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Der auf das Nierenepithel gerichtete mitochondriale Transkriptionsfaktor A-Mangel führt zu einer fortschreitenden mitochondrialen Depletion im Zusammenhang mit der schweren zystischen Erkrankung--Teil I

Ken Ishi^1,2,11 et al

Abnorme mitochondriale Funktion ist ein bekanntes Merkmal von akuten und chronischen ErkrankungenNiere Krankheiten. Um einen Einblick in die Rolle der Mitochondrien zu gewinnenNiereHomöostase und Pathogenese zielten wir auf den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM), ein Protein, das für die mitochondriale DNA-Replikation und -Transkription erforderlich ist und eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Masse und Funktion spielt. Um die Folgen einer gestörten Mitochondrienfunktion zu untersuchenNiereEpithelzellen inaktivierten wir TFAM in Sinus oculis-verwandter Homöobox 2-exprimierendNiereVorläuferzellen. TFAM-Mangel führte zu einer signifikant verringerten mitochondrialen Genexpression, mitochondrialen Depletion, Hemmung der Nephronreifung und der Entwicklung einer schweren postnatalen zystischen Erkrankung, die zu einem vorzeitigen Tod führte. Dies war mit einer abnormalen mitochondrialen Morphologie, einer Verringerung des Sauerstoffverbrauchs und einem erhöhten glykolytischen Fluss verbunden. Darüber hinaus fanden wir, dass die TFAM-Expression in Mäusen und Menschen reduziert warpolyzystische Nieren, die von einer mitochondrialen Depletion begleitet wurde. Daher legen unsere Daten nahe, dass eine Dysregulation der TFAM-Expression und eine mitochondriale Verarmung molekulare Merkmale von sindNierezystische Erkrankung, die zu ihrer Pathogenese beitragen kann.

SCHLÜSSELWÖRTER: Glykolyse; Nierenentwicklung; Mitochondrien;polyzystische Nierenerkrankung; TFAM

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Übersetzungserklärung

Wir haben Mausgenetik verwendet, um die Rolle der mitochondrialen Dysfunktion zu verstehenNiereHomöostase. Die Inaktivierung des mitochondrialen Transkriptionsfaktors A (TFAM) in sine oculis-verwandten Homeobox-2-Epithel-Vorläuferzellen führte dazuNieren-Versagenwegen schwererpolyzystische Niere Erkrankung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine fortschreitende mitochondriale Dysfunktion mit einer fehlerhaften epithelialen Differenzierung verbunden ist undNieren-Zystogenese. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die TFAM-Expression und die Mitochondrienzahl beim Menschen reduziert warenpolyzystische NiereGewebe. Unsere Studien deuten darauf hin, dass therapeutische Strategien, die auf die Verbesserung der mitochondrialen Gesundheit abzielen, bei der Behandlung von Patienten mit autosomal-dominanter Dominanz von Vorteil sein könnenpolyzystische NiereErkrankung.

Mitochondriale (mt) Dysfunktion ist ein allgemein bekanntes pathologisches MerkmalNiere Krankheitenund kann zelluläre Verletzungen, Entzündungen und Fibrose auslösen.1 In derNieresind tubuläre Epithelzellen in hohem Maße von Adenosintriphosphat (ATP) abhängig, das durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) erzeugt wird, da sie mehrere energieverbrauchende epitheliale Transportfunktionen erfüllen. Daher ist die Aufrechterhaltung einer effizienten mt-ATP-Produktion für die normale Nierenfunktion und die systemische Elektrolythomöostase unerlässlich. Darüber hinaus deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Genregulation, der zellulären Signalübertragung und der Zelldifferenzierung über die Erzeugung von intermediären Metaboliten und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) spielenNiereKrankheitenist nicht gut verstanden.

