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Identifizierung und Verifizierung des vaskulären Zelladhäsionsproteins 1 als immunbezogenes Hubgen, das mit der tubulointerstitiellen Verletzung bei diabetischer Nierenerkrankung assoziiert ist

Yan Jiaet al

ABSTRAKT

Diabetische Nierenerkrankung(DKD) ist die Hauptursache fürchronisches Nierenleiden(CKD) und terminaler Niereninsuffizienz (ESRD), aber die Pathogenese ist noch nicht vollständig geklärt. Eine tubulointerstitielle Verletzung spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Progression von DKD(Diabetische Nierenerkrankung). Die vorliegende Studie zielte darauf ab, das Profil der tubulointerstitiellen Immunzellinfiltration zu untersuchen und die zugrunde liegenden Mechanismen zwischen tubulärer Zellschädigung und interstitieller Entzündung bei DKD aufzudecken(Diabetische Nierenerkrankung)mit bioinformatischen Strategien. Zunächst identifizierte die xCell-Analyse Immunzellen, die signifikante Veränderungen in der DKD aufwiesen(Diabetische Nierenerkrankung)Tubulointerstitium, einschließlich hochregulierter CD4-plus-T-Zellen, Th2-Zellen, CD8-plus-T-Zellen, M1-Makrophagen, aktivierter dendritischer Zellen (DCs) und konventioneller DCs sowie herunterregulierter Tregs. Zweitens wurde die Pyroptose im Vergleich zu anderen Formen des programmierten Zelltods als Hauptform des Zelltods identifiziert. Als wichtigstes hub-Gen wurde das Vascular Cell Adhesion Protein 1 (VCAM1) identifiziert. Die Korrelationsanalyse zeigte, dass VCAM1 signifikant positiv mit Pyroptose und infiltrierten Immunzellen im Tubulointerstitium korreliert war. Die Hochregulierung von VCAM1 im DKD-Tubulointerstitium wurde in der Kohorte der European Renal cDNA Bank weiter verifiziert und korrelierte negativ mit der glomerulären Filtrationsrate (GFR). Unsere In-vitro-Studie validierte eine erhöhte VCAM1-Expression in HK-2-Zellen unter diabetischen Bedingungen, und die Hemmung der Pyroptose durch Disulfiram verringerte die VCAM1-Expression, die Freisetzung von entzündlichen Zytokinen und Fibrose. Zusammenfassend identifizierte unsere Studie eine hochregulierte VCAM1-Expression in renalen Tubuluszellen, die möglicherweise mit infiltrierten Immunzellen interagieren und so die Fibrose fördern. Das von der FDA zugelassene Medikament Disulfiram könnte die Fibrose bei DKD verbessern(Diabetische Nierenerkrankung)indem es auf die tubuläre Pyroptose und die VCAM1-Expression abzielt.

SCHLÜSSELWÖRTER:DKD; Tubulointerstitium; Immunzellen; Pyroptose; VCAM1; Disulfiram

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Einführung

Diabetische Nierenerkrankung(DKD), eine der häufigsten Komplikationen von Diabetes, ist in vielen Industrie- und Entwicklungsländern die Hauptursache für chronische Nierenerkrankungen (CKD) und terminale Niereninsuffizienz (ESRD) [1,2]. Laut einem Bericht des China Kidney Disease Network (CK NET), DKD(Diabetische Nierenerkrankung)macht 26,70 Prozent aller CKD-Fälle aus und stellt eine große medizinische und wirtschaftliche Belastung dar [2]. Die Pathogenese der DKD ist komplex und beinhaltet eine Vielzahl unterschiedlicher Wege. Die Klärung der pathologischen Merkmale und der Pathogenese von DKD wird dazu beitragen, das klinische Management zu verbessern und neue therapeutische Ziele zu identifizieren.

Obwohl glomeruläre Schäden das wichtigste pathologische Merkmal von DKD sind(Diabetische Nierenerkrankung)haben kürzlich zunehmende Beweise gezeigt, dass tubulointerstitielle Pathologie [3,4], wie tubuläre Atrophie, interstitielle Fibrose und interstitielle infiltrierende Immunzellen, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Progression von DKD spielt(Diabetische Nierenerkrankung)[5–7]. Die bioinformatische Analyse stellt eine effektive Methode dar, um große Datenmengen in kürzester Zeit zu verarbeiten und wertvolle Informationen über die Krankheit zu liefern. Allerdings sind bioinformatische Studien, die die tubulointerstitielle Genexpression und die Infiltration von Immunzellen bei DKD untersuchen, relativ selten.

