteine ​​oxidiert werden, um eine Disulfidbindung zu bilden, und Cystathionin, das ein Zwischenprodukt bei der Cysteinproduktion im Methioninzyklus ist [37].

3.5. Einschränkungen

Unsere Studie weist mehrere wichtige Einschränkungen auf. Erstens wurde die Ernährung der Probanden nicht kontrolliert, und die Aufnahme von Metaboliten über die Nahrung kann deren Ausscheidung im Urin beeinflussen. Zweitens erkennen wir an, dass die fehlende BMI-Übereinstimmung nicht ideal ist und eine Einschränkung dieser Studie darstellt. Unsere größere Kohorte von ME/CFS-Patienten und gesunden Kontrollpersonen mit sitzender Tätigkeit entspricht dem BMI. Wenn diese Pilotstudie ausgeweitet wird, wird dies daher in Zukunft kein Problem darstellen. Drittens beschränken sich unsere Ergebnisse auf weibliche ME/CFS-Patienten. Obwohl es sehr wichtig ist, beide Geschlechter bei ME/CFS zu untersuchen und immer mehr Geschlechtsunterschiede in der Pathophysiologie entdeckt werden [25,59,60], haben wir uns aufgrund der höheren Krankheitslast von ME entschieden, unsere Pilotstudie auf Frauen zu konzentrieren /CFS bei Frauen (60–65 % weiblich) [2]. Da wir außerdem das Urinmetabolom nur zu zwei Zeitpunkten, zu Beginn und 24 Stunden nach dem Training, erfasst haben, können wir nicht sagen, ob die ME/CFS-Patienten zu einem früheren oder späteren Zeitpunkt veränderte Ausscheidungsniveaus einiger dieser Metaboliten hatten oder nicht Punkt als die Kontrollen. Dieser Anstieg der Ausscheidungsprodukte kann bei Patienten auftreten, jedoch mit größerer Verzögerung, ähnlich wie bei ME/CFS-Patienten eine verzögerte allgemeine Erholung nach sportlicher Betätigung. Es ist jedoch auch möglich, dass dieser Mangel an veränderter Stoffwechselausscheidung Teil eines allgemeinen Mangels an einer gesunden Stoffwechselreaktion auf körperliche Betätigung ist.

4. Materialien und Methoden

4.1. Studienfächer

In diese Studie wurden acht gesunde, sesshafte Kontrollpersonen und zehn ME/CFS-Patienten einbezogen. ME/CFS-Patienten wurden anhand der Canadian Consensus Criteria diagnostiziert [3]. Die 18 in diese Studie einbezogenen Probanden waren Teil einer größeren Kohorte von insgesamt 173 Teilnehmern (ClinicalTrials.gov-Identifikator: NCT04026425) [61]. In dieser Pilotstudie waren alle Probanden weiblich. Die Probanden wurden nach den folgenden Kriterien rekrutiert. Alle Teilnehmer müssen zwischen 18 und 70 Jahre alt sein. Probanden wurden aus beiden Gruppen ausgeschlossen, wenn sie rauchten, schwanger waren oder stillten, Diabetiker waren, übermäßig viel Alkohol konsumierten oder eine orthopädische Einschränkung hatten, die sie an der Durchführung des CPET hinderte. Auch die Diagnose einer Schizophrenie, einer schweren depressiven Störung, einer bipolaren Störung oder einer Angststörung war in beiden Gruppen ein Ausschlusskriterium. Darüber hinaus wurden gesunde, sesshafte Kontrollpersonen ausgeschlossen, wenn bei ihnen Autoimmunerkrankungen diagnostiziert wurden. Die Nierenfunktion war bei allen Probanden dieser Studie normal, was durch die folgenden Standard-Laborbluttests von Quest Diagnostics beurteilt wurde: Serumkreatinin, Blut-Harnstoff-Stickstoff und geschätzte glomeruläre Filtrationsrate (eGFR).

Siebzehn Probanden führten den Belastungstest am Ithaca College in Ithaca, New York durch, und ein Proband führte den Belastungstest am ID Med in Torrance, Kalifornien durch. Alle Teilnehmer wurden gebeten, vor dem Belastungstest zwei Wochen lang auf Nahrungsergänzungsmittel einschließlich Probiotika zu verzichten. Die Teilnehmer wurden gebeten, vor dem Belastungstest zwei Tage lang keine Schmerz- und Stimulanzien einzunehmen. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab und alle Protokolle wurden vom Ithaca College IRB #1017-12Dx2 genehmigt. Alle Teilnehmer füllten die Bell Disability Scale [26], die Kurzform-36-Gesundheitsumfrage [62] und benutzerdefinierte Fragebögen aus. Die ME/CFS-Patienten führten zusätzlich das mehrdimensionale Fatigue-Inventar durch [63].

