ACKR4a induziert Autophagie, um die NF-kB-Signalübertragung und Apoptose zu blockieren und so eine Vibrio-Harveyi-Infektion zu erleichtern

ZUSAMMENFASSUNG

Autophagie und Apoptose sind zwei anerkannte Mechanismen der Resistenz gegen bakterielle Invasionen. Allerdings haben auch Bakterien die Fähigkeit entwickelt, sich der Immunität zu entziehen. In dieser Studie identifizieren wir ACKR4a, ein Mitglied einer atypischen Chemokinrezeptorfamilie, als Suppressor des NF-kB-Signalwegs, der mit Beclin-1 zusammenarbeitet, um Autophagie zu induzieren, die NF-kB-Signalübertragung zu hemmen und die Apoptose zu blockieren, was die Apoptose erleichtert Vibrio-Harveyi-Infektion. Mechanistisch gesehen aktiviert V. harveyi-induziertes Ap-1 die ACKR4a-Transkription und -Expression. ACKR4a bildet mit Beclin-1 bzw. MyD88 einen Komplex, der Autophagie induziert und MyD88 zum Abbau in das Lysosom transportiert, um die Produktion entzündlicher Zytokine zu unterdrücken. Unterdessen blockiert die ACKR4a-induzierte Autophagie die Apoptose durch Hemmung von Caspase8. Diese Studie beweist zum ersten Mal, dass V. harveyi sowohl Autophagie als auch Apoptose nutzt, um der angeborenen Immunität zu entgehen, was darauf hindeutet, dass V. harveyi die Fähigkeit entwickelt hat, die Fischimmunität zu bekämpfen. 

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

EINFÜHRUNG

Das Immunsystem wird im Allgemeinen in angeborene und erworbene Immunität unterteilt, wobei die meisten Organismen zum Überleben in erster Linie auf die angeborene Immunität angewiesen sind.1 Die angeborene Immunität ist ein Abwehrmechanismus, der in Organismen gebildet wird. Es erkennt das Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) über die Mustererkennungsrezeptoren (PRRs), reagiert schnell auf eine pathogene Infektion und schützt den Wirt vor Infektionen.2,3 Als wichtiges PRR sind Toll-like-Rezeptoren (TLRs) wichtig. können ein breites Spektrum an Reaktionen auslösen, von der Phagozytose bis zur Zytokinproduktion, wodurch entzündliche und angeborene Immunantworten weiter verstärkt werden.4 In den meisten Fällen signalisieren TLRs hauptsächlich über einen MyD88--abhängigen Signalweg, der Signale über Kaskadenreaktionen zur Aktivierung des Kerns überträgt Faktor-kappa B (NF-kB).5 NF-kB ist einer der Schlüsselfaktoren bei der Auslösung der angeborenen Immunität und ist wesentlich für die Koordination der Entzündungsreaktion, der angeborenen Immunität, der Zelldifferenzierung, der Proliferation und des Überlebens gelten als Hauptauslöser der Entzündungsreaktion.6 Wenn Bakterien den Wirt infizieren, werden nachgeschaltete Effektoren der angeborenen Immunantwort wie Zytokine und Chemokine synthetisiert, die letztendlich zu einer Entzündungsreaktion führen und das Wachstum von Bakterien blockieren. Allerdings haben Bakterien in der Koevolution mit ihren Wirten auch verschiedene Regulierungsstrategien entwickelt, um der Abwehr ihres Wirts zu entgehen und diese zu untergraben.

