Teil 1: Carbamyliertes Sortilin im Zusammenhang mit kardiovaskulärer Verkalkung bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung

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Teil 1: Carbamyliertes Sortilin im Zusammenhang mit kardiovaskulärer Verkalkung bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung

Schlüsselwörter: chronisches Nierenleiden, Herz-Kreislauf, Niere

Übersetzungserklärung

Patienten mitchronisches Nierenleidensind sehr entwicklungsanfälligHerz-KreislaufErkrankung.Chronisches Nierenleiden-SpezifischHerz-KreislaufRisikofaktoren sind bisher weitgehend unbekannt. Wir zeigen, dass zirkulierendes Sortilin bei Patienten mit reduzierter posttranslationaler Carbamylierung modifiziert wirdNiereFunktion. Die Sortilin-Carbamylierung führt zu einer höheren Bindungsaffinität zu Interleukin-6 und fördert die Arterienverkalkung ex vivo. Darüber hinaus ist carbamyliertes Sortilin ein Risikofaktor für das Vorhandensein und Fortschreiten von Koronararterienverkalkung. Unsere Ergebnisse weisen auf carbamyliertes Sortilin als potenzielles therapeutisches Ziel für die Hemmung hinHerz-KreislaufVerkalkung bei Patienten mitchronisches Nierenleiden.

Einführung

Sortilin, ein intrazellulärer Sortierrezeptor, wurde als ein identifiziertHerz-KreislaufRisikofaktor in der Allgemeinbevölkerung. Patienten mitchronischNiereErkrankungsind sehr anfällig für kardiovaskuläre Komplikationen wie Verkalkung. Allerdings spezifischchronischNiereErkrankung-induzierte posttranslationale Proteinmodifikationen von Sortilin und ihre Verbindung zuHerz-KreislaufVerkalkungen bleiben unbekannt. Um dies zu untersuchen, haben wir zwei unabhängige untersuchtchronischNiereErkrankungKohorten für die Carbamylierung von zirkulierendem Sortilin und wiesen erhöhte carbamylierte Sortilin-Lysinreste in der extrazellulären Domäne von Sortilin nachNiereFunktionsabfall mit gezielter Massenspektrometrie. Die Strukturanalyse sagte eine veränderte Ligandenbindung durch carbamyliertes Sortilin voraus, was durch Bindungsstudien unter Verwendung von Oberflächenplasmonresonanzmessungen verifiziert wurde, die eine erhöhte Affinität von Interleukin 6 zu in vitro carbamyliertem Sortilin zeigten. Darüber hinaus erhöhte carbamyliertes Sortilin in vitro und ex vivo die Gefäßverkalkung, die durch Interleukin 6 beschleunigt wurde. Die massenspektrometrische Bildgebung menschlicher verkalkter Arterien zeigte in situ carbamyliertes Sortilin. Bei Patienten mitchronischNiereErkrankung, Sortilin-Carbamylierung war alters- und altersunabhängig mit Koronararterienverkalkung assoziiertNiereFunktion. Darüber hinaus zeigten Patienten mit carbamyliertem Sortilin das signifikant schnellere Fortschreiten der Koronararterienverkalkung als Patienten ohne Sortilin-Carbamylierung. Daher kann carbamyliertes Sortilin ein Risikofaktor für seinHerz-KreislaufVerkalkung und kann zu erhöhten beitragenHerz-KreislaufKomplikationen bei Patienten mitchronischNiereErkrankung.

Cistanchevermeiden kannchronischNiereErkrankung.

Etwa 1 von 10 Menschen weltweit erlebenchronischNiereErkrankung.1 BeeinträchtigtNiereFunktion ist ein wichtiger unabhängiger Risikofaktor fürHerz-KreislaufMorbidität und Mortalität und Gesamtmortalität.1,2 In der Tat, Patienten mitchronischNiereErkrankungsind viel wahrscheinlicher, an zu sterbenHerz-Kreislaufevents than to develop dialysis-requiring end-stage renal Q14 disease.3 The excess calcific mineral deposition within vascular tissue observed in chronischNiereErkrankungPatienten trägt vor allem zum Anstieg beiHerz-KreislaufRisiko.4chronischNiereErkrankungerleichtert die posttranslationale Modifikation (PTM) von Proteinen.5 PTMs wiederum wurden in Verbindung gebrachtHerz-KreislaufVerkalkung,6 was darauf hindeutet, dass ein besseres Verständnis von PTMs inchronischNiereErkrankung-induzierte Verkalkungsprozesse könnten neue therapeutische Angriffspunkte aufzeigen. Allerdings bisher spezifischchronischNiereErkrankung-assoziierte Proteinmodifikationen verknüpftHerz-KreislaufVerkalkung ist unbekannt.