4.2. Kardiopulmonale Belastungstests und Urinprobenentnahme

Der CPET wurde auf einem stationären Fahrradergometer mit dem folgenden Protokoll durchgeführt: 3 Minuten Ruhe, gefolgt von kontinuierlichem Radfahren, bei dem die zunehmende Arbeitsbelastung um 15 Watt pro Trainingsminute ansteigt, bis zur willentlichen Erschöpfung (ca. 8–10 Minuten). Das respiratorische Austauschverhältnis (RER), also die Rate der Kohlendioxidproduktion dividiert durch die Rate des Sauerstoffverbrauchs, wurde gemessen, um sicherzustellen, dass die Teilnehmer den Test mit ausreichender Anstrengung durchführten (RER > 1,1 bedeutet maximale Anstrengung).

Alle Urinproben wurden morgens gesammelt: (1) 15–20 Minuten vor dem CPET und (2) 24 Stunden später. Der Urin wurde in der Mitte des Strahls in sterilen Urinsammlern gesammelt, aliquotiert, 10 Minuten lang bei 10,000× g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und bei –80 °C gelagert. Urinproben wurden zur weiteren Aliquotierung einem Einfrier-/Auftauzyklus unterzogen und die Aliquots wurden über Nacht auf Trockeneis zu Metabolon® transportiert.

4.3. Metabolomics-Assay

Metaboliten wurden mithilfe der globalen Metabolomics-Plattform Precision Metabolomics™ Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) bei Metabolon® gemessen. Detaillierte Methoden wurden bereits zuvor beschrieben [64]. Kurz gesagt wurden die Proben in Methanol (5:1 Methanol:Probe) extrahiert und dann eingedampft. Metaboliten wurden in jeder Probe mithilfe von vier verschiedenen LC-MS/MS-Plattformen nachgewiesen, die für hydrophile und hydrophobe Verbindungen optimiert waren und sowohl positive als auch negative Ionisierung nutzten. Bei der gesamten Chromatographie wurden ein Ultrahochleistungs-LC (UP)LC von Waters Acquity und ein Injektionsvolumen von 5 µL verwendet (wobei die Proben in geeigneten Lösungsmitteln für jede Plattform rekonstituiert wurden). Die gesamte Massenspektrometrie wurde mit einem ThermoScientific Q-Exactive hochauflösenden/präzisen Massenspektrometer mit beheizten Elektrospray-Ionisationsquellen (HESI-II) und Orbitrap-Massenanalysatoren mit einer Massenauflösung von 35,000 und einem Scanbereich von 70–1000 m/ durchgeführt. z. Die proprietäre Metabolon®-Software wurde verwendet, um experimentelle Proben mit einer Referenzbibliothek von Identifizierungsstandards der Stufe 1 gemäß der Definition der Metabolomics Standards Initiative abzugleichen, und die Fläche unter der Kurve wurde zur Peakquantifizierung verwendet. Die Werte sind im Hinblick auf die Rohflächenzählung normalisiert und alle Proben wurden in einer Charge durchgeführt, sodass keine Chargenkorrektur erforderlich war. Für die unbekannten Verbindungen gibt es keinen Standard, und teilweise charakterisierte Moleküle sind solche, die nicht offiziell auf der Grundlage eines Standards bestätigt wurden oder für die kein Standard verfügbar ist, Metabolon® ist sich seiner Identität jedoch einigermaßen sicher.

