Aufhellungswirksamkeit von Ginsenosid F1 durch Hemmung des Melanintransfers in kokultivierten menschlichen Melanozyten-Keratinozyten und dreidimensionalem menschlichem Hautäquivalent

Ginsenoside sind die Hauptwirkstoffe von Ginseng. In der Hautphysiologie beeinflussen Ginsenoside die Pigmentregulation und zeigen Anti-Aging-Aktivität. Jüngsten Berichten zufolge erhöht Ginsenosid Rg1 die Melanogenese und Tyrosinaseaktivität in menschlichen Melanozyten [1]. Im Gegensatz dazu wird berichtet, dass Ginsenosid F1 (GF1) (sAbb. 1), ein Metabolit, der durch die Hydrolyse von Rg1 entsteht, die sichtbare Pigmentierung hemmt. Eine klinische Studie von Han et al. zeigte eine hautaufhellende Wirkung von GF1 auf künstlich gebräunte menschliche Haut, die durch die Produktion von Interleukin 13 aus menschlichen epidermalen gd-T-Zellen verursacht wird [2]. Kim et al. zeigten, dass GF1 die Melaninsekretion durch Dendrit-Retraktion ohne Auswirkungen auf den intrazellulären Melaningehalt und die Tyrosinase-Expression in Melanozyten-stimulierenden Hormonen (MSH)-stimulierten B16F10-Mäuse-Melanomzellen reduziert [3]. Bisher wurden jedoch keine direkten Erkenntnisse über die aufhellenden Wirkungen von GF1 in der humanen epidermalen Umgebung, bestehend aus Melanozyten und Keratinozyten, in einem in-vitro-Versuchssystem erhalten.

Interpolation, gleichzeitig haben wir festgestellt, dass es auch Tyrosinase in Cistanche deserticola gibt, und die Tyrosinase-Dopa-Raten-Oxidationsmethode hat die Regulierungsforschung der Tyrosinaseaktivität am Phenylethanoidglycosidextrakt in Cistanche deserticola durchgeführt, die Ergebnisse zeigen Folgendes: Gesamtphenylethanoid Glykoside von Cistanche deserticola Der Extrakt kann die Aktivität der Tyrosinase deutlich herunterregulieren. Das Phenylethanoidglykosid in Cistanche deserticola kann auch UV-Strahlung im Sonnenlicht effektiv absorbieren. Die Molekülstruktur des Phenylethanoidglykosids weist mehrere konjugierte Systeme auf. Nach dem Ultraviolettscannen wird festgestellt, dass es eine starke Absorption zwischen 280 nm und 380 nm aufweist und die maximale Absorptionswellenlänge 281 nm und 333 nm beträgt. , was darauf hinweist, dass das Phenylethanoidglykosid von Cistanche deserticola eine gute Absorptionswirkung auf ultraviolette Strahlen hat und die Schädigung der Haut durch ultraviolette Strahlung besser verhindern und lindern kann.

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Abb. 1. Die Wirkung von GF1 auf den Melaningehalt und die Tyrosinaseexpression in menschlichen Melanozyten. GF1 (10 mM, 50 mM, 100 mM) wurde mit MNT-1-Zellen für 24 h, 48 h und 72 h behandelt. (A) Der Melaningehalt wurde dann analysiert. (B) Das Tyrosinase-Expressionsniveau wurde analysiert. Zusätzlich wurde GF1 (10, 50, 100 uM) mit a-MSH (500 nM)-stimulierten MNT-1-Zellen für 48 h und 72 h behandelt. (C) Melaningehalte wurden dann analysiert. (D) Das Tyrosinase-Expressionsniveau wurde analysiert. Wir behandelten primäre normale humane epidermale Melanozyten (NHEM) mit GF1 (50 mM und 100 mM) in Gegenwart oder Abwesenheit einer a-MSH-Stimulation für 48 h. (E) Der Melaningehalt wurde dann analysiert. (F) Das Tyrosinase-Expressionsniveau wurde analysiert. MNT-1-Zellen wurden mit GF1 (50 mM und 100 mM) für 48 h in einem Kulturmedium behandelt, das 100 mM oder 500 mM L-Tyrosin enthielt. (G) Dann wurden die Melaningehalte analysiert. GADPH, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase; GF1, Ginsenosid F1.