Sortilin ist ein ubiquitär exprimiertes Mitglied der Familie der vakuolären Proteinsortierungsproteine ​​10 der intrazellulären Sortierungsrezeptoren.7 Es ist ein Single-Pass-Typ-I-Transmembranprotein mit verschiedenen Rollen bei der Proteinsortierung, dem Transport und der Zellsignalisierung. Als Endozytoserezeptor kann Sortilin die Internalisierung von Liganden von der Zelloberfläche über Endozytose auslösen und Liganden zwischen intrazellulären Kompartimenten wie Trans-Golgi-Netzwerk, Endosom, Lysosom und Sekretionsweg sortieren.8 Sortilin in der Pathogenese von Gefäß- und Stoffwechselerkrankungen durch Beiträge zur Arterienwandentzündung und -verkalkung, dysreguliertem Lipoproteinstoffwechsel und Typ-2-Diabetes mellitus, alleHerz-Kreislaufrisk factors.7 In human vascular smooth muscle cells (hSMCs), intracellular sortilin regulates the loading of the procalcific protein tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) into extracellular vesicles, thereby conferring the calcification potential that contributes to microcalcification formation.9 The ectodomain of plasma membrane-bound sortilin can be shed and secreted into the circulation.7 In a community-dwelling cohort of men aged >Vor 50 Jahren berichteten wir über eine Assoziation hoher Sortilin-Serumspiegel mit Aortenverkalkung undHerz-KreislaufEreignisse, was darauf hindeutet, sortilin als einHerz-KreislaufRisikofaktor in der allgemeinen Bevölkerung.10 Eine Rolle von Sortilin inchronischNiereErkrankung, eine Patientenpopulation mit einem deutlichen Anstieg vonHerz-KreislaufVerkalkung, entzieht sich weiterhin der Aufklärung. Die meisten Studien haben sich auf die Funktion von zellulärem Sortilin konzentriert, anstatt die biologische Funktion der zirkulierenden löslichen Form zu untersuchen.7 Daher wird ein besseres Verständnis der mechanistischen Beziehung zwischen zirkulierendem Sortilin und den regulatorischen Auswirkungen von PTM inchronischNiereErkrankungerweitert das Wissen über Sortilin inHerz-KreislaufVerkalkung.

Diese Studie hinterfragt die Hypothese, dass die PTM von zirkulierendem Sortilin an der Entwicklung von beteiligt istHerz-KreislaufVerkalkung bei Patienten mitchronischNiereErkrankung.

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METHODEN

Herz-Kreislaufund Nierenergebnis inchronischNiereErkrankung2–4 Patienten – Vierte Homburger Evaluationskohorte (CARE FOR HOME).

Die CARE FOR HOME-Studie wurde zuvor ausführlich beschrieben.11 Für die Analyse wurde eine Untergruppe von 97 Patienten verwendet.

Dan-NICAD 1 Kohorte

The study design of the Danish study of noninvasive testing in coronary artery disease (Dan-NICAD 1) trial has been described previously.12 For the analysis, we identified a subset of 97 enrolled patients with estimated glomerular filtration rate (eGFR) >60 ml/min und durchgeführte Frequenzabstimmung basierend auf Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index, Raucherstatus, Diabetes mellitus undHerz-KreislaufErkrankung. Die Identifizierung wurde verblindet für Sortilin-Spiegel durchgeführt.Herz-KreislaufIn-Depth Assessment (CARVIDA) Kohorte Die CARVIDA ist eine Teilstudie des DeutschenChronischNiereErkrankungStudie.13 Es wurden nur Proben von CARVIDA-Patienten verwendet, die in die Studie in Aachen, Deutschland, eingeschlossen waren (n ¼ 78). Die computertomografische Bildgebung wurde auf einem Dual-Source-CT-Scanner (SOMATOM Definition Flash oder Force; Siemens) wie zuvor beschrieben durchgeführt.14 Bei einer medianen Nachbeobachtungszeit von 4,4 Jahren stimmten 41 von 78 Patienten einer zweiten Computertomografie zu oder standen für diese zur Verfügung Scan beim zweiten CARVIDA-Besuch 2019/ Q15 2020.

statistische Analyse

Experimentelle Studiendaten sind als mittlere Standardabweichung dargestellt; n gibt die Anzahl der unabhängigen Experimente oder die Anzahl der Patienten an. Die Normalität wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test getestet, und Quantilplot und Varianzheterogenität wurden mit dem Brown-Forsythe-Test getestet. Ein gepaarter oder ungepaarter 2--schwänziger Student-t-Test mit gleichen oder ungleichen Varianzen wurde durchgeführt, um zwei Gruppen zu vergleichen. Zum Vergleich zwischen 3 Behandlungsgruppen wurde eine 1-- oder 2--Wege-Varianzanalyse, gefolgt von Tukey post hoc, für Daten mit normaler Verteilung und gleicher Varianz durchgeführt. Daten mit schiefer Verteilung wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test gefolgt vom Dunn-Post-Hoc-Test bewertet. Daten mit ungleichen Varianzen wurden durch Welch-Varianzanalyse, gefolgt von einem Dunnett-T3-Post-Hoc-Test, getestet.

