Zerumbone, ein tropisches Ingwer-Sesquiterpen von Zingiber Officinale Roscoe, schwächt die -MSH-induzierte Melanogenese in B16F10-Zellen Teil 1

Abstrakt:Zerumbone (ZER), ein aktiver Bestandteil der Familie der Zingiberaceae, weist nachweislich mehrere biologische Aktivitäten auf, wie z. B. entzündungshemmende, antiallergische, antimikrobielle und krebshemmende Wirkung; Es wurden jedoch keine antimelanogenen Eigenschaften untersucht. In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass ZER und Zingiber offizielle (ZO) Extrakte sind, die die Melaninakkumulation in durch Melanozyten-stimulierendes Hormon (-MSH) stimulierten melanogenen B16F10-Zellen der Maus signifikant abschwächen. Um den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den ZER die Melaninansammlung unterdrückt, analysierten wir außerdem die Expression des Melanogenese-assoziierten Transkriptionsfaktors, des Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors (MITF), und seiner Zielgene, wie Tyrosinase, Tyrosinase-verwandtes Protein 1 ( TYRP1) und Tyrosinase-verwandtes Protein 2 (TYRP2) in B16F10-Zellen, die durch -MSH stimuliert werden. Hier fanden wir heraus, dass ZER die MITF-vermittelte Expression melanogener Gene bei -MSH-Stimulation hemmt. Darüber hinaus zeigten Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Zerumbone und ZO behandelt wurden, eine erhöhte Phosphorylierung der extrazellulären signalregulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2), die am Abbaumechanismus von MITF beteiligt sind. Die pharmakologische Hemmung von ERK1/2 mit U0126 kehrte die anti-melanogene Wirkung von ZER ausreichend um, was darauf hindeutet, dass eine erhöhte Phosphorylierung von ERK1/2 für seine anti-melanogene Aktivität erforderlich ist. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass ZER- und ZO-Extrakte aufgrund ihrer antimelanogenen Wirkung als Wirkstoffe in hautaufhellenden Kosmetika verwendet werden können.

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Schlüsselwörter:Zerumbone; Zingiber, offizieller Roscoe; Melanogenese; MITF; ERK1/2

1. Einleitung

Die Melanogenese, die Produktion von Melanin durch epidermale Melanozyten, wird durch das Melanozyten-stimulierende Hormon (-MSH) stimuliert, das von Keratinozyten ausgeschüttet wird, wenn sie ultravioletter (UV) Strahlung ausgesetzt werden [1,2]. Der Stammzellfaktor (SCF) ist ein weiterer melanogener Faktor, der die Migration, Proliferation und Differenzierung von Melanozyten streng kontrolliert, um die postnatale kutane Melanogenese aufrechtzuerhalten [3]. Der Mikrophthalmie-assoziierte Transkriptionsfaktor (MITF), ein melanogener Transkriptionsfaktor, wird über den cAMP-PKA-CREB-Signalweg (zyklisches Adenosinmonophosphat-Proteinkinase-A-cAMP-Response-Element-Bindungsprotein) bei -MSH-Stimulation über den Melanocortin-1-Rezeptor aktiviert (MC1R) in zytoplasmatischen Membranen epidermaler Melanozyten [4]. Es ist bekannt, dass mehrere Chemikalien wie Forskolin und IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin) den cAMP-PKA-CREB-Signalweg aktivieren, was zur Induktion der Melanogenese führt [5]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass eine anhaltende Aktivierung der extrazellulär regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2), die am molekularen Mechanismus der Onkogenese beteiligt sind, die MITF-Phosphorylierung an Ser73 und deren anschließenden Abbau durch Ubiquitin-abhängige Proteolyse fördert [6,7 ]. Tatsächlich wurde berichtet, dass U0126, ein selektiver ERK1/2-Signalweg-Inhibitor, die MITF-Expression und Tyrosinase-Aktivität erhöht, was zur Melaninproduktion führt [6]. Stabilisiertes und aktiviertes MITF erhöht die Expression melanogener Gene wie Tyrosinase, Tyrosinase-verwandtes Protein 1 (TYRP1) und Tyrosinase-verwandtes Protein 2 (TYRP2). Die Umwandlung von Tyrosin in 3,{39}}Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), der erste Schritt der Melanogenese, wird durch Tyrosinase katalysiert. Tyrosinase-verwandte Proteine ​​(TRPs) katalysieren weitere Oxidations- und Tautomerisierungsreaktionen [8]. Nach der Melaninsynthese wird reifes Melanin von epidermalen Melanozyten in das Zytoplasma der basalen Keratinozyten transportiert, um die Zellen vor UV-Strahlung zu schützen [2].