Hier untersuchten wir die antimelanogenen Wirkungen von GF1 auf MNT-1/HaCaT-Kokulturzellen und dreidimensionales (3-D) menschliches Hautäquivalent. Darüber hinaus konzentrierten wir uns auf die Dendritenbildung in Melanozyten und den Melanosomentransfer in Keratinozyten nach GF1-Behandlung. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse zum ersten Mal, dass GF1 die aufhellende Wirkung in der menschlichen Epidermis zeigte, die mit Melanozyten und Keratinozyten koexistiert.

Für diese Studie wurden MNT-1-Zellen in Minimum Essential Media (MEM) kultiviert, das 20 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % Gentamicin und 20 mM Hydroxyethylpiperazineethansulfonsäure (HEPES) enthielt. HaCaT-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) kultiviert, das 10 % FBS, 1 % Gentamicin und 20 mM HEPES enthielt. Normale humane epidermale Melanozyten (NHEM) wurden von (Lonza, Basel, Schweiz) bezogen und in Melanozyten-Wachstumsmedium -4 (MGM-4)-Medium kultiviert. Die Zellen wurden bei 37°C unter einer 5-prozentigen CO2-Atmosphäre inkubiert.

Um den Melaningehalt zu messen, wurden Zellen (2 105) in einer 6-Well-Platte für 24 h kultiviert. Die Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen von GF1 behandelt. Danach wurden die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann mit Trypsin/EDTA abgelöst. Die Zellen wurden durch Inkubieren in 200 ml 1 N NaOH bei 80°C für 2 h lysiert. Zelllysate wurden auf eine Platte mit 96- Vertiefungen übertragen und die Extinktion wurde bei 405 nm gemessen.

Zur Durchführung von Western Blotting wurden die Zellen zweimal mit kaltem PBS gewaschen und dann in eiskaltem modifiziertem Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Puffer (5 0 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 Prozent Nonidet P-40) lysiert. , 0,5 Prozent Natriumdesoxycholat, 150 mM NaCl) mit Protease-Inhibitoren und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail-Set (Calbiochem, San Diego, CA, USA). Proteine ​​wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden mit primären Antikörpern bei 4 °C für 24 h inkubiert, dann mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung einschließlich 0,1 % Tween-20 gewaschen, Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörpern für 1 h bei Raumtemperatur ausgesetzt, gewaschen und dann sichtbar gemacht unter Verwendung eines Odyssey-Bildgebungssystems.

Um den Melanosomentransfer zu analysieren, wurden MNT{0}}/HaCaT-Zellen in einer 12-Well-Platte im Verhältnis von 1 zu 10 für 24 h und dann GF1 kultiviert wurde mit der angegebenen Konzentration behandelt. Die Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen und mit 3,5 % Paraformaldehyd für 10 min fixiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit 0,1 Prozent Triton X-100 für 10 Minuten und dann mit 0,5 Prozent Rinderserumalbumin (BSA) für 1 Stunde behandelt. Antikörper gegen Tyrosinase-verwandtes Protein 1 (1:200, rot) und Cytokeratin -18 (1:200, grün) wurden für den Melanozyten- und Keratinozytennachweis verwendet.

MelanoDerm Skin Tissue Model (TM) ist ein lebensfähiges rekonstituiertes {{0}}D-Äquivalent menschlicher Haut, das normale Melanozyten und Keratinozyten enthält (MatTek Corp., Ashland, MA). Wir haben MelanoDerm TM (MEL-300-A) verwendet, das von asiatischen Spendern stammt. Sie wurden wie vom Hersteller empfohlen im neuen Wartungsmedium-113 gepflegt. GF1 wurde an den Tagen 0, 4, 6, 8, 11, 13 und 15 auf das MelanoDerm TM aufgetragen. Vor der GF1-Behandlung wurden die Gewebe mit 1 ml PBS gewaschen, um jegliche restliche Verbindung zu entfernen. Die Gewebe wurden am Tag 18 für die histologische Analyse fixiert. Die histologische Auswertung wurde unter einem Lichtmikroskop (Bx-41; Olympus, Tokio, Japan) durchgeführt, und Mikrofotografien wurden mit einer Digitalkamera (DP72; Olympus) aufgenommen. Melanoderm wurde für die Färbung in einer 4-prozentigen gepufferten Formaldehydlösung fixiert. Die Proben wurden in Paraffinwachs eingebettet, auf eine Dicke von 3 mm geschnitten und unter Verwendung von Hämatoxylin und Eosin und Färbelösung von Fontana und Mason gefärbt. Alle Daten sind als mittlere SD-Werte (Standardabweichung) ausgedrückt, und der Student-t-Test wurde für statistische Vergleiche verwendet. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen (individuelle p-Werte sind in den Legenden der Abbildungen angegeben).