Zur Untersuchung der mt-Funktion inNieren-Homöostase und Pathogenese zielten wir auf den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM). TFAM ist ein nukleär codierter Faktor, der für die mt-Funktion, die Aufrechterhaltung der mt-Kopienzahl und die strukturelle Stabilität der mt-DNA wesentlich ist, da es die Replikation und Transkription des mt-Genoms durch Biegen der Promotor-DNA reguliert.3,4 Die mt-DNA von Säugetieren enthält 37 Gene, 13 davon kodieren Proteinuntereinheiten des Atmungskettenkomplexes, 22 kodieren Transfer-RNAs und 2 ribosomale RNAs.3 Somit ist TFAM direkt an der Regulation des mt-Elektronentransports und der ATP-Synthese über die Transkription von Genen wie dem mitochondrialen Cytochrom b ( MT-CYB), die mitochondrial kodierte Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit 1 (MT-CO1) und die mitochondrial kodierte ATP-Synthase-Membranuntereinheit 6 (MTATP6).3,5 Ohne TFAM verlieren Zellen ihre Fähigkeit, ATP über OXPHOS zu produzieren, können keine signifikanten Mengen an mt erzeugen ROS, und werden zunehmend von Mitochondrien erschöpft.6–9 Genetische Studien haben gezeigt, dass TFAM für eine normale Embryogenese unerlässlich ist, da eine globale homozygote Tfam-Inaktivierung zu einer Intrauterinbildung führte Letalität bis Embryonaltag 10,5, während heterozygoter Mangel, obwohl er die mt-Kopienzahl um ~40 Prozent reduzierte und zu einem Mangel an Atmungsketten führte, nicht zu embryonaler Letalität führte.6 Daher ist das genetische Targeting von TFAM eine nützliche experimentelle Strategie zur Untersuchung der Rolle der fortschreitenden mt-Dysfunktion in der zellulären Differenzierung und Gewebehomöostase. Die zelltypspezifische bedingte Inaktivierung von Tfam legt nahe, dass die Bildung von OXPHOS und/oder mt ROS für die Zelldifferenzierung, Funktion und normale Physiologie entscheidend ist.6–10

Primäre mt-Erkrankungen aufgrund von Kern- oder mt-Genmutationen können auftretenNiere Erkrankungmanifestiert sich am häufigsten als tubulointerstitielle Verletzung oder isolierte tubuläre Dysfunktion.11,12 Obwohl sie an der Pathogenese bestimmter menschlicher Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind,13 verursachen spezifische Mutationen in TFAMNieren-Krankheit wurde nicht gemeldet. In jüngerer Zeit wurde eine reduzierte TFAM-Expression mit einer chronischen Erkrankung in Verbindung gebrachtNiereErkrankung. Der Verlust der mt-Integrität aufgrund einer Tfam-Inaktivierung verursachte eine tubulointerstitielle Erkrankung undNieren- Versagenbei Mäusen, was teilweise auf die Aktivierung von mt-DNA-Stress-induzierter zyklischer GMP-AMP-Synthase (cGAS) – Stimulator von Interferon-Genen (STING) – abhängigen Entzündungsreaktionen zurückzuführen war.14

Hier berichten wir, dass Mäuse mit bedingter Tfam-Inaktivierung in Sinus-Okulis-bezogenen Homöobox 2 (SIX2)-exprimierenden Nephron-Vorläuferzellen15 eine schwere zystische Erkrankung entwickeln und vorzeitig daran sterbenNieren-Versagenals junge juvenile Mäuse.Tfam^-/- Mäuse waren durch Defekte in der Nephronreifung gekennzeichnet, die mit mt-Verarmung, einer Verringerung von OXPHOS und einer metabolischen Verschiebung in Richtung Glykolyse einhergingenTfam^-/- Nieren-Epithel. Angesichts der Schwere der zystischen Erkrankung inTfam^-/- Mäuse, analysierten wir 2 Mausmodelle vonpolyzystische NiereErkrankung(PKD), die aus Mutationen entweder in Polycystin-1 (PKD(polyzystische Nierenerkrankung)1) oder Cystin-1 (Cys1), sowie menschliches Gewebe von Patienten mit autosomal dominanter polyzystischer Nierenerkrankung (ADPKD). Das stellen wir festTfam^-/- ist in Zysten sowohl von muriner als auch menschlicher PKD fehlreguliert(polyzystische Nierenerkrankung), Gewebe. Zusammengenommen legen unsere Studien nahe, dass TFAM-Dysregulation und mt-Mangel charakteristische Merkmale von sindNieren-zystische Erkrankungen und können eine beitragende Rolle in ihrer Pathogenese spielen.