Eine ungewöhnlich erhöhte Melanogenese verursacht mehrere Arten von Hauterkrankungen, wie z. B. Hautkrebs, Chloasma und Sommersprossen [4]; Daher wurden kleine Moleküle oder natürliche Produkte, die entweder auf die katalytische Aktivität von Tyrosinase oder auf Regulatoren von Signalwegen in der Melanogenese, einschließlich ERK1/2, oder der MITF-vermittelten Transkription melanogener Gene abzielen, als Wirkstoffe identifiziert, die in Kosmetika genutzt werden sollen Industrie. Mehrere kleine Moleküle wie Kojisäure, Arbutin und Niacinamid werden aufgrund ihrer antimelanogenen Wirkung häufig als kosmetische Inhaltsstoffe verwendet. Berichte haben jedoch gezeigt, dass Kojisäure aufgrund ihrer genotoxischen Aktivität mehrere Nebenwirkungen verursacht, darunter Zytotoxizität, Dermatitis, Hautkrebs und hepatozelluläres Karzinom [9]. Obwohl Arbutin, das aus der Bärentraubenpflanze isoliert wurde, zur Behandlung von Hyperpigmentierungsstörungen eingesetzt wurde, wurde seine Verwendung als kosmetischer Inhaltsstoff aufgrund seiner zahlreichen Nebenwirkungen in letzter Zeit eingeschränkt [9]. Es wurde berichtet, dass Niacinamid eine antimelanogene Aktivität hat und diese Aktivität durch die Hemmung der Melanosomenübertragung von Melanozyten auf umgebende Keratinozyten erfolgt [10]. Daher wird es in der Kosmetikindustrie allgemein als hautaufhellende Verbindung verwendet. Um die Einschränkungen etablierter Hautaufheller, die mehrere Nebenwirkungen haben, zu überwinden, ist es wichtig, sichere hautaufhellende Inhaltsstoffe aus natürlichen Quellen zu entwickeln. Beispielsweise wurden -Thujaplicin, Linderanolid B, 4-Butylresorcinol und Plumbagin aufgrund ihrer Tyrosinase-hemmenden Wirkung als antimelanogene Verbindungen identifiziert [4,11]. Nobiletin, Withaferin A, Sesamol und Chaetocin weisen antimelanogene Eigenschaften auf, indem sie Signalintermediate im Melanogeneseweg modulieren [11].

Zerumbone (ZER) ist ein Naturprodukt, das aus den flüchtigen ätherischen Ölen von Pflanzen der Familie der Zingiberaceae, wie Zingiber zerumbet Smith und Zingiber officinal Roscoe, isoliert wird [12]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass ZER über ein breites Spektrum an biologischen Aktivitäten verfügt, darunter antimikrobielle, antioxidative, antidiabetische, krebsbekämpfende, entzündungshemmende, antiallergene und antiangiogene Aktivitäten [12]. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass ZER aufgrund seiner Fähigkeit, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) über die Aktivierung des Kernfaktors E abzufangen, eine schützende Wirkung gegen durch Ultraviolett A (UVA) verursachte oxidative Schäden in Hautkeratinozyten ausübt.{{8} }verwandter Faktor-2 (Nrf2) [1,13]. Dies legt nahe, dass ZER als funktioneller Zusatzstoff in Hautpflegekosmetika eingesetzt werden kann. Der detaillierte Mechanismus der antimelanogenen Eigenschaften der ZER-Wirkung muss jedoch noch untersucht werden.

In der vorliegenden Studie wurden die hemmenden Wirkungen von ZER und Zingiber-Extrakt (ZO) auf die -MSH-stimulierte Melanogenese und die zugrunde liegenden Mechanismen untersucht. Hier zeigen wir, dass ZER die -MSH-induzierte Melanogenese signifikant unterdrückt, indem es die Phosphorylierung von ERK1/2 hochreguliert und die MITF-vermittelte Expression melanogener Gene hemmt.