In klinischen Studien werden kontinuierliche Daten als SD-Mittelwert bei Normalverteilung oder als Median und Interquartilbereich für Variablen mit schiefer Verteilung dargestellt. Kategoriale Daten werden in Prozent dargestellt. Der Pearson/Fisher-c2-Test wurde verwendet, um den Zusammenhang zwischen kategorialen Variablen und dem ungepaarten Student-t-Test oder dem Mann-Whitney-U-Test für kontinuierliche Variablen zu untersuchen. Unterschiede zwischen den 3 Gruppen wurden unter Verwendung einer 1--Weg-Varianzanalyse gefolgt von dem Sidak-Post-Hoc-Test verglichen. Least-Square-Mittelwerte, multivariat-angepasste Zahlen von carbamylierten Sortilin-Resten wurden unter Verwendung von verallgemeinerten linearen Modellen, wie zuvor beschrieben, berechnet.

Das Volumen der Koronararterienverkalkung (CAC) wurde log-transformiert (dh natürlicher Logarithmus, ln; ln[CAC plus 1]), um die Schiefe zu reduzieren. Die bivariate Korrelation wurde unter Verwendung von Eta (1 nominale Variable und 1 metrische Variable) oder Pearson-Korrelationskoeffizienten (wenn beide Variablen metrisch waren) bewertet. Die Veränderung des CAC-Volumens pro Jahr wurde wie folgt berechnet: [(CAC-Follow-up – CAC-Baseline) / Follow-up-Zeit in Monaten] * 12. Varianzanalyse mit Veränderung des CAC-Volumens als abhängige Variable und einem Term mit festem Effekt für die Carbamylierung (ja vs. nein) wurde für die Analyse der CAC-Progression verwendet. Darüber hinaus wurde dieses Modell durch die Verwendung einer Kovarianzanalyse für die Kovariaten CAC zu Q18-Basislinie und die Variablen angepasst. P < 0.05="" wurde="" als="" statistisch="" signifikant="" betrachtet.="" statistische="" analysen="" wurden="" mit="" graphpad="" prism="" (prism="" software="" inc.,="" version="" 9)="" oder="" spss="" (version="" 26.0)="">

Cistanchekann verbessernNiereFunktionen uchronischNiereErkrankung.

ERGEBNISSE

Carbamyliertes Sortilin steigt mit anNiereFunktionsabfall

Zunächst untersuchten wir die Sortilin-Serumspiegel bei Patienten mitchronischNiereErkrankungaus der CARE FOR HOME-Studie11 und fanden erhöhte Sortilin-Spiegel im Vergleich zu einer gematchten Kontrollgruppe mit normalen WertenNiereFunktion aus der Dan-NICAD 1-Studie (Tabelle 1). Zirkulierende Proteine ​​sind bei Patienten mit PTM anfälligchronischNiereErkrankungQ20 .5 Daher haben wir eine detaillierte Kartierung von PTM-Rückständen von zirkulierendem Sortilin bei Teilnehmern der CARE FOR HOME-Studie und gesunden Kontrollpersonen (Ergänzungstabelle S1) unter Verwendung von MALDI-TOF/TOF MS durchgeführt. Verglichen mit Kontrollpersonen,chronischNiereErkrankungPatienten hatten 8 der 30 Lysinreste, die überwiegend in der extrazellulären Domäne von Sortilin carbamyliert waren (Ergänzungstabelle S3 Q21 und Ergänzungsabbildung S1). Repräsentative MS-Spektren einer Kontrollperson und eines Patienten mitchronischNiereErkrankungsind in den Fig. 1a und b dargestellt. Die Spezifität des Signals wurde durch MALDI-TOF/TOF-MS/MS-Spektren gestützt (ergänzende Abbildung S2A). Die Quantifizierung ergab achronischNiereErkrankungstufenabhängiger Anstieg der Zahl der carbamylierten Reste (Abbildung 1c) und Intensität der carbamylierten Sortilin-Peptide (Abbildung 1d). Der Lysinrest 205 war insgesamt gleich modifiziertchronischNiereErkrankungStadien, während die Reste 95, 260 und 294 häufiger im fortgeschrittenen Stadium modifiziert wurdenchronischNiereErkrankungStufen (Abbildung 1e).

