Eine neuartige Strategie zum Screening aktiver Komponenten in Cistanche Tubulosa auf der Grundlage von Spektrum-Wirkungs-Beziehungsanalyse und Netzwerkpharmakologie Ⅱ

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. HPLC-Fingerabdrücke

3.1.1. Methodenvalidierung

Die Validierung für die HPLC-Methode zeigte, dass die relative Standardabweichung (RSD) für Methodenpräzision, Reproduzierbarkeit und Stabilität weniger als 2,85 Prozent für die relative Peakfläche (n = 11) und 0,77 Prozent betrug für die relative Retentionszeit (n = 11). Die Präzision der gleichen Probenlösung lag im Bereich von 0,05–{{10}},77 Prozent für die relative Zeit und 0,28– 2,7 0 Prozent für die relative Fläche der gemeinsamen Spitzen. Die Reproduzierbarkeit des Experiments lag im Bereich von 0,03–0,20 Prozent für die relative Zeit und 0,23–2,59 Prozent für die relative Fläche der gemeinsamen Peaks. Die Probenstabilität betrug 0,09–0,24 Prozent für die relative Retentionszeit und 0,75–2,85 Prozent für die relative Fläche der gemeinsamen Peaks. Diese Ergebnisse zeigten, dass der etablierte Fingerabdruck erfüllt war. Die linearen Beziehungen für Geniposidinsäure,Echinacosid, Acteosid, Tubulosid A, UndIsoacteosidsind in Tabelle S4 gezeigt. Der Wert des R-Quadrats war 1,0000, was auf eine gute Linearität hinweist. Die Ergebnisse der Probenwiederfindung zeigten, dass die durchschnittlichen Wiederfindungen von Geniposidinsäure, Echinacosid,Acteosid, Tubulosid A, UndIsoacteosidbetrugen 100,37 % , 103,59 % , 98,46 % , 100,81 % und 101,19 % , und die RSD für die Probenwiederfindung betrug weniger als 2,68 % .

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3.1.2. Peakfläche (PA) und relative Retentionszeit (RRT)

Die Referenzfingerabdrücke und Fingerabdrücke von HMs, WEs und HRs aus 11 Chargen von C. tubulosa sind in Abbildung 2 dargestellt. Elf Peaks, die eine gute Trennung und Auflösung aufwiesen, wurden als gemeinsame Peaks zwischen HMs, WEs und HRs identifiziert. Die fünf Standardverbindungen wurden identifiziert als Geniposidinsäure (A2),Echinacosid(A8),Acteosid (A9), TubulosidA (A10) undIsoacteosid(A11). Die Standardverbindung,Echinacosid, der in allen Chromatogrammen (durchschnittliche Retentionszeit 12,86 min) mit geeigneter Peakfläche und guter Stabilität vorhanden war, wurde als Referenzpeak ausgewählt und zur Berechnung der relativen Retentionszeiten (RRTs) der anderen zehn verwendet gemeinsame Gipfel. Die RRTs dieser verschiedenen Formen liegen im Bereich von 0,16–1,51. PA und Varianzkoeffizient (CV Prozent) dieser gemeinsamen Peaks sind in den Tabellen S5–S7 aufgeführt. Aus den Daten ergeben sich die CV-Prozentwerte für PA in verschiedenen Formen von 25,78 Prozent – ​​142,02 Prozent, 23,36 Prozent – ​​150,38 Prozent und 28,91 Prozent – ​​112,78 Prozent für HMs, WEs bzw. HRs. Diese Ergebnisse zeigen signifikante Unterschiede in der Konzentration von jedemCistanche tubulosaVerbindung zwischen den verschiedenen Formen. Die Fingerabdrücke von HMs, WEs und HRs sind in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 2 HPLC-Fingerabdrücke von Standardproben