Ziel der Studie war es, die Charakteristika der DKD zu beschreiben(Diabetische Nierenerkrankung)Infiltration von tubulointerstitiellen Immunzellen und die Identifizierung einiger wichtiger Immun- und Entzündungsgene, um neue Einblicke in die Pathogenese und Therapie von DKD zu erhalten. Zuerst ein tubulointerstitieller Microarray-Datensatz von DKD(Diabetische Nierenerkrankung)wurde von der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank heruntergeladen. Unter Verwendung von xCell [8], einem webbasierten Tool, das eine Zelltyp-Anreicherungsanalyse von Genexpressionsdaten für 64 Immun- und Stromazelltypen durchführt, untersuchten wir zunächst die Unterschiede in der Immunzellinfiltration zwischen Nierengeweben von Personen mit DKD(Diabetische Nierenerkrankung)und normale Kontrollen. Zweitens wurde eine Liste von immunbezogenen differentiell exprimierten Genen (DEGs) gescreent, unter denen das Gen mit der höchsten Position, das vaskuläre Zelladhäsionsprotein 1 (VCAM1), als Immun-Hub-Gen bei DKD identifiziert wurde(Diabetische Nierenerkrankung). Dann wurden Gensätze, die mit verschiedenen Formen des Zelltods assoziiert sind, von GeneCards erhalten, und die Pyroptose wurde als Hauptform des Zelltods unter Verwendung von Gensatz-Variationsanalysen (GSVA) ​​und Gensatz-Anreicherungsanalysen (GSEA) bewertet. Darüber hinaus zeigte eine Korrelationsanalyse, dass VCAM1 positiv mit der tubulointerstitiellen Immunzellinfiltration und Pyroptose korrelierte. Die hochregulierte Expression von VCAM1 im DKD-Tubulointerstitium wurde in der Kohorte der European Renal cDNA Bank (ERCB) weiter verifiziert und es wurde beobachtet, dass sie bei Patienten mit DKD negativ mit der Nierenfunktion korreliert. Eine In-vitro-Studie bestätigte eine erhöhte VCAM1-Expression in HK-2-Zellen, die unter diabetischen Bedingungen kultiviert wurden, und die Hemmung der Pyroptose durch das von der FDA zugelassene Medikament Disulfiram verringerte die VCAM1-Expression, die Freisetzung entzündlicher Zytokine und die Fibrose. Daher könnten tubuläre Pyroptose und hochregulierte VCAM1-Expression Ziele für eine Immuntherapie von DKD sein.

Methoden

Microarray-Daten

Der menschliche Genexpressionsdatensatz GSE30529 wurde vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO, database. GSE30529 (GPL571 [HG U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array) heruntergeladen ) bestand aus 10 DKD(Diabetische Nierenerkrankung)Tubulusproben und 12 Kontrollproben

Datenverarbeitung

Die Rohdaten im GSE30529-Datensatz wurden heruntergeladen und mit dem Limma-Paket bzw. dem Oligo-Paket verarbeitet [9,10]. Die Datenverarbeitung umfasste Hintergrundkorrektur, Normalisierung und Ausdrucksberechnung. Wenn mehrere Sonden einem Gensymbol zugeordnet wurden, wurde das durchschnittliche Expressionsniveau der Sonden berechnet und als das Genexpressionsniveau dieses Gens betrachtet. Die Sonden, die nicht auf Gene kartierten, wurden entfernt.

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Immun- und Stromazellanalysen

Wir haben eine neuartige, auf Gensignaturen basierende Methode, xCell [8], angewendet, um den Zelltyp-Anreicherungs-Score abzuschätzen und das Profil von infiltrierenden Immunzellen im Tubulointerstitium von Patienten mit DKD zu bestimmen(Diabetische Nierenerkrankung). xCell ist eine Methode zur Zelltyp-Anreicherungsanalyse unter Verwendung der Single-Sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA), die die Anreicherungs-Scores für 64 Zelltypen berechnet, darunter 34 Arten von Immunzellen, 30 Arten von Stromazellen und andere Zellen. Es übertrifft andere In-silico-Analysen (einschließlich CIBERSORT) bei weitem, indem es mehr Arten von Immunzellen umfasst und eine Spillover-Kompensationstechnik einsetzt, um Abhängigkeiten zwischen eng verwandten Zelltypen zu verringern. Die 34 Arten von Immunzellen wurden in neun Gruppen eingeteilt, darunter CD4 plus T-Zell-Subpopulationen, CD8 plus T-Zell-Subpopulationen, Gamma-Delta-T-Zellen (Tδ-Zellen), NK-Zellen, NKT-Zellen, B-Zell-Subpopulationen, Monozyten/Makrophagen-Subpopulationen, Subpopulationen dendritischer Zellen (DC) und Granulozyten-Subpopulationen.