Um die Wirkung von GF1 auf menschliche Melanozyten festzustellen, behandelten wir hochpigmentierte menschliche Melanomzellen (MNT-1) mit GF1 für 24, 48 und 72 h, gefolgt von einer Analyse des intrazellulären Melaningehalts und der Expression von Tyrosinase-Protein . Wie in 1A gezeigt, hatte GF1 keine hemmende Wirkung auf den Melaningehalt innerhalb eines Konzentrationsbereichs von 10–100 mM. Außerdem wurde die Tyrosinase-Expression durch GF1 in MNT-1-Zellen nicht verringert (Fig. 1B, sFig. 2A). Die Behandlung von a-MSH-stimulierten MNT-1-Zellen mit GF1 für 48 h und 72 h führte nicht zu einer Unterdrückung des Melaningehalts (Fig. 1C) oder der Tyrosinase-Expression (Fig. 1D, sFig. 2B). Um die Wirkung von GF1 auf menschliche Melanozyten weiter zu bestätigen, behandelten wir primäres NHEM mit GF1 in Gegenwart oder Abwesenheit einer a-MSH-Stimulation für 48 h. Ähnlich wie bei Daten, die mit MNT-1-Zellen erhalten wurden, beeinflusste GF1 den Melaningehalt (Fig. 1E) oder die Tyrosinase-Expression (Fig. 1F, sFig. 2C) in NHEM nicht. Schließlich bewerteten wir, ob der L-Tyrosinspiegel im Kulturmedium die GF1-Aktivität beeinflusst, da L-Tyrosin das Substrat der Tyrosinase für die Melaninsynthese ist. Dementsprechend wurden MNT-1-Zellen mit GF1 für 48 h in dem Kulturmedium behandelt, das 100 mM oder 500 mM L-Tyrosin enthielt. Wie in Fig. 1G gezeigt, hemmte GF1 den Melaningehalt in MNT-1-Zellen nicht, ungeachtet der Konzentration von L-Tyrosin.

Abb. 2. Die Wirkung von GF1 auf die Dendritenbildung und den Melanosomentransfer in MNT-1/HaCaT-kokultivierten Zellen und einem menschlichen 3-D-Hautäquivalent. Kokultivierte MNT-1/HaCaT-Zellen wurden mit 100 mM GF1 in Gegenwart oder Abwesenheit einer a-MSH (500 nM)-Stimulation für 48 h behandelt. (A) Nach der Fixierung beobachteten wir die Dendritenbildung in Melanozyten mit optischer Mikroskopie (Maßstabsbalken; 50 mm). (B) Für die Immunfärbung haben wir Melanosomen mit TRP-1-Antikörper (rote Farbe) und Keratinozyten mit Cytokeratin-18 (grüne Farbe) gefärbt. Weiße Pfeile zeigen übertragenes Melanosom auf HaCaT von MNT-1-Zellen (Maßstabsbalken; 20 mm). Menschliches Hautäquivalent (MelanoDerm; n ¼ 3) wurde mit 1 Prozent Kojisäure als Referenz-Aufhellungsverbindung und GF1 (10 und 50 ug/ml) für 18 Tage behandelt. (C) Nach der Behandlung wurden Hautäquivalente fotografiert. (D) Der 6-L-Wert (Helligkeitsgrad im Vergleich zur mit Vehikel behandelten Kontrolle) wurde für jede Testprobe berechnet. (E) Die Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung von Gewebeschnitten. (F) Fontana-Mason (F&M)-Färbung von Gewebeschnitten. Die Objektträger wurden in einer Formaldehydlösung fixiert und für die Färbung in Paraffinwachs eingebettet (Maßstab; 50 mm). Schwarze Pfeile zeigen das übertragene Melanosom von Melanozyten in der Basalschicht zu Keratinozyten in der oberen Schicht. Blaue Pfeile zeigen Melanozyten an, die die ausgedehnten Dendriten bilden. (* p < 0,05, ** p < 0,01, * p < 0,001). CON, Kontrolle; GF1, Ginsenosid F1; KA, Kojisäure.