4.4. Datenverarbeitung

Die Rohdaten wurden für jede Probe durch Osmolalität normalisiert und die Daten für jeden Metaboliten wurden auf den Medianwert 1 zentriert (Rohdaten einschließlich Osmolalität sind in der Ergänzungsdatei S1 verfügbar). Fehlende Werte wurden mit dem Mindestwert imputiert, mit Ausnahme von Arzneimitteln, die als 0 imputiert wurden. Die Daten wurden mit einer varianzstabilisierenden Transformation (MetaboanalystR) log10-transformiert [65,66]. Insgesamt wurden ursprünglich 1403 Metaboliten gemessen. Metaboliten wurden nach der modifizierten 80 %-Regel gefiltert: Eine Verbindung wurde einbezogen, wenn sie in mindestens 80 % der Proben in der ME/CFS-Gruppe oder der Kontrollgruppe nachgewiesen wurde [27]. Insgesamt erfüllten 1154 Metaboliten die Kriterien und wurden in die nachfolgenden Analysen einbezogen. Die einzige ohne Filterung durchgeführte Analyse betraf die Korrelationen mit Plasmametaboliten. Die Verhältnisse nach dem Training/Ausgangswert für jeden Metaboliten wurden in der Logarithmusbasis 10 als Wert nach dem Training minus dem Ausgangswert für jedes Subjekt berechnet. Zur Darstellung des Vulkandiagramms wurden die mittleren logarithmischen Faltungsänderungen (ME/CFS-Patienten vs. Kontrollen) unter Verwendung der Basisänderungsformel in logarithmische Basis 2 umgerechnet.

4.5. Datenanalyse und Statistik

Eine univariate statistische Analyse für jeden Metaboliten wurde unter Verwendung eines linearen gemischten Modells mit festen Auswirkungen von Krankheitsstatus, Zeitpunkt, Alter und BMI und einem zufälligen Effekt des Subjekts (intelligentste [67] und mittlere [68] R-Pakete) durchgeführt. Zur Korrektur der Falscherkennungsrate wurde die Benjamini-Hochberg-Methode (BH) verwendet, wobei q < 0.1 als Signifikanzschwellenwert verwendet wurde. Für Vulkanplots wurde das Paket EnhancedVolcano R verwendet [69].

ChemRICH in R wurde verwendet, um die nicht überlappende Pfadanalyse mit den Metabolon®-definierten Unterpfaden und der Pfadreihenfolge durchzuführen [29]. Das ChemRICH-Webtool wurde verwendet, um die chemische Ähnlichkeitsclusteranalyse durchzuführen [30]. Für diese Analyse konnten nur Verbindungen mit einem bekannten SMILES-Code einbezogen werden, also insgesamt 516 Verbindungen. Für beide ChemRICH-Analysen wurden die Anreicherungsstatistiken mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test durchgeführt, der keinen p-Wert-Signifikanzgrenzwert verwendet, sondern die Wahrscheinlichkeitsverteilung mit einer Nullhypothese-Wahrscheinlichkeitsverteilung vergleicht [70]. Für die Metabolon®-Unterpfade wurde q < 0.05 als Schwelle für die Signifikanz ausgewählt und q < 0,15 wurde für die chemischen Cluster ausgewählt (BH-FDR-Korrektur). Für beide hatten alle Cluster unterhalb der gewählten q-Schwellenwerte ebenfalls p < 0,05.

Die Signalweganreicherung und die Topologieanalyse wurden mit dem Webtool Metaboanalyst 5.0 [65] sowohl für die menschlichen Referenzmetabolome KEGG als auch SMPDB durchgeführt, wobei die folgenden Parameter ausgewählt wurden: ein globaler Test für den Statistiktest und relative Betweenness-Zentralität als das Knotenwichtigkeitsmaß. Verbindungen wurden in diese Analyse einbezogen, wenn die von Metabolon® bereitgestellte HMDB-ID mit der HMDB-ID in Metaboanalyst übereinstimmte. Bei doppelten Verbindungen für eine HMDB-ID wurde nur die erste einbezogen. Dies führte zu 453 eingeschlossenen Verbindungen.

Das Clustering der Probanden unter Verwendung der vier Verbindungen, die sich nach dem Training signifikant zwischen Patienten und Kontrollen unterschieden, wurde mithilfe hierarchischer Clusterung mit der euklidischen Distanz als Distanzmetrik und der Methode „Ward.D2“ (Heatmap-R-Paket [71]) durchgeführt ]).

Pearson-Korrelationen zwischen Urin und Plasma für 727 Metaboliten, die in beiden Bioflüssigkeiten gemessen wurden, wurden in R (hmisc-Paket) durchgeführt. Für jede Korrelation wurden p-Werte unter Verwendung eines t-Tests mit der Nullhypothese berechnet, dass der Korrelationskoeffizient gleich 0 ist, gefolgt von einer BH-FDR-Korrektur mit q < 0.15 als Signifikanzschwelle. Für Abbildung 8 wurden Verbindungen gescreent, um diejenigen zu entfernen, die extreme Ausreißer aufwiesen, und zwar mithilfe der modifizierten Z-Score-Methode, die einen Z-Score unter Verwendung des Medians und der medianen absoluten Abweichung berechnet (Ausreißer-R-Paket, Z-Schwellenwert=6).