Genset-Anreicherungsanalysen (GSEA) und Genset-Variationsanalysen (GSVA)

Unter Verwendung der Hallmark-Gensets als Referenz-Genset führten wir Genset-Variationsanalysen (GSVA) ​​zwischen DKD durch(Diabetische Nierenerkrankung) and control tissues using the GSVA Bioconductor package [11]. The thresholds were set to enrichment score change > 1.0, p-value < 0.05 and t value >2. Es wurden sowohl hochregulierte als auch herunterregulierte Wege identifiziert. GSEA wurde mit der GSEA-Desktop-Anwendung durchgeführt [12], und eine False-Discovery-Rate (FDR)<0.25 and="" p-value=""><0.05 were="" set="" as="" the="">

Konstruktion von Gensets, die verschiedene Formen der Zelltod- und Anreicherungsanalyse darstellen

Gensätze, die verschiedene Formen des Zelltods darstellen, wurden konstruiert, indem die Schlüsselwörter „Pyroptose“, „Nekrose“, „Nekroptose“, „Apoptose“, „Ferroptose“ und „Autophagie“ in der GeneCards-Datenbank (https://www.genecards .org/). Nichtproteinkodierende Gene wurden entfernt. Die Gensätze sind in Tabelle S2 aufgeführt. Dann wurde Genset-GSEA unter Verwendung der GSEA-Desktopanwendung durchgeführt, um die Zelltodform im Tubulointerstitium zu bewerten. Wir führten Korrelationsanalysen nach Pearson durch, um die Beziehung zwischen zentralen Zelltodwegen und infiltrierenden Immunzellen im Tubulointerstitium zu untersuchen

Analyse von DEGs und Screening von Immunhub-Genen

DEGs zwischen Patienten mit DKD(Diabetische Nierenerkrankung)und gesunde Kontrollen wurden unter Verwendung des 'Limma'-Pakets [13] in der R-Software identifiziert. Ein angepasster P-Wert<0.05 and="" log="" fold="" change="" (fc)="" ≥="" 1="" were="" set="" as="" the="" thresholds.="" a="" list="" of="" 1793="" immune-related="" genes="" was="" down-loaded="" from="" immport="" shared="" data="" (https://www.="" immport.org/shared/genelists),="" and="" shared="" genes="" from="" the="" two="" datasets="" (degs="" and="" immunerelevant="" gene="" list)="" were="" determined="" by="" constructing="" a="" venn="" diagram="" to="" identify="" immune-related="" hub="" genes.="" an="" analysis="" of="" the="" functional="" interactions="" between="" proteins="" might="" provide="" insights="" into="" the="" mechanisms="" of="" dkd="">(Diabetische Nierenerkrankung). In der vorliegenden Studie wurden die Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (PPI) von 94 gemeinsamen Genen unter Verwendung der STRING-Datenbank (https://string-db.org/) generiert und mit der Cytoscape-Software (Version 3.7.1, http ://www.cytoscape.org/). Ein Interaktionswert von mehr als 0,4 (mittleres Vertrauen) wurde als statistisch signifikant angesehen. CytoHubba, ein Cytoscape-Plugin, wurde verwendet, um PPI-Netzwerk-Hub-Gene zu untersuchen [14]. Unter ihnen war VCAM1 das Gen mit dem höchsten Rang. Anreicherungsanalysen der oben identifizierten 30 Immunhub-Gene wurden mit dem Online-Tool Metascape durchgeführt [15]. Darüber hinaus wurden dominante Module im PPI-Netzwerk mithilfe des MCODE-Plugins (Version 1.4.2, http://apps.cytoscape.org/apps/MCODE) in der Cytoscape-Software identifiziert.