Nach der Feststellung, dass GF1 in monokultivierten menschlichen Melanozyten keine antimelanogene Wirkung ausübt, analysierten wir weiter, ob GF1 die Melaninsynthese in Melanozyten in einem experimentellen System beeinflusst, das sowohl Keratinozyten als auch Melanozyten mit der Möglichkeit der Zell-Zell-Kommunikation enthält. MNT-1- und HaCaT-Zellen (eine immortalisierte menschliche normale Keratinozyten-Zelllinie) wurden mit 100 mM GF1 in Anwesenheit oder Abwesenheit von UV-B-Bestrahlung cokultiviert. Nach 48 h (sAbb. 3A) oder 72 h (sAbb. 3B) bewerteten wir den Melaningehalt von isoliertem MNT-1 und kokultivierten Zellen. Unsere Daten zeigten, dass GF1 die Melaninsynthese sowohl in isolierten MNT-1- als auch in kokultivierten Zellgruppen nicht hemmt.

Neben der Melaninsynthese konzentrierten wir uns auf die hemmende Wirkung von GF1 auf den Melanosomentransfer von Melanozyten zu Keratinozyten. Insbesondere wurden kokultivierte MNT-1/HaCaT-Zellen mit 100 mM GF1 in Anwesenheit oder Abwesenheit einer a-MSH-Stimulation behandelt (Abb. 2A), gefolgt von einer Untersuchung der Dendritenbildung in Melanozyten, die für den Melanosomentransfer erforderlich ist . Interessanterweise wurden aMSH-induzierte gestreckte Dendriten nach GF1-Behandlung zurückgezogen. Dann färbten wir TRP-1--positive Melanosomen (rot) für MNT1-Zellen und Cytokeratin-18 (grün) für HaCaT-Zellen in Kokulturen. Wie in Fig. 2B gezeigt, wurden TRP-1--positive Melanosomen in MNT-1-Zellen nach a-MSH-Stimulation, die durch GF1 signifikant gehemmt wurde, in HaCaT-Zellen transferiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass GF1 den Melanosomentransfer unterdrückt, was eine Dendritenretraktion von Melanozyten verursacht.

Um diese Untersuchung auf ein physiologischeres System auszudehnen, untersuchten wir die Bleichfähigkeit von GF1 in einem menschlichen 3-D-Hautäquivalent, bei dem es sich um eine epidermale Schicht handelt, die aus Melanozyten und Keratinozyten besteht. In Fig. 2C erschien GF1--behandeltes Gewebe heller als Kontrollgewebe, und der L-Wert (ein Helligkeits-/Dunkelheitsindex) wurde nach GF1-Behandlung verändert (Fig. 2D). Außerdem zeigte die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung von Gewebeschnitten keinen Gewebekollaps oder Toxizität (Fig. 2E). Färbungsexperimente von Fontana und Mason zeigten, dass GF1 die Dendritenbildung von Melanozyten in der Basalschicht hemmt und gleichzeitig den Melanosomentransfer von Melanozyten der Basalschicht zu Keratinozyten der differenzierten oberen Schicht unterdrückt ( 2F ). Diese Ergebnisse unterstützen gemeinsam die inhibitorische Wirksamkeit von GF1 beim Melanosomentransfer, was zur Förderung der Aufhellung im menschlichen Hautgewebemodell führt.