Als nächstes bewerteten wir Zusammenhänge zwischen der Sortilin-Carbamylierung und den Ausgangsmerkmalen (Ergänzungstabelle S2) in der CARE FOR HOME-Studie. Wir beobachteten eine altersabhängige Zunahme von Sortilin-Carbamylierungsresten (Tabelle 2). Niedrigere Nierenfunktion, basierend auf eGFR, basierend auf Serumcystatin c und Kreatinin (eGFRcys-Bereich), und höhere Harnstoff- und N-terminale pro-brain natriuretische Peptid (NT-proBNP)-Spiegel waren mit höheren carbamylierten Sortilin-Resten assoziiert (Tabelle 2). Die Assoziationen blieben nach Anpassung für Alter und Geschlecht signifikant (Tabelle 2).chronischNiereErkrankungPatienten unter Q22-Aldosteron-Antagonisten-Medikation zeigten eine reduzierte Sortilin-Carbamylierung (Tabelle 2), während es keinen Unterschied in der eGFRcys-Fläche gab (nein, 50.6 23,2 ml/min pro 1,73 m2; ja, 43,{{10}},9 ml/min pro 1,73 m2; P ¼ 0,236) und Harnstoff (nein, 68,6 40,1 mg/dl; ja, 72,{{21 }}0,9 mg/dl; P=0,729) zwischen Patienten mit oder ohne Aldosteronantagonisten. Neben Harnstoff kann Myeloperoxidase die Proteincarbamylierung vermittelnHerz-KreislaufKrankheit.19 Wir fanden jedoch keinen Zusammenhang zwischen den Gesamtspiegeln und der Aktivität von Myeloperoxidase und der Sortilin-Carbamylierung (ergänzende Abbildungen S3A und B).

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Darüber hinaus untersuchten wir das Vorhandensein von carbamyliertem Sortilin in menschlichen Femoralarterien mithilfe von MS-Bildgebung. Das carbamylierte Peptid SEDYGK*NFK* (m/z 1172) war in verkalkten Femoralarterien stark vorhandenchronischNiereErkrankungPatienten und fehlen in nicht verkalkten Femoralarterien (Abbildung 1f). MS/MS-Spektren unterstützten die Identifizierung von SEDYGK*NFK* (ergänzende Abbildung S2B). SEDYGK*NFK* befindet sich in der Nähe von verkalkten Bereichen in der Tunica media (Abbildung 1g). Im Gegensatz dazu war die Massensignalintensität des nicht-posttranslational modifizierten Peptids SEDYGKNFK (m/z 1086) in Kontrollarterien höher (Abbildung 1f).

Zusammengenommen verglichen mit Kontrollen mit normalNiereFunktion, Patienten mitchronischNiereErkrankunghaben höhere Sortilin-Serumspiegel und weisen posttranslational carbamyliertes Sortilin im Kreislauf auf, das auch in den Gefäßen nachweisbar ist.

Carbamyliertes Sortilin fördert die Verkalkung glatter Muskelzellen Aufgrund unseres Befundes, dass carbamyliertes Sortilin in verkalkten Bereichen lokalisiert ist, bewerteten wir als nächstes die Wirkung der Sortilin-Carbamylierung auf die Gefäßverkalkung in vitro und ex vivo. Um die funktionelle Relevanz der Sortilin-Carbamylierung zu bestimmen, induzierten wir die In-vitro-Carbamylierung von rekombinantem Sortilin (SortCarb) durch Harnstoff und stellten ein ähnliches Carbamyl-Lysin-Restmuster fest, wie es beim Menschen in vivo nachgewiesen wurde (ergänzende Abbildung S4A und ergänzende Tabelle S4). In vitro veränderte die Carbamylierung die Proteinintegrität von SortCarb im Vergleich zur Kontroll-Mock-Modifikation (SortCo) nicht, wie durch Gelelektrophorese und Western Blot festgestellt wurde (ergänzende Abbildung S4B und C). Weder SortCo noch SortCarb zeigten zytotoxische Wirkungen auf hSMCs (ergänzende Abbildung S5A). SortCo und SortCarb wurden gleichermaßen von hSMCs aufgenommen (ergänzende Abbildung S5B). Bei kalzifizierenden hSMCs induzierte SortCarb die proosteogenen Transkripte ALPL (þ56 Prozent; P ¼ 0.039) und RUNX2 Q23 (þ25 Prozent; P ¼ 0.014; Abbildung 2a und b ) sowie gewebeunspezifische Aktivität der alkalischen Phosphatase (þ46 Prozent; P=0,007; Abbildung 2c) im Vergleich zu SortCo. Auf funktioneller Ebene verstärkte SortCarb die Matrixverkalkung signifikant (Abbildung 2d und e). Schließlich erhöhte SortCarb in einem Ex-vivo-Organkulturmodell die Verkalkung in Aortenringen von Ratten (Abbildung 2f und g).

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