VCAM1-Verifikation und Korrelationsanalyse mit Nierenfunktion

Die differentielle Expression von VCAM1 im Tubulointerstitium von Patienten mit DKD(Diabetische Nierenerkrankung)wurde in der ERCB-Kohorte (31 gesunde Kontrollen und 17 Patienten mit DKD) validiert. Dann nutzten wir die Online-Datenbank Nephroseq v5 (http://v5.nephroseq.org), eine integrierte Data-Mining-Plattform für Genexpressionsdatensätze von Nierenerkrankungen, um die Korrelation zwischen der VCAM1-Expression und den klinischen Merkmalen von Patienten mit DKD zu validieren Korrelationsanalyse nach Pearson in ERCB. Ein p-Wert von<0.05 was="" considered="" statistically="">

Immunfluoreszenzfärbung für VCAM1

Paraffin-Nierenschnitte eines Patienten mit klinisch-pathologischer Diagnose von DKD(Diabetische Nierenerkrankung)wurden mit VCAM1 gefärbt. Dies wurde vom Committee on Research Ethics of Peking University First Hospital (NO. 20171280) genehmigt. Unspezifische Bindung wurde mit 3 % BSA nach Fixierung und Wärmebehandlung zur Antigengewinnung blockiert. Nierenschnitte wurden dann mit einem primären Antikörper gegen VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:200) über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Der Cy3--markierte sekundäre Antikörper wurde von Jackson ImmunoResearch erhalten. Tumor-benachbartes Nierengewebe aus Nephrektomie-Proben wurde als normale Kontrolle verwendet. Repräsentative Bilder wurden mit einer Leica DFC 7000 T Kamera über die Software Leica Application Suite V4.7.1 aufgenommen.

Zellkultur

Humane Nieren 2 (HK-2)-Zellen, eine proximale tubuläre Epithelzelllinie der menschlichen Niere, wurden in DMEM (11885084, Gibco, USA) kultiviert, das mit 10 % fötalem Rinderserum (10099141 C, Gibco, USA) und 1 Prozent Penicillin/Streptomycin (10378016, Gibco, USA) bei 37 Grad mit 5 Prozent CO2. Hohe Glukose (30 mM D-Glucose, G8644, Sigma) [16] und TNF (40 ng/ml, 300–01A, PeproTech) [17] wurden verwendet, um HK-2-Zellverletzungen zu induzieren in-vitro. Disulfiram (DSL, 0,3 μM [18,19], NSC190940, Selleck), ein Porenbildungsinhibitor, wurde 3 Stunden vor der Induktion der HK-2-Zellverletzung zugegeben.

westlicher Fleck

Gesamtprotein wurde aus HK{{0}}-Zellen unter Verwendung von RIPA-Puffer (Sigma, R0278) extrahiert, und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Pierce BCA Protein Assay-Kits (Thermo Fisher Scientific, 23227) bestimmt. Als nächstes wurden denaturierte Proteine ​​durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und dann elektrisch auf Polyvinylidendifluorid-Membranen (Millipore, IPVH00010) übertragen. Die Membranen wurden 60 Minuten lang mit 5 % fettfreier Milch, gelöst in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,1 % Tween 20 (TBST) enthielt, blockiert. Die Blots wurden mit den folgenden relevanten primären Antikörpern über Nacht bei 4 Grad inkubiert: GSDMD (Abcam, ab209845, 1:1000), VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:2000) und Tubulin (ZSBio, TA-10, 1 :5000). Die Inkubation mit einer 1:1000-Verdünnung des HRP-konjugierten sekundären Antikörpers wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach fünf Waschgängen mit TBST wurden die Membranen mit dem Chemilumineszenzsubstrat (Millipore, WBKLS0100) für 5 Minuten inkubiert, und Bilder wurden unter Verwendung eines Image Quant LAS 4000 Mini-Systems (GE Healthcare) aufgenommen. Die halbquantitative Analyse wurde unter Verwendung der ImageJ-Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) durchgeführt.