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ERGEBNISSE

Die Tfam-Inaktivierung in Zellen der SIX2-Linie verursacht eine schwere zystische Erkrankung, die zu einerNieren-VersagenUm die mt-Funktion in der zu untersuchenNieren-Epithel inaktivierten wir Tfam in SIX2--exprimierenden Vorläuferzellen, aus denen alle Nephronsegmente mit Ausnahme des Sammelrohrs (CD) hervorgehen.15 Dafür kreuzten wir das Tfam-floxed-Allel mit bakteriellen künstlichen chromosomentransgenen Mäusen, die exprimieren ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein/Cre-Rekombinase-Fusionsprotein (eGFP/Cre) unter Transkriptionskontrolle des Six2-Promotors (Abbildung 1a).16 Mäuse, die homozygot für das Tfam-floxed-Allel und heterozygot für das eGFP/Cre-Transgen sind (Sechs2-eGFP/Cretg/^{tg plus}; Tfam^fl/fl) wird ab hier als Six2- bezeichnetTfam^-/- Mutanten. Sechs2-Tfam^-/- Die Mäuse wurden mit den erwarteten Mendelschen Verhältnissen geboren und waren bei der Geburt durch visuelle Untersuchung nicht von den Cre-Wurfgeschwister-Kontrollen zu unterscheiden. Unterschiede im Körpergewicht zwischen Six2-Tfam^-/- Mutanten und Cre-Wurfgeschwisterkontrollen wurden am postnatalen Tag (P) 14 sichtbar (5,7 plus -0,3 g für Mutanten vs. 7,5 plus -0,3 g für Kontrollen, jeweils n=4, P =0.004; Ergänzungstabelle S1). Sechs2-Tfam^-/- mutierte Mäuse wurden durch vergrößert gekennzeichnetNierenverglichen mit Kontrollen (Niere/Körpergewichtsverhältnis von 1,45 Prozent plus -0,19 Prozent für Mutanten vs. 0,60 Prozent plus - 0,02 Prozent für die Kontrolle, n {{8} } jeweils, P < 0,001;="" abbildung="" 1b,="" ergänzungstabelle="" s1)="" und="" starb="" im="" alter="" zwischen="" p20="" und="" p30="" (abbildung="" 1b).="" juvenile="" letalität="" in="" der="" mutantenkohorte="" wurde="" damit="" in="" verbindung="">Nieren-Versagenvon schwerer zystischer Erkrankung mit Blut-Harnstoff-Stickstoffspiegeln von 68,40 plus -5,32 mg/dl für mutierte Mäuse gegenüber 16,8 2,0 mg/dl für Kontrollen ( n= 6 bzw. 7; P < 0.0001;="" abbildung="" 1b="" und="" c).="" darüber="" hinaus="" entwickelten="" six2-tfam/mutanten="" eine="" signifikante="" albuminurie="" (urin-albumin/kreatinin-verhältnis="" 43,58="" plus="" -362,475,18="" mg/g="" bei="" six2-tfam/mutanten="" vs.="" 3,39="" mg/g="" bei="" kontrollen).="" bei="" p14,="" n="6" bzw.="" 10;="" p="">< 0,0001).="" dies="" stimmt="" mit="" dem="" expressionsmuster="" der="" cre-rekombinase="" in="" six2-nephron-vorläuferzellen="" überein,="" die="" zu="" cap-mesenchym-abgeleiteten="" zellen="">Nieren-Tubuli und Podozyten.15 Im Gegensatz zu Six2-Tfam^-/- Mutanten, Mäuse mit heterozygotem Tfam-Mangel in SIX2-Vorläuferzellen, entwickelten sich normal, waren fruchtbar und entwickelten sich nicht offenkundigNiereErkrankung(Ergänzende Abbildung S1).