In der vorliegenden Studie hemmte GF1 die Melaninsynthese und die Tyrosinaseexpression nicht; vielmehr erhöhte GF1 leicht den intrazellulären Melaningehalt und die Tyrosinaseexpression in MNT-1-Zellen und kokultivierten Zellen (Fig. 1A und 1B und sFig. 3A). Gleichzeitig fanden wir jedoch heraus, dass GF1 den Melanosomentransfer durch die verringerte Dendritenbildung von Melanozyten hemmte. Wir vermuten, dass erhöhte intrazelluläre Melaningehalte durch GF1 durch Melanosomenakkumulation aufgrund der Blockade des Melanosomentransfers und der Induktion der Tyrosinaseexpression verursacht werden könnten. Die sichtbare Hautpigmentierung wird durch die Menge der Dispersion von Melanosomen aus den verschiedenen Bereichen der ausgedehnten Dendriten von Melanozyten zu den umgebenden Keratinozyten bestimmt [4]. Mehrere Verbindungen, wie Centaureidin und Methylophiopogonanon B, zeigten eine aufhellende Wirksamkeit, die zu einer Retraktion der Melanozyten-Dendriten führte, ohne die Expression melanogener Enzyme oder die Melaninsynthese zu beeinflussen [5]. Daher wird die Blockade des Melanosomentransfers von Melanozyten in Keratinozyten als ein wirksamer Ansatz angesehen, um einen Aufhellungseffekt zu induzieren, obwohl die Melaninbiosynthese nicht gehemmt wird. Daher gingen wir davon aus, dass erhöhte Melaningehalte durch GF1 wenig Einfluss auf die Aufhellungswirksamkeit von GF1 haben. Darüber hinaus würden angesammelte Melanosomen durch Autophagie für die Homöostase der Haut abgebaut, obwohl das Schicksal der Melanosomen unklar ist [6].

Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass GF1 die a-MSH-induzierte Dendritenbildung unterdrückt, was zu einer Hemmung des Melanosomentransfers in Keratinozyten in Kokulturen menschlicher Zellen führt. Darüber hinaus unterbrach GF1 den Melanintransfer von Melanozyten in der Basalschicht zu Keratinozyten in der oberen Schicht, was eine aufhellende Wirkung im Äquivalent der menschlichen Haut ausübt. Kürzlich durchgeführte Kokulturexperimente weisen darauf hin, dass Melanozyten Pigmente an Keratinozyten über Veränderungen der dendritischen Morphologie liefern, wie z. B. die Desorganisation von b-Tubulin-Mikrofilamenten im intrazellulären Zytoskelett [7,8]. Zyklisches Adenosinmonophosphat, ein Melanogenese-Induktor, vermittelt die Dendritenbildung durch Hochregulierung der Rac- und Herunterregulierung der Rho-Aktivität [9,10]. Daher werden sich zukünftige Studien unserer Gruppe auf eine umfassende Bewertung der Zielproteine ​​von GF1 konzentrieren, wie z. B. Moleküle, die am zyklischen Adenosinmonophosphat-Signalweg beteiligt sind.

Insgesamt liefern unsere Ergebnisse vorläufige Beweise dafür, dass GF1 das Potenzial für die Entwicklung als wirksames Aufhellungsreagenz für die Behandlung von Pigmentstörungen und die Aufhellung dunklerer Hautfarbe als kosmetischer Inhaltsstoff hat.

Interessenskonflikte

Alle beitragenden Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom Amorepacific R&D Center unterstützt und finanziert.

Verweise

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[3] Kim JH, Baek EJ, Lee EJ, Yeom MH, Park JS, Lee KW, Kang NJ. Ginsenosid F1 dämpft die Hyperpigmentierung in B16F10-Melanomzellen, indem es eine Dendritenretraktion induziert und die Rho-Signalübertragung aktiviert. Exp Dermatol 2015;24:150e2.

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Chang-Seok Lee 1,3 , Gibaeg Nam 1 , Il-Hong Bae 1 , Junseong Park 1,2,*

1 Amorepacific CO R&D Center, Yongin-si, Republik Korea

2Department of Engineering Chemistry, Chungbuk National University, Cheongju-si, Chungbuk, Republik Korea

3Department of Beauty and Cosmetic Science, College of Health Science, Eulji University, Seongnam-si, Republik Korea

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