RNA-Isolierung und RT-PCR-Analyse

Gesamt-RNA wurde aus HK-2-Zellen unter Verwendung eines RNAsimple-Gesamt-RNA-Kits (Tiangen, DP419) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert und unter Verwendung eines FastKing-RT-Kits (Tiangen, KR116) revers in cDNAs transkribiert. Quantitative PCR wurde unter Verwendung eines StepOne Real-Time PCR-Systems (Applied Biosystems, USA) mit zweistufigen Methoden durchgeführt. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in Tabelle S4 gezeigt. Die vergleichende Genexpression wurde unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode wie zuvor beschrieben berechnet.

statistische Analyse

Die Software GraphPad Prism 6.0 wurde für statistische Analysen verwendet, und die Daten sind als Mittelwerte ± SEM dargestellt. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde ein zweiseitiger ungepaarter t-Test angewendet. Unterschiede auf dem Niveau von P < 0,05="" wurden="" als="" statistisch="" signifikant="">

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Ergebnisse

Es häufen sich Beweise, die kürzlich gezeigt haben, dass die tubulointerstitielle Pathologie eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Progression von DKD spielt(Diabetische Nierenerkrankung). Ziel der Studie war es, die Charakteristika der DKD zu beschreiben(Diabetische Nierenerkrankung)Infiltration von tubulointerstitiellen Immunzellen und die Identifizierung einiger wichtiger Immun- und Entzündungsgene, um neue Einblicke in die Pathogenese und Therapie von DKD zu erhalten. In dieser Studie untersuchten wir das Profil der tubulointerstitiellen Immunzellinfiltration und identifizierten die Pyroptose als die Hauptform des programmierten Zelltods bei DKD(Diabetische Nierenerkrankung)mit bioinformatischer Analyse. VCAM1 wurde als das wichtigste immunbezogene Hub-Gen identifiziert und war positiv mit Pyroptose und infiltrierten Immunzellen korreliert. Darüber hinaus wurde bestätigt, dass die VCAM1-Expression in renalen tubulären Zellen, die unter diabetischen Bedingungen kultiviert wurden, erhöht ist. Das von der FDA zugelassene Medikament Disulfiram hemmte die Pyroptose der renalen Tubuluszellen und verringerte die VCAM1-Expression, die Spiegel von entzündlichen Zytokinen und die Fibrose in vitro.

1. Bioinformatik-Analyse-Workflows

Die wichtigsten Schritte des Arbeitsablaufs sind in Abbildung 1 dargestellt. Wir untersuchten zunächst die Immunzellinfiltration in tubulointerstitiellen Geweben von Patienten mit DKD(Diabetische Nierenerkrankung). Dann wurde Pyroptose, die Hauptform des Zelltods im Tubulointerstitium, unter Verwendung von GSEA und GSVA entdeckt. Als nächstes durchsuchten wir eine Liste von Genen, die eng mit der Infiltration von Immunzellen verwandt sind, und identifizierten Hub-Gene. Es wurde eine Korrelationsanalyse zwischen infiltrierten Immunzellen, Pyroptose und dem Top-Hub-Gen VCAM1 durchgeführt. Darüber hinaus wurden eine klinische Validierung und eine Immunfärbungsvalidierung von VCAM1 durchgeführt. Schließlich führten wir eine In-vitro-Studie durch, um die Ergebnisse der bioinformatischen Analyse zu validieren.

2. Dekonvolutionsanalysen des Immunsystems und der Stromazellen

Wir haben xCell verwendet, das anhand von Massen-Genexpressionsdaten Zelltyp-Anreicherungs-Scores generiert, um die Zelltypen zu bestimmen, die möglicherweise an tubulointerstitiellen Verletzungen beteiligt sinddiabetische Nierenerkrankung. Die Anreicherungswerte von 64 Zelltypen, einschließlich 34 Typen von Immunzellen und 30 Typen von Stroma- und anderen Zellen, wurden für jede Probe erhalten (Abbildung 2(a)). Die Heatmap von 34 Immunzellanreicherungswerten wurde dargestellt, um die Immunlandschaft der DKD zu identifizieren(Diabetische Nierenerkrankung)Tubulointerstitium (Abbildung 2(b)). Verglichen mit normalen Kontrollen war die Mehrheit der T-Zell-Anreicherungswerte bei Patienten mit DKD relativ höher(Diabetische Nierenerkrankung), außer CD4 plus Tcm, Tregs, Th1-Zellen, CD8 plus naive T-Zellen und NKT-Zellen. Die Anreicherungsscores von aDCs und cDCs waren bei Patienten mit DKD höher(Diabetische Nierenerkrankung)als bei den Kontrollen, während die Pro-B-Zell-Anreicherungswerte bei Patienten mit DKD niedriger waren. Die Anreicherungswerte der meisten Monozyten/Makrophagen- und Granulozyten-Untergruppen unterschieden sich nicht signifikant zwischen DKD(Diabetische Nierenerkrankung)und normale Gewebe, mit Ausnahme von M1-Makrophagen und Neutrophilen und Eosinophilen (Tabelle 1).