Abbildung 1|Tfam-Inaktivierung in Zellen der SIX2-Linie führt zu schwerer zystischer Erkrankung und Nierenversagen. (a) Ein Schema, das den experimentellen Ansatz und die Lokalisierung von Zielsequenzen innerhalb des Tfam-floxed-Allels veranschaulicht. Polymerase-Kettenreaktionsanalyse der gesamten genomischen Nieren-DNA, isoliert aus der Kontrolle des Wurfgeschwisters (Cre) und Six2-Tfam^-/-Mäuse im Alter von postnatalem Tag (P) 7; das nicht rekombinierende Tfam-floxed-Allel wird mit 2-lox (2) bezeichnet; das rekombinierte Allel von 1-lox, das Wildtyp-Allel von wt; þ oder - zeigen das Vorhandensein oder Fehlen des Six2-eGFP/Cre-Transgens an. (b) Linke Tafeln, Fotos von Nieren aus der Cre-Kontrolle und Six2-Tfam^-/- Mäuse im Alter P20. Nierengewichte (KWs) werden als Prozentsatz des Körpergewichts (BW) ausgedrückt (n= 4–14). Rechte Felder, Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN)-Spiegel bei Cre-Wurfgeschwister-Kontrolle (co) und Six2-Tfam^-/-Mäuse im Alter von P7 (n=7 bzw. 6) und Kaplan-Meier-Überlebenskurven für Cre-Kontrolle und Six2-Tfam^-/- Mäuse im Vergleich zum Log-Rank-Test (n=10–13). (c) Repräsentative Bilder von Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Nierenschnitten von Cre-Kontrolle und Six2-Tfam^-/-Mäuse im Alter von P7 und P29 wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt und durch Immunhistochemie auf a-Glattmuskel-Aktin (ACTA2) und Cluster-Differenzierung (CD)-Antigen 31 analysiert. Zahlenzeichen zeigen zystische Strukturen und Sternchen zeigen Glomeruli. Balken ¼ 1 mm für Querschnitte ganzer Nieren, 100 mm für Hochleistungs-H&E-Bilder und 50 mm für IHC-Bilder. Die Daten sind als Mittelwert plus - SEM ausgedrückt und wurden mit dem 2-tailed Student's t-Test analysiert. ***P < 0,001.="" um="" die="" anzeige="" dieses="" bildes="" zu="" optimieren,="" lesen="" sie="" bitte="" die="" online-version="" dieses="" artikels="" unter="">

Die Analyse von Six2-Tfam^-/- Mäuse, die auch das ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP-Cre-Reporterallel, hier als Six2-mT/mG bezeichnet, exprimierten;Tfam^-/- Mäuse, was darauf hinweist, dass die überwiegende Mehrheit der zystischen Strukturen inTfam^-/- Nieren wurden aus Zellen mit einer Vorgeschichte von Six2-eGFP/Cre-Expression gewonnen (ergänzende Abbildung S2). Zysten in sechs2-Tfam^-/- Nierenzeigten Hinweise auf eine Proliferation, wie durch das Vorhandensein von Ki67--positiven Epithelzellen der Zystenauskleidung (im Durchschnitt w40 Prozent aller Epithelzellen der Zystenauskleidung) gezeigt wurde, während Zellen, die für gespaltene Caspase 3 positiv waren, innerhalb der Zysten nicht nachgewiesen wurden (ergänzende Abbildung S3 ). Diese Befunde stimmen mit erhöhten phosphorylierten extrazellulären signalregulierten Kinase- (p-ERK) und b-Catenin-Spiegeln in Six2- überein.Tfam^-/- Nierengewebe (ergänzende Abbildung S3). Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass Six2-Tfam^-/- Nieren weisen molekulare Merkmale auf, die häufig mit assoziiert sindNieren-zystische Erkrankungen.

Abbildung 3 |Tfam^-/-Zysten exprimieren keine gemeinsamen nephronsegmentspezifischen Marker. (a) Repräsentative Bilder von Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Nierenschnitten von Six2-mT/mG;Tfam^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50mm. (b) Repräsentative Bilder von Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Nierenschnitten von Six2-mT/mG;Tfam^-/-Mäuse im Alter von P14, gefärbt auf eGFP und Uromodulin durch IF. Sternchen zeigen Zysten mit intraluminalem Uromodulin. Das Vorhandensein von intraluminalem Uromodulin wurde in Zysten mit einem maximalen Durchmesser von entweder 50–100 untersuchtμm oder bei Zysten mit einem maximalen Durchmesser von mehr als 100 mm. Stangen=(a,b) 100 mm. Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels unterwww.kidney-international.org.