3.1.3. Inhalte von HMs, WEs und HRs

Fünf Standardbestandteile vonC. tubulosawurden gemessen. Die Gehalte der Hauptkomponenten sind in Tabelle 1 gezeigt. Der Vergleich zwischen HMs, WEs und HRs ist in Tabelle 2 und Abbildung 4 gezeigt. PhGs in C. tubulosa sind biologisch aktiv, aber thermosensitiv. Wärmeempfindliche Bestandteile, die sich in Wasser lösen, können mit einem vernünftigen Verfahren effizient extrahiert werden. Im Allgemeinen wird Cistanche herba mit Wasser extrahiert und dann für die folgende chemische Analyse zu einer konzentrierten Lösung eingedampft [26, 27, 30]. Nach der Extraktion und Konzentrierung wurde die Sprühtrocknungstechnologie verwendet und das Verfahren gegenüber dem vorherigen Artikel modifiziert. Wasser wurde schnell aus dem flüssigen Dampf entfernt, und dann wurden Trockenextrakte von Rohstoffen aus Pflanzen gewonnen. In diesem Schritt wird die Zugabe von Maltodextrin als üblicher Träger angesehen, um die Dispersion zu verbessern und die Lagerzeit zu verlängern. Durch eine Reihe von Herstellungsprozessen wurden Kräuterpflanzen dann mit Zusatzstoffen zu Rezepturgranulaten gepresst. Dieser Schritt der Zugabe von Exzipienten war nicht im Experiment enthalten. Im Allgemeinen umfasst unser Produktionsprozess die Extraktion, Konzentration und Sprühtrocknung, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben, parallel zu einem Rezepturgranulat-Produktionsprozess. Um diese Halbzeuge herzustellen, müssen die oben genannten drei Schritte befolgt werden. Das Verfahren zur Bildung von WEs umfasst Konzentration und Sprühtrocknung, was leicht zum Verlust von wärmeempfindlichen Komponenten führt, aber HRs werden nach Extraktion und Trocknung von HMs erhalten. Wir fragen uns, ob es möglich ist, dass aktive Komponenten in HRs verbleiben. Nach unseren Ergebnissen reduzierte sich der Gehalt an Verbascosid signifikant von HMs zu WEs und HRs ( bzw. ). Die thermische Stabilität von Verbascosid wird untersucht, indem die Änderungen in der Peakfläche durch HPLC während des Erwärmungsprozesses überwacht werden. Nach 4-stündigem Erhitzen verbleiben 41,6 % Verbascosid. Es weist darauf hin, dass Verbascosid thermosensitiv ist [31]. Isoacteosid, Tubulosid A und Echinacosid in WEs blieben nach komplexen Verarbeitungsverfahren stabil. Während des Langzeittrocknungsprozesses zeigte die Akkumulation von PhGs einen signifikanten Rückgang, was auf den thermischen Abbau dieser thermosensitiven Komponenten zurückzuführen sein könnte [32]. Bei den anderen Zielkomponenten unterschieden sich HR und WE mit Ausnahme von Verbascosid nicht signifikant. Unser Verständnis dieses Unterschieds wird es uns ermöglichen, in Zukunft bessere Qualitätsstandards für Kräuterrückstände zu entwickeln und diese in Produkten weiterzuentwickeln.

Tabelle 1 Inhalt von 11 Chargen von C. tubulosa

Tabelle 2 Inhaltsvergleich der Hauptkomponenten (n = 11).

,

Abbildung 4 Inhaltsbestimmung von fünf Komponenten aus verschiedenen Formen (n = 11). , ns: nicht signifikant.

3.1.4. Fingerabdruck-Ähnlichkeitsanalyse

Die Ähnlichkeiten zwischen den drei C. tubulosa-Gruppen wurden bewertet. Die Ähnlichkeitswerte Kräutermaterial-Wasserextrakt, Kräutermaterial-Kräuterrückstand und Wasserextrakt-Kräuterrückstand lagen in den Bereichen 0,943–0,994, 0,847–{ {9}}.995 bzw. 0.938–1.000 (Tabelle 3).

Tabelle 3 Ähnlichkeiten von HM-WE, HM-HR und WE-HR für 11 Chargen von C. tubulosa.

3.2. Testergebnisse der antioxidativen Aktivität

Die antioxidativen Aktivitäten der verschiedenen Formen von C. tubulosa wurden unter Verwendung der DPPH-, und Abfangkapazitäts-Assays bestimmt, und die relevanten Ergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt. In Tabelle S8 waren die Bereiche für die DPPH- und Abfangkapazitäts-Assay-Ergebnisse { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 und 0,32–27,65 mg/ml für die drei verschiedenen Formen unter den 11 Chargen von C. tubulosa. In drei Antioxidans-Aktivitätstests zeigten HMs und WEs eine enge Hemmungsaktivität, während HRs die schwächste Hemmung zeigten.