Abbildung 2. Immunzellinfiltrationsanalyse durch xCell im Tubulointerstitium von DKD(Diabetische Nierenerkrankung). (a) Vergleich der Zellwerte von 64 Zelltypen im Tubulointerstitium zwischen DKD und Kontrollnierengewebe im GSE30529-Datensatz. (b) Die zelluläre Landschaft der Immunmikroumgebung in DKD(Diabetische Nierenerkrankung). Die Heatmap repräsentiert den Zelltyp-Anreicherungswert jedes Immunzelltyps für alle Proben. DC, dendritische Zelle; Tcm, T-Zelle des zentralen Gedächtnisses; Tem, effektive Gedächtnis-T-Zelle; Tδ-Zelle, Gamma-Delta-T-Zelle.

3. GSVA und GSEA von Marken-Gensets

Wir führten GSVA und GSEA des Marken-Gensets im GSE30529-Datensatz durch, um die biologischen Prozesse in der DKD zu untersuchen(Diabetische Nierenerkrankung)Tubulointerstitium. Die Signalwege „Interferon-Alpha-Antwort“, „Interferon-Gamma-Antwort“ und „Komplement“ wurden bei der Pathogenese der tubulointerstitiellen Verletzung bei Patienten mit DKD signifikant aktiviert (Abbildung 3(a)), und eine Zusammenfassung der GSVA-Ergebnisse wird angezeigt in Tabelle S1. Dann führten wir GSEA der drei Gensätze durch und stellten fest, dass sie im Datensatz positiv angereichert waren. Die normalisierten Anreicherungswerte (NESs) waren 1,89, 1,89 und 1,7{{10}}, mit normalisierten p-Werten (NOM-p-Werten) von 0.000, 0,002 und 0,019, (Abbildung 3(bd)). Alle signifikant angereicherten Wege, die unter Verwendung von GSEA identifiziert wurden, sind in Tabelle 2 gezeigt. Diese Daten legen nahe, dass die tubulointerstitielle Immunantwort eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von DKD spielt(Diabetische Nierenerkrankung).

4. GSEA und GSVA von Gensätzen, die mit verschiedenen Formen des Zelltods assoziiert sind

Der Zelltod umfasst Pyroptose, Nekrose, Nekroptose, Apoptose, Ferroptose und Autophagie, die unterschiedliche pathophysiologische Mechanismen und Signalwege haben. Es wurde berichtet, dass verschiedene Formen des programmierten Zelltods mit Entzündungs- und Immunantworten in Zusammenhang stehen. Wir konstruierten Gensets verschiedener Arten des Zelltods aus GeneCards (Tabelle S2) und führten dann sowohl GSEA als auch GSVA durch, um die Beteiligung des Zelltods an der tubulointerstitiellen Entzündung bei Patienten mit DKD zu untersuchen(Diabetische Nierenerkrankung). GSEA zeigte, dass nur die Pyroptose-Gensätze bei Patienten mit DKD signifikant angereichert waren(Diabetische Nierenerkrankung)verglichen mit normalen Kontrollen (NES=1.65, FDR-q-Wert=0.023, FWER=0.013) (Abbildung 3(e)). Unterdessen war der GSVA-Score für Pyroptose der höchste unter allen verschiedenen analysierten Arten von Zelltod (Tabelle S3). Basierend auf diesem Ergebnis könnte Pyroptose eine Rolle in der Pathogenese von tubulointerstitiellen Verletzungen bei Patienten mit DKD spielen(Diabetische Nierenerkrankung).

Abbildung 3. Genset-Anreicherungsanalysen (GSEA) und Genset-Variationsanalysen (GSVA). (a) Balkendiagramm der GSVA-Ergebnisse von 50 Marken-Gensets. (b)-(d) GSEA-Ergebnisse von „Hallmark_-Interferon-Alpha-Antwort“, „Hallmark_-Interferon-Gamma-Antwort“ und „Hallmark-Komplement“. (e) GSEA-Ergebnis der Pyroptose.