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Die Nephron-Reifung ist in Six2-Tfam defekt^-/-Mäuse

Da es bis zu mehreren Wochen dauern kann, bis Mäuse mit gewebespezifischer Tfam-Inaktivierung eine Pathologie entwickeln,17 untersuchten wir als nächstes den Zeitverlauf vonNieren-Krankheitsentwicklung in Six2-Tfam^-/-Mäuse. Wir sammelten Nieren von Kontroll- und Mutantenmäusen im Alter von P0, P7 und P14 und verwendeten histologische Methoden, Immunfluoreszenz (IF)-Färbung und Genexpressionsanalyse im GanzenNiereAuszüge zur Bewertung. IF-Färbung für SIX2 und E-Cadherin im Alter von P0 zeigte, dass die Nieren von Kontroll- und Six2-Tfam^-/-waren histologisch ähnlich. Die Bildung von kortikalen nephrogenen Zonenstrukturen wie SIX2þ-Kappen-Mesenchym, E-Cadherin– exprimierende Harnleiterspitzen und entstehende Nephronstrukturen wie zNieren-Vesikel und komma- und S-förmige Körper wurden in Six2- nicht blockiertTfam^-/-Nieren (Abbildung 2a). Diese histologischen Befunde stimmten mit den Expressionsniveaus von Genen überein, die nephrogene Marker codieren. Die mRNA-Spiegel von Six2, Paired Box 2 (Pax2), LIM Homeobox Protein 1 (Lhx1) und Spalt-like Transcription Factor 1 (Sall1) unterschieden sich nicht signifikant zwischen Kontrolle und Six2-Tfam^-/- Mäuse insgesamtNiereHomogenate von P0Nieren(Abbildung 2b). Dies legt nahe, dass die TFAM-Inaktivierung in SIX2-Nephron-Vorläufern die Bildung nephrogener Strukturen nicht signifikant beeinflusst.

Obwohl die Bildung der entstehenden Nephronstruktur nicht gehemmt wurde, deutete die Färbung mit Alcianblau/Periodsäure-Schiff und Lotus-Tetragonolobus-Lektin auf eine defekte terminale Nephronreifung in Six2- hin.Tfam^-/-Mäuse im Alter von P{{0}}. Alcianblau/Periodsäure-Schiff, das tubuläre Basalmembranen und Bürstensaum färbt, und Lotus-Tetragonolobus-Lektin, das spezifische Oligosaccharide im Bürstensaum proximaler Tubuluszellen identifiziert, waren beide in mutierten Nieren verringert. Abbildung 2c zeigt Alcianblau/Periodsäure-Schiff-Färbung zu den Zeitpunkten P0, P7 und P14. Lotus Tetragonolobus Lektin-Histochemie und IF-Färbung für das Wilms-Tumor-1-Protein zu den Zeitpunkten P{{10}}, P7 und P14 sind in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellt. Im Alter P0 betrug die relative Fläche, die mit Lotus-Tetragonolobus-Lektin positiv gefärbt wurde, 2,1 0 Prozent, 0,51 Prozent und {{30}},39 Prozent 0,1 Prozent im Alter P7 versus 6,25 Prozent 0,28 Prozent und 6,2 Prozent 1,1 Prozent für Kontrollen (n=3–4, P=0,0004 bzw. 0,0007; ergänzende Abbildung S4). Im Einklang mit diesen histologischen Befunden steht die signifikante Abnahme der Expression von Genen, die für die glomerulären und Nephronsegment-spezifischen Marker Podocin, Nephrin, Aquaporin 1 (Aqp1), Natriumphosphat-Cotransporter 2a (NaPi2a), Uromodulin, Natrium-Kaliumchlorid-Cotransporter 2 ( Nkcc2) und Thiazid-sensitiver Natriumchlorid-Cotransporter (Ncc) in Six2-Tfam^-/-Mäuse (Abbildung 2b). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass Six2-Tfam^-/- Nierenzeigen eine fortschreitende Verringerung der Anzahl reifer proximaler Nephronsegmente und Glomeruli.