Es wurde festgestellt, dass die sprühgetrockneten WEs sogar bei niedrigen Konzentrationen signifikante Aktivitäten zeigten. Ein früherer Bericht deutete darauf hin, dass eine sprühgetrocknete Vernonia amygdalina WE bei 0,17 mg/ml eine 50-prozentige Abfanghemmung erreichte [33]. Die Anwendung langer Extraktionszeiten und hoher Temperaturen ist ein zweischneidiges Schwert. Einerseits verbessert die Erhöhung der Extraktionszeit und der Einlasstemperatur der Sprühtrocknung die Ausbeute und Effizienz. Darüber hinaus erreichen die Extrakte eine starke antioxidative Aktivität und höhere Konzentrationen an biologischen Komponenten als diese Pflanzen [34]. Andererseits baut zu heiße Einlassluft die bioaktiven Verbindungen ab. Solche erhöhten Lufteinlasstemperaturen führten zu Verlusten der antioxidativen Aktivität des Bidens-pilosa-Extrakts und wurden einer Abnahme der phenolischen Verbindungen zugeschrieben [35]. Die vorliegenden Ergebnisse stimmen mit dem oben genannten Bericht überein. Zum Beispiel zeigte das WE in S6 schwächere radikalhemmende Fähigkeiten als sowohl HM als auch HR. Darüber hinaus zeigte HR in S5 stärkere Fähigkeiten zum Abfangen von DPPH- und Superoxid-Anionen als HM und WE. Die Struktur von PhGs besteht aus glykosidischen Bindungen und Acetylgruppen, die unter enzymatischer Einwirkung leicht hydrolysiert oder bei hohen Temperaturen zersetzt werden. Diese Reaktionen können für Abnahmen einiger Hauptkomponenten während der großtechnischen Produktion verantwortlich sein. Die Hydrolyse oder Isomerisierung bestimmter Komponenten könnte jedoch die Synthese anderer Komponenten beschleunigen. Solche Transformationen sind bei der Verarbeitung von Cistanches-Kräutern üblich [36–38]. Da PhGs wasserlöslich sind, können die meisten biologischen Komponenten durch Wasserextraktion genutzt werden. Die Behauptung, dass der Großteil der aktiven Komponenten in WE verbleibt, hält sich seit Jahrzehnten, sodass die Annahme naheliegt, dass die feuchten Reststoffe nach der Extraktion entsorgt werden können. Es ist jedoch falsch, HRs von C. tubulosa als Abfall zu betrachten. Forscher weisen darauf hin, dass PhGs instabil und anfällig für enzymatischen oder hydrolytischen Abbau sind [39]. Hydrolyse- oder Isomerisierungsreaktionen, die zu einer Verringerung biologischer Inhaltsstoffe in Phytopharmaka während der Verarbeitung beitragen, könnten gleichzeitig neue Möglichkeiten für die Nutzung von HRs bieten. Durch die Umstellung traditioneller Extraktionsmethoden können Arzneimittelrückstände besser erschlossen und verwertet werden. Es wurde eine enzymatische Hydrolyse durchgeführt, um den Panax-Ginseng-Rückstand in Monozucker umzuwandeln. Die Ausbeute an Polysacchariden und Ginsenosiden wie Zucker, Bernsteinsäure, Ginseng-Polysacchariden und Ginsenosiden stieg [40]. Rückstände von Sophora flavescens werden durch Ultraschallwellen mit Ethylacetat reextrahiert [41]. Die aktualisierten Technologien zur Verwertung pflanzlicher Reststoffe werden von Huang et al. [42].

Basierend auf den PLSR- und BCA-Ergebnissen wurden die obersten fünf Peaks verschiedener Formen unter Verwendung von DPPH-, Superoxidanion- und Hydroxylradikal-Abfangassays gescreent, um die wichtigsten Peaks zu identifizieren. Die Ergebnisse sind im Venn-Diagramm dargestellt (Abbildung 7). A2, A6, A8 und A10 sind die gemeinsamen Peaks, die von HM, WE und HR (Figuren 7(a) und 7(c)) in den Superoxid-Anionen- und Hydroxylradikal-Abfangtests geteilt werden, während HM, WE und HR teilen keine DPPH-Assay-Peaks. Unterdessen zeigen die BCA-Modelle, dass A1, A2, A3 und A6 die gemeinsamen Peaks von HM, WE und HR sind (Abbildungen 7(d)–7(f)). Insbesondere die Überschneidungen im Venn-Diagramm weisen darauf hin, dass das BCA-Modell geeigneter erscheint als das PLSR-Modell, da ersteres mehr Wiederholungen aufweist. Die BCA-Modellkoeffizienten und die IC50-Werte der antioxidativen Fähigkeit wurden mittels RDA analysiert. Wie die in Fig. 8 gezeigten RDA, A1, A3 und A6 von HM und HR stehen in positiver Beziehung zu den Antioxidantien-Indizes, außer dass A3 in negativer Beziehung zu der Hydroxylradikal-Abfangkapazität steht. A1 und A6 von WE haben starke Korrelationen mit DPPH und dem Superoxidanion. Die von den verschiedenen Formen festgestellten A6-Peaks zeigen die stärkste Verbindung zu DPPH, Superoxidanion und Hydroxylradikalen. Auch A1 und A3 weisen eine ähnliche Verbindung auf.