5. Korrelation zwischen Pyroptose-Anreicherungswerten und Immunzellinfiltration

GSVA-Anreicherungswerte für Pyroptose wurden mit dem Anteil der Immunzellinfiltration korreliert, indem eine Korrelationsanalyse nach Pearson durchgeführt wurde, um die Korrelation zwischen Pyroptose und Infiltration von Immunzellen zu bewerten. Wir beobachteten eine signifikante Korrelation zwischen 15 Arten von Immunzellen und Pyroptose (Abbildung 4), was auf eine enge Wechselwirkung zwischen Immunzellen und Pyroptose hindeutet.

6. Entdeckung von Kerngenen

Eine differentielle Expressionsanalyse wurde durchgeführt, um die Beziehung zwischen tubulären Nierenzellen und interstitiellen Immunzellen weiter zu untersuchen. Zwischen dem DKD wurden 408 DEG identifiziert(Diabetische Nierenerkrankung)Gruppe und der Kontrollgruppe, von denen 65 herunterreguliert und 343 hochreguliert waren (Abbildung 5). Eine immunbezogene Genliste wurde heruntergeladen, um immunbezogene DEGs zu identifizieren, und 94 Naben-Immungene wurden aus zwei Datensätzen (DEGs und die immunbezogene Genliste) über ein Venn-Diagramm erfasst (Abbildung 6(a)). Die PPI-Analyse dieser vierundneunzig Hub-Immungene ergab 97 Knoten und 694 Interaktionen (Abbildung S1). Die durch den MCC-Algorithmus berechneten obersten 30 Knoten wurden als Hub-Gene identifiziert (Abbildung 6(b) und Tabelle 3). Dann wurde eine Anreicherungsanalyse von Hub-Genen durchgeführt. „Allograft-Abstoßung“, „Interferon-Gamma-Reaktion“, „Entzündungsreaktion“, „Interferon-Alpha-Reaktion“, „Epithel-Mesenchym-Übergang“ und „Komplement“ waren die am stärksten angereicherten Elemente in der Kennzeichenanalyse. „Rheumatoide Arthritis“, „Zytokin-Rezeptor-Interaktion“, „Toll-like-Rezeptor-Signalweg“, „Keuchhusten“ und „NF-kappa-B-Signalweg“ waren die am stärksten angereicherten KEGG-Begriffe. „Interferon-Gamma der zellulären Antwort“, „Chemokinaktivität“, „Leukozyten-Zell-Zell-Adhäsion“ und „Regulierung der Zytokinproduktion“ waren die am stärksten angereicherten GO-Begriffe (Abbildung 6(c)). Darüber hinaus identifizierte das MCODE-Bewertungssystem zwei Cluster mit einer Punktzahl größer oder gleich 5. PTRPC, TRIM22, PSMB8, KNG1 und CXCL6 waren Hub-Knoten mit höheren Knotengraden in Modul 1 (Abbildung 6(d)) und CD1C, EGF, FCER1G, CD3D und CD48 waren Hub-Knoten in Modul 2 (Abbildung 6(e)).

7. Korrelation zwischen VCAM1-Expression und infiltrierenden Immunzellen

Unter den identifizierten Hub-Genen wurde das am höchsten eingestufte Gen, VCAM1, als Immun-Hub-Gen bei DKD identifiziert(Diabetische Nierenerkrankung). Die VCAM1-Expression war bei Patienten mit DKD signifikant erhöht(Diabetische Nierenerkrankung)(Abbildung 7 (a)). Die Korrelationsanalyse ergab, dass die VCAM1-Expression positiv mit CD4 plus T-Zellen korreliert war (r=0.6877, P=0.0004), CD4 plus T-Gedächtniszellen (r=0.7102, P=0.0002), Th2-Zellen (r=0.7358, P < 0,0001),="" cd8="" plus="" tcm="" (r="" {{18="" }}.6026,="" p="0.0030)," t="" δ-zellen="" (r="0.5864," p="0.0041)," nk-zellen="" (r="0.5692," p="0.0057)," makrophagen="" (r="0.5068," p="0.0161)," m1-makrophagen="" (r="0.4441," p="0" .0384),="" adcs="" (r="0.4814," p="0.0233)" und="" cdcs="" (r="0.6562," p="0.0009)," aber="" negativ="" korreliert="" mit="" naiv="" cd8="" plus="" t-zellen="" (r="–0,4909," p="0,0204)" und="" nkt-zellen="" (r="–0,5548," p="0,0074)" (abbildung="" 7(b="">

8. Korrelation zwischen VCAM1-Expression und Pyroptose

Pearsons Korrelationsanalyse wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob die hochregulierte VCAM1-Expression im Tubulointerstitium von Patienten mit DKD(Diabetische Nierenerkrankung)hängt mit der Pyroptose zusammen. Die VCAM1-Expression war eng mit der Pyroptose verwandt (r=0.6118, P=0.0025) (Fig. 7(c)), was darauf hindeutet, dass die Pyroptose die VCAM1-Expression induzieren könnte.