Da Six2-eGFP/Cre-Aktivität zu TFAM-defizienten Cap-Mesenchym-abgeleiteten Nephronsegmenten führt, sagten wir voraus, dass die Reifung von CD-Epithelzellen, die aus Harnleiterknospen stammen, in Six{{2} nicht beeinträchtigt würde. }Tfam^-/-Nieren. In Übereinstimmung mit dieser Vorstellung ist, dass die Färbung mit Dolichos-biflorus-Agglutinin, das mit N-Acetyl-D-galactose im distalen Tubulus und CD reagiert, auf eine relative Überrepräsentation von Dolichos-biflorus-Agglutinin-positiven Strukturen in Six2- hinweist.Tfam^-/-Nieren. Im Alter von P7 umfassten positiv gefärbte Bereiche für Dolichos biflorus Agglutinin 13,91 Prozent 0,9 Prozent der Gesamtfläche für Mutanten gegenüber 1,93 Prozent 0,1 Prozent für die Kontrolle (n ¼ 3, P ¼ { {10}}.0002; Ergänzende Abbildung S4). Die mRNA-Expression der Alpha-Untereinheit 1 des Natriumkanals (Scnn1a) oder Aquaporin 2 (Aqp2), die beide in CD-Epithelzellen exprimiert werden, war im Vergleich zur Kontrolle nicht signifikant verringert (Abbildung 2b). Im Gegensatz zu Six2-Tfam^-/-Nieren, Tfam-Inaktivierung in Homöobox B7 (HOXB7)-Vorläuferzellen, die zu CD-Epithelzellen führen, was zum Verlust der CD-Nephron-Marker-Expression und einer leichten tubulären Dilatation, aber nicht zur Zystogenese führt (ergänzende Abbildung S5). Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass der Verlust der TFAM-Funktion in SIX2-Vorläuferzellen nicht die Entwicklung entstehender Nephronstrukturen blockiert, sondern die terminale Nephronreifung hemmt.

Tfam^-/-Zysten weisen einen Mangel an gemeinsamen Nephronsegmentmarkern auf

Um den histogenetischen Ursprung von zu charakterisierenTfam^-/- Nieren-Zysten, bei denen wir IF-Analysen durchführtenTfam^-/- Nierenat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 mm waren durch intraluminale Ablagerungen von Uromodulin gekennzeichnet, was auf einen Ursprung von Nephronsegmenten distal zum proximalen Tubulus und der absteigenden Henle-Schleife hindeutete (Abbildung 3b).

Fortschreitende Anomalien in der mt-Funktion und -Morphologie inTfam^-/- Epithelzellen

Um den zeitlichen Verlauf der metabolischen Folgen der Tfam-Deletion zu charakterisieren, untersuchten wir zunächst die mRNA-Spiegel von Tfam und TFAM-reguliertem mt-Co1, mt-Cyb und mt-Atp6 inTfam^-/- Nierenim Alter P0, P7 und P14. Wie erwartet waren die mRNA-Spiegel von Tfam, mt-Co1, mt-Cyb und mt-Atp6 signifikant reduziert (Abbildung 4a).Tfam^-/-Epithelzellen, die mit eGFP (Sechs {{0}} mT/mG; Tfam/Mäuse) markiert waren, zeigten eine signifikante Verringerung der MT-CO1-Proteinexpression (ergänzende Abbildung S7). Die Anzahl der mt-DNA-Kopien wurde um 63 Prozent reduziert, was mit einer mt-Verarmung übereinstimmt, einem Kennzeichen von TFAM-Mangel (Abbildung 4a). Im Gegensatz dazu war die Expression von Kerngenen, die Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid codieren: Ubichinon-Oxidoreduktase-Kernuntereinheit 3 ​​(Ndufs3) und Succinat-Dehydrogenase-Komplex-Flavoprotein-Untereinheit A (Sdha) im Alter P0 nicht betroffen, war aber im Alter P7 und P14 reduziert (Abbildung 4a). Diese Befunde aus der mt-Gen- und Proteinanalyse stimmen mit dem fortschreitenden Verlust der mt-Kopienzahl in Tfam/Epithel überein.

Als nächstes untersuchten wir die metabolischen Wirkungen der Tfam-Inaktivierung in primären Epithelzellen des proximalen Tubulus (PTECs), die im Alter von P7 isoliert wurden.Tfam^-/- PTECs zeigten signifikante Verringerungen der basalen Sauerstoffverbrauchsraten (40,77 4,10 für Mutanten vs. 61,75 5,18 pmol/min/104 Zellen für Kontrollen, jeweils n=3, P =0.034), ATP-gebundene Atmung (33.11 3.91 für Mutanten vs. 46.92 4.91 pmol/min/104 Zellen für Kontrollen, n{{18} } jeweils P=0,093), maximale Atmung (116,8 14,19 für Mutanten vs. 225,5 13,55 pmol/min/104 Zellen für Kontrollen, n{{ 28}} jeweils P=0.005) und freie Atemkapazität (76.05 10.18 für Mutanten gegenüber 163.7 8.61 pmol/min/104 Zellen für Kontrollen , n =3 jeweils, P=0.003; Abbildung 4b).