2. Ergebnisse

2.1. Zerumbone (ZER) unterdrückt die -MSH-induzierte Melanogenese in B16F10-Mausmelanomzellen

Um die anti-melanogene Wirkung von Zerumbone (ZER) zu untersuchen, haben wir zunächst seine Zytotoxizität sowohl in B16F10- als auch in HaCaT-Zellen untersucht. Die chemische Struktur von ZER ist in Abbildung 1A dargestellt. Es wurde beobachtet, dass ZER bei Konzentrationen über 20 µM eine starke zytotoxische Wirkung zeigte, wohingegen ZER bei Konzentrationen unter 20 µM in beiden Zelllinien keine Zytotoxizität zeigte (Abbildung 1B). Als nächstes untersuchten wir die hemmende Wirkung von ZER auf Melanozyten, die die durch Hormon (-MSH) induzierte Melaninakkumulation und -sekretion in B16F10-Zellen stimulieren. Es wurde gezeigt, dass ZER die -MSH-induzierte intrazelluläre Akkumulation von Melanin und dessen Sekretion in das Kulturmedium stark unterdrückt (Abbildung 1C, D). Darüber hinaus haben wir herausgefunden, dass ZER die Melanogenese wirksamer abschwächt als 1 mM Arbutin oder 0,2 mM Kojisäure, die bekannten aktiven Bestandteile hautaufhellender Kosmetika (Abbildung 1D). Um herauszufinden, ob ZER ausreicht, um die Melanogenese in menschlichen Zellen zu unterdrücken, verwendeten wir Melanin produzierende menschliche G361-Melanomzellen. Wie in Abbildung 1E gezeigt, verringert ZER den durch den Stammzellfaktor (SCF) induzierten extra- und intrazellulären Melaningehalt erheblich. Diese Ergebnisse bestätigen die anti-melanogene Aktivität von ZER in melanogenen Maus-B16F10- und menschlichen G361-Zellen.

2.2. Zerumbone unterdrückt die Genexpression des Melanogenese-Transkriptionsfaktors MITF und seiner Zielgene in menschlichen G361-Melanomzellen 

Es wurde berichtet, dass die Signalübertragung von Endothelin-1 und SCF eine wesentliche Rolle bei der Melanogenese in menschlichen Melanozyten und mehreren Subtypen von Melanomen spielt [3,14–16]. In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass ZER die Melanogenese aufgrund melanogener Reize, -MSH und SCF, in Maus-B16F10- und menschlichen G361-Melanomzellen unterdrückt (Abbildung 1).

Daher haben wir Veränderungen im Expressionsniveau melanogenesebezogener Gene und Proteine ​​nach SCF-Stimulation in menschlichen G361-Melanomzellen gemessen. Wir fanden heraus, dass ZER die SCF-induzierte MITF- und Tyrosinase-Proteinexpression 2–4 Stunden bzw. 24–48 Stunden nach der SCF-Stimulation abschwächt (Abbildung 2A). Darüber hinaus wurde die Genexpression melanogenesebezogener Gene wie MITF, Tyrosinase und Tyrosinase-verwandtes Protein 1 (TYRP1) in ZER-behandelten G361-Zellen unterdrückt (Abbildung 2B, C). Diese Ergebnisse zeigten die Spitzenzeit für die Expression melanogenesebezogener Gene bei SCF-Stimulation; Die maximale MITF-mRNA-Induktion wurde innerhalb von 1–2 Stunden beobachtet, und es wurde beobachtet, dass die mRNA-Spiegel von Tyrosinase und TYRP1 24–48 Stunden nach der SCF-Stimulation ihr Maximum erreichten.