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Datenvisualisierungen mit dem Paket ggplot2 R durchgeführt. Für alle Analysen wurde die BH-FDR-Korrektur anstelle der strengeren Benjamini- und Yekutieli-FDR-Korrektur gewählt, da sich herausstellte, dass eine extrem kleine Anzahl von Verbindungen kolinear war (0. 75 % der Ziele hatten einen absoluten Korrelationskoeffizienten nach Pearson > { {3}}.7).

5. Schlussfolgerungen

Insgesamt gab es bei den gesunden, sesshaften Kontrollpersonen und den ME/CFS-Patienten als Reaktion auf eine CPET-Provokation signifikante Unterschiede im Urinmetabolom in einem breiten Spektrum von Super- und Subwegen des Stoffwechsels, die Aminosäuren, Lipide, Kohlenhydrate, Nukleotide, Xenobiotika usw. umfassten Unbekannte. Diese Wege sind an einer Vielzahl physiologischer Funktionen beteiligt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, des Energiestoffwechsels. Dies weist darauf hin, dass ME/CFS-Patienten eine allgemeine metabolische Dysregulation haben, die Teil ihrer Belastungsintoleranz und PEM ist, bei der eine veränderte metabolische Ausscheidung ein Faktor ist. Unsere Daten deuten darauf hin, dass der Stoffwechsel bewegungsarmer Personen, die nicht an ME/CFS leiden, große Veränderungen erfährt, die es ihnen ermöglichen, sich von Anstrengungen zu erholen, während ME/CFS-Patienten keine ähnlichen Anpassungsreaktionen zeigen. Zukünftige Arbeiten umfassen die Ausweitung dieser Studie auf eine viel größere Kohorte, die beide Geschlechter umfasst, um diese Ergebnisse zu validieren, Geschlechtsunterschiede im Urinmetabolom zu untersuchen und zu untersuchen, ob es zu Studienbeginn subtilere Unterschiede in den Urinmetaboliten bei ME/CFS-Patienten gibt, die möglicherweise möglich sind Wir möchten in Zukunft zu einem diagnostischen Test für die Krankheit beitragen.

Autorenbeiträge:Konzeptualisierung, AG, KAG und MRH; Methodik, AG, KAG, YVH und MRH; formale Analyse, KAG, AG und YVH; Untersuchung, KAG, AG und YVH; Schreiben – ursprüngliche Entwurfsvorbereitung, KAG, AG und MRH; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, alle Autoren; Visualisierung, KAG und AG; Projektverwaltung, MRH; Finanzierungseinwerbung, MRH Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Finanzierung:Diese Forschung wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), NIH (U54NS105541) und der Amar Foundation unterstützt. Das National Center for Advancing Translational Sciences des NIH stellte über UL1 TR 002384 Mittel für das Weill Cornell Medicine Clinical and Translational Science Center (CTSC) zur Pflege der REDCap-Datenbank bereit.

Erklärung des Institutional Review Board:Die Studie wurde gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt und vom Ithaca College Institutional Review Board, Ithaca, New York, USA (Protokoll 1017-12Dx2) und dem Weill Cornell Medical College Institutional Review Board ( Protokoll 1708018518).

Einverständniserklärung:Von allen an der Studie beteiligten Probanden wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit:Alle Metabolitendaten für jedes Subjekt sind in den bereitgestellten Zusatzdatendateien verfügbar.

Danksagungen:Carl Franconi leitete die Datenbank und Biobank an der Cornell University. Blutproben wurden von David Wang bei EVMED Research mit Unterstützung der Workwell Foundation und von Ivan Falsztyn, Carl Franconi, Ludovic Giloteaux, Madeline McCanne, Jineet Patel, Adam O'Neal, Alexandra Mandarano, Jessica Maya und Shannon Appelquist an der Cornell University fraktioniert. Wir danken den folgenden Personen, die am Screening der Teilnehmer teilgenommen, Belastungstests durchgeführt und/oder Blut und Urin gesammelt haben: Betsy Keller, John Chia, Jared Stevens, Tiffany Ong und Maria Russell.

Interessenskonflikte:Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie; bei der Sammlung, Analyse oder Interpretation von Daten; beim Schreiben des Manuskripts; oder in der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.

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