Um den Grad der mt-Erschöpfung und -Schädigung weiter zu charakterisieren, untersuchten wirTfam^-/- Nierendurch Transmissionselektronenmikroskopie und {{0}}dimensionale strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (3D SIM). Im Alter von P7 zeigten die Mitochondrien unregelmäßige Formen und Ballonbildung, was mit früheren Ergebnissen bei Tfam-Knockout-Mäusen übereinstimmt. Transmissionselektronenmikroskopische Analysen zeigten, dass strukturelle Anomalien der Mitochondrien, wie erhöhte Größe und abnormale Cristae, postnatal fortschritten, da die morphologischen Unterschiede zwischen Mutanten und der Kontrolle im Alter P{0 weniger offensichtlich waren und mit zunehmendem Alter schwerwiegender wurden (Abbildung 4c ). 3D-SIM wurde verwendet, um das mt-Volumen und die Netzwerkgröße in sechs 2- mT/mG zu untersuchen; Tfam/Mutanten verglichen mit Six2-mT/mG-Kontrollmäusen im Alter von P7; Das mt-Volumen wurde in Querschnitten von 5 bis 8 Tubuli pro Abschnitt gemessen, wobei 25 bis 4 0 eGFP-positive kortikale Epithelzellen untersucht wurden, die durch IF-Färbung auf spannungsabhängigen anionenselektiven Kanal 1 gefärbt wurden. Wir fanden heraus, dass das gesamte mt-Volumen pro eGFP-positiver Zelle signifikant verringert war (62,66 16,46 mm3/Zelle für Mutanten gegenüber 177,4 30,17 mm3/Zelle für Kontrollen, jeweils n ¼ 3). , P ¼ 0.0289) und war mit einer Änderung des Verhältnisses des gesamten mt-Volumens zum gesamten Zellvolumen von 0,230 0,01 in den Kontrollen auf 0,{{ 33}}.016 in Six2-Tfam / Mutanten (je n ¼ 3, P ¼ 0,0017; Abbildung 4c). Die maximale mt-Netzwerkgröße, die das größte mt-Netzwerk misst, das in allen untersuchten eGFP-positiven Zellen gefunden wurde, wurde in Six verringert2-Tfam^-/- Nieren(143,2 23,2 mm3 für Mutanten vs. 318,3 49,45 mm3 für Kontrollen, jeweils n ¼ 3, P ¼ 0,0327). Zusammengenommen stimmen ultrastrukturelle und SIM-Befunde sowie die Befunde aus der mt-Gen- und Proteinanalyse mit dem fortschreitenden Verlust der mt-Kopienzahl in übereinTfam^-/- Epithel.

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TFAM-Mangel verschiebt den Stoffwechsel des Nierenepithels in Richtung Glykolyse

PTECs in derNiereverwenden Fettsäure-b-Oxidation und OXPHOS für die ATP-Erzeugung und sind gluconeogenetisch.18 Um zusätzliche Einblicke in metabolische Veränderungen im Zusammenhang mit der Tfam-Inaktivierung zu gewinnen, führten wir eine RNA-Sequenzanalyse von durchNierenab sechs2-Tfam^-/-und Cre-Wurfgeschwister-Kontrollmäuse im Alter von P7. Wir fanden heraus, dass wichtige regulatorische Gene, die an der Glykolyse beteiligt sind, wie Hexokinase 2 (Hk2) und Enolase 2 (Eno2), hochreguliert waren. Im Gegensatz dazu war die Expression der meisten am Tricarbonsäurezyklus beteiligten Gene verringert (z. B. Isocitratdehydrogenase 1 [Idh1]), ebenso wie die Expression von Genen, die an der Fettsäure-b-Oxidation beteiligt sind, wie z. B. Acetyl-Coenzym A-Acyltransferase 1B ( Acaa1b), mittelkettige Acyl-Coenzym-A-Dehydrogenase (Acadm) (Abbildung 5a und b, ergänzende Abbildung S8). In Übereinstimmung mit der verringerten Expression von Genen, die an der Oxidationsgene des Tricarbonsäurezyklus beteiligt sind, war die Akkumulation von neutralen Lipiden, wie durch Ölrot-O-Färbung in Gefriergut nachgewiesen wurdeNiereAbschnitte im Alter von P14 (Abbildung 5c).