2.3. Zerumbone unterdrückt die Expression melanogener Gene und Enzyme in Maus-B16F10-Zellen

Um den molekularen Mechanismus zu untersuchen, durch den ZER die Melanogenese unterdrückt, haben wir die Genexpression des Melanogenese-Transkriptionsfaktors MITF und seiner Zielgene wie Tyrosinase-verwandtes Protein 1 (TYRP1), Tyrosinase und Tyrosinase-verwandtes Protein 2 (TYRP2) gemessen. in Abwesenheit oder Anwesenheit von ZER. Da die Spitzenzeit für die Melanogenese-bezogene Genexpression bei SCF- und -MSH-Stimulation für menschliche G361- (Abbildung 2) bzw. Maus-B16F10-Melanomzellen [4] bekannt ist, haben wir die Expression von MITF, Tyrosinase, TYRP1 und TYRP2 weiter gemessen in ZER-behandelten Maus-B16F10-Melanomzellen nach 2 oder 48 Stunden Inkubation mit -MSH. Abbildung 3A zeigt, dass ZER ausreicht, um die -MSH-induzierte MITF-, TYRP1-, TYRP2- und Tyrosinase-Expression in B16F10-Zellen abzuschwächen. In ähnlicher Weise wurden die Expressionsniveaus von MITF, Tyrosinase und TYRP2-Protein durch die ZER-Behandlung verringert. Die durch Proteinkinase A (PKA) vermittelte Phosphorylierung von CREB ist ein wichtiger Signalweg, der MITF auf Transkriptionsebene bei -MSH-Stimulation erhöht [4]. Daher haben wir hier analysiert, ob eine verminderte Phosphorylierung von CREB durch ZER die Unterdrückung von MITF vermitteln könnte. Wir fanden heraus, dass die -MSH-induzierte CREB-Phosphorylierung durch die ZER-Behandlung nicht beeinflusst wurde, was darauf hindeutet, dass ZER die -MSH-induzierte MITF-Expression unabhängig von der PKA-CREB-Signalwegachse unterdrückt (Abbildung 3B). Da Tyrosinase ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym ist, das die Melaninsynthese reguliert [2,4,11], haben wir die intrazellulären Tyrosinase-Proteinspiegel und ihre enzymatische Aktivität bei der Behandlung mit Arbutin, Kojisäure und ZER weiter analysiert. Abbildung 3C zeigt, dass ZER die -MSH-induzierten Tyrosinase-Proteinspiegel in B16F10-Zellen ausreichend reduziert. Darüber hinaus zeigt Abbildung 3D, dass 10 µM ZER die L-DOPA-Oxidation wirksamer unterdrückt als Tyrosinase-Inhibitoren, Arbutin und Kojisäure, was darauf hindeutet, dass die Oxidation von L-DOPA zu Dopaquinon durch die enzymatische Aktivität von Tyrosinase in ZER-behandelten Zellen unterdrückt wird . Diese Ergebnisse zeigen, dass ZER die -MSH-vermittelte Melanogenese abschwächt, indem es die Genexpression von MITF, einem Melanogenese-assoziierten Transkriptionsfaktor, und seinen Zielgenen unterdrückt.