Abbildung 7

Venn-Diagramme des PLSR- und BCA-Modells: (a) DPPH-Assay. (b) Auffangassay. (c) Abfangassay wurden durch das PLSR-Modell analysiert. (d) DPPH-Assay. (e) Auffangassay. (f) Abfangassay wurden mit dem BCA-Modell analysiert. Der überlappende Abschnitt war der gemeinsame Peaks-Shard von HM, WE und HR.

3.4. Netzwerk Pharmakologie-basierte Analyse

3.4.1. Bau des CT-Netzwerks

Aus der GeneCards-Datenbank und der OMIM-Datenbank wurden insgesamt 4359 Ziele im Zusammenhang mit der antioxidativen Aktivität erhalten. Gleichzeitig wurden aktive Komponenten aus der TCMSP-Datenbank und der SwissTargetPrediction-Datenbank gesichtet. Dann wurden 198 Ziele gesammelt und durch die UniPort-Datenbank standardisiert. Es gab 159 Zielgene, die aktive Komponenten und Krankheiten im Zusammenhang mit Antioxidantien gemeinsam hatten (siehe Abbildung S1). Das CT-Netzwerk wurde konstruiert, um die Korrelation zwischen den Verbindungen und den Schlüsselgenzielen zu veranschaulichen (Abbildung 9).

Abbildung 9 CT-Netzwerk. Das Netzwerk zeigte die Korrelation zwischen aktiven Komponenten und den wichtigsten Genzielen.

3.4.2. Aufbau des PPI-Netzwerks und Screening von Schlüsselzielen

PPI wurde mithilfe der STRING-Datenbank visualisiert (Abbildung 10). Das Netzwerk umfasste 159 Knoten und 2528 Kanten. Im gesamten Interaktionsnetzwerk können die Verbindungskomponenten oder die Knoten mit mehr Zielpunkten die Schlüsselkomponente oder das Zielgen sein, das in C. tubulosa eine antioxidative Rolle spielt. Die Ergebnisse wurden heruntergeladen und zur Visualisierung in Cytoscape eingeführt. Je höher der DC-Wert, desto dunkler die Farbe und je größer der kombinierte Score-Wert, desto dicker die Kante. Wir fanden heraus, dass RAC-alpha-Serin/Threonin-Proteinkinase (AKT1), Interlukin-6 (IL6), Tumornekrosefaktor (TNF) und vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor A (VEGFA) zentral lokalisiert waren (Abbildung 11). was darauf hindeutet, dass sie wichtige Ziele waren, wenn aktive Komponenten eine antioxidative Wirkung ausübten. Es wird berichtet, dass Echinacosid die mitochondriale Dysfunktion durch die Regulierung von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) und AKT und ihren phosphorylierten Formen reduziert [43]. Die Forscher spekulierten, dass die antidiabetische Wirkung von Glykosiden von C. tubulosa auf die antioxidative Aktivität von PhGs zurückzuführen sein könnte, indem sie proinflammatorische Zytokine wie IL-6 und TNF- herunterreguliert [44]. Darüber hinaus könnte Echinacosid das Wachstum von Eierstockkrebszellen beeinträchtigen, indem es die Expression von VEGFA herunterreguliert, um die Angiogenese zu hemmen [45], was eng mit dem ROS-System korreliert, da ROS die Expression von VEGF-Signalen induziert [46].

Abbildung 10 PPI-Netzwerk.