Eine verringerte TFAM-Expression in murinen und humanen PKD-Geweben ist mit einer mt-Depletion verbunden

Weil Sechs2-Tfam^-/- Nierenhatte eine starke Ähnlichkeit mit PKD(polyzystische Nierenerkrankung) Nierenuntersuchten wir als nächstes, ob TFAM bei PKD fehlreguliert war(polyzystische Nierenerkrankung)Gewebe. Wir untersuchten zunächst TFAM und TFAM-regulierte Genexpression in 2 gut etablierten genetischen PKD-Mausmodellen. Die Tfam-mRNA-Spiegel waren in Vollnieren-Homogenaten von Pkd signifikant reduziert^-/- und Cys^cpk/cpkMäuse, die Mutationen in entweder PKD1 tragen(polyzystische Nierenerkrankung)oder Cys1. Dies war mit einer Abnahme der Expression von mitochondrialen und nuklear kodierten mt-Genen sowie einer fehlregulierten glykolytischen Genexpression verbunden. Ähnlich wie Sechs2-Tfam^-/-Nieren, PKD(polyzystische Nierenerkrankung)^-/- und Cys^cpk/cpk Nierenwaren durch erhöhte Eno2- und Hk2- und signifikant erniedrigte Phosphoglyceratkinase (Pgk) 1-, Pyruvatdehydrogenasekinase (Pdk) 1- und Pdk4-Transkriptspiegel gekennzeichnet (Abbildung 6a). Die TFAM-Proteinexpression, wie durch IF-Färbung beurteilt, war in Epithelzellen der Zystenauskleidung im Vergleich zu Epithelzellen aus benachbarten nichtzystischen Tubuli verringert (Abbildung 6b). Dies war mit einer reduzierten mt-Co1- und mt-Atp6-Expression durch RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung verbunden (Abbildung 6b, ergänzende Abbildung S9); Das mt-Volumen, wie durch 3D-SIM bestimmt, war um 55 Prozent reduziert, verglichen mit entweder Epithelzellen aus benachbarten, nicht zystischen Tubuli oder PTECs aus der normalen KontrolleNieren. Unterschiede im mt-Volumen zwischen normalen Kontroll-PTECs und PTECs aus nichtzystischen Tubuli wurden nicht gefunden (Abbildung 6c).

Es sollte untersucht werden, ob der Verlust der TFAM-Expression ein gemeinsames molekulares Merkmal der menschlichen PKD ist(polyzystische Nierenerkrankung)analysierten wir Nephrektomieproben von 5 ADPKD-Patienten durch Immunhistochemie, IF-Färbung, RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und 3D-SIM. Eine reduzierte TFAM-Expression wurde bei 75,2 % plus -7,5 % beobachtetNieren-Zysten durch Immunhistochemie analysiert. Dies war mit einer verringerten Expression von MT-CO1 und MT-ATP6 durch RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung verbunden (Abbildung 7a, ergänzende Abbildung S10); Das mt-Volumen in Epithelzellen der Zystenauskleidung war um etwa 70 Prozent verringert, wie durch 3D-SIM festgestellt wurde (Abbildung 7b). Zusammengenommen ergibt die Analyse von 2 PKD(polyzystische Nierenerkrankung)Mausmodelle und menschliches ADPKD-Gewebe legten nahe, dass TFAM-Mangel und mt-Mangel häufige Befunde bei PKD sind(polyzystische Nierenerkrankung)Gewebe und beeinflussen wahrscheinlich die Pathogenese vonNieren-zystische Erkrankung.

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Diskussion

Klicken Sie hier, um Informationen zu Teil II (Diskussion) dieses Artikels zu erhalten.

Auszug aus: 'Niereepithelialer gezielter mitochondrialer Transkriptionsfaktor A-Mangel führt zu fortschreitender mitochondrialer Depletion in Verbindung mit schwerer zystischer Erkrankung ' von Ken Ishii1,2,11 et al.

---NiereInternational (2021) 99, 657–670