2.4. Die antimelanogene Wirkung von Zerumbone beruht auf der Phosphorylierung von ERK1/2

Es ist bekannt, dass die Aktivierung von Proteinkinase B (AKT) und extrazellulären signalregulierten Kinasen (ERK1/2) durch Wachstumsfaktoren oder melanogene Reize die Melanogenese durch die verminderte Expression von MITF und seinen Zielgenen unterdrückt [11]. Die Phosphorylierung von MITF an Ser73 und Ser409 als Reaktion auf den ERK1/2-Signalweg fördert seinen Proteasom-abhängigen Abbau [17,18]. Daher untersuchten wir, ob ZER die ERK1/2-Phosphorylierung in B16F10-Maus- und G361-Menschen-Melanomzellen reguliert. Bei der ZER-Behandlung wurde zeit- und dosisabhängig eine erhöhte Phosphorylierung von ERK1/2 (p-ERK1/2), jedoch nicht der gesamten ERK1/2 (T-ERK1/2) beobachtet (Abbildung 4A, B). Interessanterweise wurde beobachtet, dass die Phosphorylierung von ERK1/2 innerhalb von 10–30 Minuten und 1–2 Stunden nach der ZER-Behandlung in Maus-B16F10- und menschlichen G361-Melanomzellen schnell anstieg (Abbildung 4A). Bei der ZER-Behandlung wurde jedoch keine Phosphorylierung von AKT und MEK beobachtet, was darauf hindeutet, dass die ZER-induzierte ERK1/2-Phosphorylierung MITF unterdrücken könnte (Abbildung 4B). Da die ERK1/2-Phosphorylierung die Phosphorylierung und den proteasomalen Abbau von MITF fördert [17,18], haben wir untersucht, ob der Proteasom-Inhibitor die Reduktion von MITF durch ZER verhindert. In Gegenwart von MG132 wurde keine Unterdrückung von MITF durch ZER beobachtet, was bestätigt, dass ZER die MITF-Expression durch proteasomalen Abbau verringert (Abbildung 4C). Als nächstes untersuchten wir, ob ZER MITF an Ser73, dem Zielrest von ERK1/2, phosphoryliert. Um phosphoryliertes MITF nachzuweisen, wurden die Zellen -MSH und MG132 ausgesetzt. Hier fanden wir heraus, dass phosphoryliertes MITF (Ser73) durch ZER in Gegenwart von -MSH und MG132 signifikant erhöht wurde (Abbildung 4D). U0126, ein selektiver Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK)-Inhibitor [19], hob die ZER-induzierte MITF-Phosphorylierung auf (Abbildung 4D). Darüber hinaus wurden die gesamten MITF-Proteinspiegel in Ganzzelllysaten (WCL) durch ZER und U0126 in Gegenwart von MG132 nicht verändert (Abbildung 4D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ERK1/2-vermittelte MITF (Ser73)-Phosphorylierung und der proteasomale Abbau ein entscheidender Mechanismus bei der ZER-vermittelten Unterdrückung von MITF sind. Darüber hinaus zeigt Abbildung 4E, dass U0126 die reduzierten MITF-Proteinspiegel in ZER-behandelten Zellen deutlich wiederherstellte. Konsistent wurde der verringerte intrazelluläre Melaningehalt durch ZER durch U0126 auf etwa 40 Prozent wiederhergestellt (Abbildung 4F), was darauf hindeutet, dass die Aktivierung von ERK1/2 für die antimelanogene Wirkung von ZER erforderlich ist.

2.5. Antimelanogene Wirkung von Zingiber Offificinale (ZO)-Extrakten

ZER ist ein sekundärer Pflanzenstoff, der aus mehreren Pflanzenarten der Familie der Zingiberaceae wie Zingiber zerumbet und Zingiber officinal gewonnen wird [12]. Daher haben wir zunächst die Lebensfähigkeit der Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von ZO-Extrakt in B16F10- und HaCaT-Zellen gemessen. Abbildung 5A zeigt, dass die Lebensfähigkeit der Zellen durch die Behandlung mit ZO-Extrakt nicht verändert wurde. Wir haben die antimelanogene Wirkung des Zingiber-Extrakts (ZO) weiter analysiert. Da die Expression von MITF und seinen melanogenen Zielgenen durch ZER über den aktivierten ERK1/2-Signalweg verringert wurde (Abbildungen 2 und 3), haben wir überprüft, ob ZO-Extrakt die -MSH-induzierte Expression von MITF und seinen melanogenen Zielproteinen in B16F10-Zellen unterdrückt. Ähnlich wie die antimelanogene Wirkung von ZER wurden -MSH-induziertes MITF, Tyrosinase und TYRP2 durch den ZO-Extrakt dosisabhängig signifikant verringert (Abbildung 5B). Interessanterweise war die ERK1/2-Phosphorylierung auch in mit ZO-Extrakt behandelten Zellen erhöht (Abbildung 5B). Die Expression von MITF und seinen Zielgenen wie Tyrosinase, TYRP1 und TYRP2 wurde bei der Behandlung mit 5 µg/µL ZO-Extrakt deutlich verringert (Abbildung 5C). Darüber hinaus wurde sowohl der extrazelluläre als auch der intrazelluläre Melaningehalt durch die Behandlung mit 5 µg/µL ZO-Extrakt deutlich auf etwa 40 Prozent reduziert (Abbildung 5D). Darüber hinaus wurde eine verringerte Tyrosinaseaktivität in Zellen beobachtet, die mit ZO-Extrakt behandelt wurden (Abbildung 5E). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der offizielle Zingiber-Extrakt (ZO) die Melanogenese unterdrückt, indem er die MITF-vermittelte melanogene Genexpression abschwächt.

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