9. Verifizierung, klinische Relevanz und Immunfluoreszenz-Validierung der VCAM1-Expression

Wir haben eine relevante Analyse von Patienten mit DKD durchgeführt(Diabetische Nierenerkrankung)vom ERCB, um die Änderung im VCAM1-Ausdruck im DKD zu validieren(Diabetische Nierenerkrankung)Tubulointerstitium. Konsequenterweise waren die VCAM1-mRNA-Spiegel bei Patienten mit DKD signifikant höher(Diabetische Nierenerkrankung)(Abbildung 8(a)). Die VCAM1-Expression korrelierte negativ mit der glomerulären Filtrationsrate (GFR) (r=− 0 0,5920, P=0 0,0123) (Abbildung 8(b)) und korrelierte positiv mit Serum Kreatininspiegel (r=0.5189, P=0.0328) (Abbildung 8(c)). Darüber hinaus führten wir eine Immunfluoreszenzfärbung für VCAM1 im Nierengewebe eines Patienten mit DKD durch(Diabetische Nierenerkrankung)und fanden heraus, dass die renale tubuläre VCAM1-Expression im Vergleich zu der in normalen Nieren signifikant hochreguliert war ( 8(d) ).

10. DSL hemmte HG-induzierte HK-2-Zellpyroptose, VCAM1-Expression und Entzündung

Wir haben kultivierte HK-2-Zellen 48 Stunden lang einer hohen Glukose (HG) und TNF- ausgesetzt, um die Beziehung zwischen tubulärer Zellpyroptose, VCAM1-Expression und der tubulointerstitiellen Immunantwort bei Personen mit DKD weiter zu bestimmen(Diabetische Nierenerkrankung). Da der Kern der zellulären Pyroptose die Membranporenbildung ist, die durch gespaltenes GSDMD induziert wird, haben wir die Niveaus der N-terminalen Domäne von GSDMD (GSDMD-NT) und VCAM1 mittels Western Blotting nachgewiesen. Sowohl HG als auch TNF – induzierten einen signifikanten Anstieg des GSDMD-NT-Spiegels, was auf das Auftreten von GSDMD-vermittelter Pyroptose hinweist ( 9(a) ). Die VCAM1-Expression war in den HG- und TNF-Gruppen statistisch signifikant erhöht (Fig. 9(b)). Disulfiram (DSL) ist ein wirksamer Inhibitor der GSDMD-Porenbildung [18]. Die Vorbehandlung mit DSL linderte den Anstieg der GSDMD-NT-Spiegel, was darauf hinweist, dass die Zellpyroptose unterdrückt wurde. Unterdessen war die VCAM1-Expression in den DSL-vorbehandelten HG- und TNF-Gruppen verringert (Fig. 9(ab)). Als nächstes wurde das inflammatorische Zytokinprofil mittels qPCR bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die hochregulierten Spiegel der MCP-1-, IL-1- und IL-18-mRNAs, die durch HG induziert wurden, nach der DSL-Vorbehandlung signifikant verringert waren. In der TNF-Gruppe sank der IL-1-Spiegel signifikant in der DSL-vorbehandelten Gruppe, und die MCP-1- und IL-18-Spiegel veränderten sich nicht signifikant. In keiner Gruppe wurden signifikante Veränderungen in den Spiegeln der IL-6- und IL-8-mRNAs gefunden. Wichtig ist, dass die TGF- 1-mRNA-Spiegel auch in den mit DSL vorbehandelten Gruppen verringert waren. Somit erhöhten pyroptotische tubuläre Zellen die VCAM1-Expression unter diabetischen Bedingungen, und eine Behandlung, die die Pyroptose aufhob, hemmte die VCAM1-Expression, Entzündung und Fibrose in HK-2-Zellen.

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