3.4.3. Anreicherungsanalyse und CTP-Netzwerkaufbau

Die potentiellen antioxidativen Verbindungen wirkten auf zahlreiche biologische Funktionen, einschließlich BP, CC und MF. In Abbildung 12(a) sind die 10 wichtigsten Pfade dargestellt. Die vorhergesagten Ziele aus dem PPI-Netzwerk reagierten hauptsächlich auf viele biologische Prozesse, wie organische zyklische Verbindungen, xenobiotische Stimuli, anorganische Substanzen, Sauerstoffgehalte und positive Regulierung der Bewegung von Zellkomponenten. Die Analyse der Zellkomponenten zeigte, dass die Gene hauptsächlich mit dem Membranfloß, der extrazellulären Matrix, dem sekretorischen Granulalumen, dem Transkriptionsregulatorkomplex und dem apikalen Teil der Zelle verwandt waren. Diese Ziele sind auch an vielen molekularen Funktionen beteiligt, einschließlich der DNA-bindenden Transkriptionsfaktorbindung, Protein-Homodimerisierungsaktivität, Proteindomänen-spezifischen Bindung und Zytokinrezeptorbindung.

Abbildung 12 Anreicherungsanalyse: (a) GO-Anreicherungsanalyse. (b) KEGG-Anreicherungsanalyse.

Um die biologischen Funktionen dieser wichtigen Knotenpunkte zu untersuchen, wurde eine Weganreicherungsanalyse durchgeführt. Aus den Ergebnissen der KEGG-Anreicherung wurde ein Blasendiagramm gezeichnet, um die 20 wichtigsten Wege zu zeigen. Je größer der Fleck war, desto mehr Gene wurden in den Signalweg eingeschlossen. Wie in Abbildung 12(b) gezeigt, waren die Schlüsselwege von C. tubulosa mit Wegen bei Krebs, Lipid- und Atherosklerose, dem AGE-RAGE-Signalweg bei diabetischen Komplikationen, der chemischen Karzinogenese – Rezeptoraktivierung und dem MAPK-Signalweg verwandt. Die Wirkungen von C. tubulosa auf die Apoptose und die zelluläre Redox-Homöostase wurden untersucht. Die Daten legen nahe, dass C. tubulosa ein vielversprechender Kandidat für eine Anti-Darm-Krebs-Therapie sein kann [47]. C. deserticola-Extrakt wird bei älteren Menschen gefunden [48].

Fig. 13 veranschaulicht die Korrelation zwischen den Wegen und ihren verwandten Zielen und die Beziehung zwischen den überlappenden Zielgenen und biologisch aktiven Komponenten von C. tubulosa. Es wurde eine globale Ansicht des CTP-Netzwerks erstellt, die aus 12 Inhaltsstoffen, 159 Zielen und 20 Signalwegen bestand. Die meisten Ziele wurden von den Wirkstoffkandidaten geteilt. Diese Wirkstoffkandidaten mit hohem Vernetzungsgrad waren für die hohe Vernetzung des CTP-Netzwerks verantwortlich, insbesondere Quercetin (Grad = 131). Die Mehrheit der Ziele, wie AKT1, IL6, TNF und VEGFA, wurden KEGG-Signalwegen zugeordnet, die mit Signalwegen bei Krebs assoziiert sind.

Abbildung 13 CTP-Netzwerk.

4. Schlussfolgerung

In dieser Studie untersuchten wir hauptsächlich komplexe Situationen, wenn wir die Spektrum-Wirkungs-Beziehungen zwischen HM, WE und HR von betrachtetenC. tubulosa. Die HPLC-Fingerabdrücke undAntioxidans-Assayswurden verwendet, um die Unterschiede zwischen Hs, WEs und HRs von zu identifizierenC. tubulosa. Gemäß den HPLC-Fingerabdrücken waren 11 Peaks unter den 11 Chargen von Hs, WEs und HRs gemeinsam. Geniposidinsäure,Echinacosid, verbascosid, Tubulosid A, UndIsoacteosidwurden unter diesen Spitzen identifiziert. Die Gehalte dieser fünf Komponenten wurden bestimmt. Hinzu kommt die antioxidative Wirkung derC. tubulosaHs, WEs und HRs variierten aufgrund der Änderungen in den chemischen Zusammensetzungen, die durch komplexe Herstellungsbedingungen verursacht wurden. Basierend auf diversifizierten statistischen Modellen zeigte die Spektrum-Effekt-Beziehungsstudie, dass Peak A6 die entscheidende Komponente unter den drei Formen von sein könnteC. tubulosa. Die Studie basierte auf Netzwerkpharmakologie, um potenzielle Mechanismen von zu untersuchenC. tubulosaAnAntioxidationdurch Screening von Verbindungen, Vorhersage von Schlüsselzielen, Aufbau von Netzwerken und Durchführung von Anreicherungsanalysen. Unsere Ergebnisse liefern eine theoretische Grundlage für das Recycling der pflanzlichen Reststoffe und das Potenzial vonC. tubulosabei der Behandlung vonantioxidative Erkrankungen.