Es wird angenommen, dass Autophagie und Apoptose die beiden wichtigen Wege gegen die bakterielle Invasion sind.7 Autophagie ist ein konservativer Prozess, der abnormale Proteine ​​zum Abbau in Lysosomen transportiert und eine wichtige Rolle bei der angeborenen Immunität von Eukaryoten gegen die bakterielle Invasion spielt.8,9 Einige Bakterien entziehen sich der Immunität, indem sie bei Säugetieren Autophagie nutzen. Normalerweise zielen Zellen darauf ab, eindringende extrazelluläre Bakterien und sich im Zytoplasma ansiedelnde Bakterien durch Autophagie zu entfernen,10 aber einige Bakterien können die Autophagie „kapern“, um ihr Selbstwachstum und ihre Reproduktion abzuschließen.11–13 Beispielsweise Unc-51-wie Kinase 1 (ULK1), Beclin1, Microtubule-associated Protein Light Chain 3 (LC3) und Autophagy-Related Proteins (ATGs) kooperieren, um Autophagosomen zu bilden, die eindringende Mikroorganismen einkapseln und zum Abbau zu Lysosomen transportieren.14–16 Allerdings ist Mycobacterium tuberculosis zurückgegangen -reguliert Beclin-1, um die Bildung von Autophagosomen zu verhindern, wodurch letztlich die Autophagie gehemmt und Infektionen gefördert werden.17 Im Gegensatz zur Hemmung der Bildung von Autophagosomen verwenden einige Bakterien Autophagosomen, um sich selbst replizierende Stellen zu vervollständigen und so die Proliferation zu fördern.11,18 Darüber hinaus Autophagie, Apoptose ist auch ein Mittel zur Abwehr des Wirts gegen eindringende Krankheitserreger.7 Apoptose ist ein Zelltodmuster, das zur Entfernung beschädigter Zellen verwendet wird, um die Stabilität der systemischen Umgebung aufrechtzuerhalten.19 Sobald der Wirt ein Signal einer bakteriellen Invasion erhält, induziert er die Apoptose der Infizierten Zellen, um bakterielle Infektionen zu hemmen.20 Daher hängt eine erfolgreiche bakterielle Kolonisierung von ihrer Fähigkeit ab, Apoptose zu verhindern und die bakterielle Replikation zu schützen. Beispielsweise sichert Edwardsiella tarda sein Überleben, indem es die Apoptose nach der Infektion von Zebrafisch-ZF4-Zellen hemmt,21Shigella erreicht eine erfolgreiche Kolonisierung durch Hemmung der Apoptose,22 und das von Streptokokken der Gruppe A (GAS) produzierte S-Protein bindet an die Erythrozytenmembran, um der Erkennung durch das Wirtsimmunsystem zu entgehen System.23 Obwohl nachweislich viele Bakterien die Fähigkeit entwickelt haben, sich der Immunität zu entziehen, gibt es einige Berichte über marine Krankheitserreger. Vibrio harveyi gehört zur Familie der Vibrionaceae, die als hochpathogener Erreger von Meeresfischen gilt; Es verursacht Gastroenteritis, Muskelnekrose und Hautgeschwüre und ist eine der Hauptursachen für das Sterben von Meeresfischen.24

Cistanche-Pflanze stärkt das Immunsystem

Mit Ausnahme von Autophagie und Apoptose können einige Bakterien (z. B. Staphylococcus aureus) sogar die Chemokinrezeptoren ihres Wirts nutzen, um der Immunität zu entgehen.25 Chemokinrezeptoren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die hauptsächlich auf der Oberfläche von Leukozyten vorkommen. Sie enthalten sieben Transmembranstrukturen, die an der Ligandenbindung und Signalübertragung beteiligt sind und eine Schlüsselrolle bei der Auslösung und Aufrechterhaltung von Immun- und Entzündungsreaktionen spielen.26 Mit fortschreitender Chemokinforschung wurden atypische Chemokinrezeptoren (ACKRs) entdeckt.27 ACKRs sind es jedoch Obwohl sie anderen Chemokinrezeptoren strukturell ähnlich sind und Liganden internalisieren können, können sie aufgrund des Fehlens der DRYLAIV-Domäne, die auch als „stiller Rezeptor“ bezeichnet wird, den Signaltransduktionsweg nicht aktivieren.28 Die Funktion von ACKRs kann auf folgende Weise widergespiegelt werden : 1. Sie können mit typischen Rezeptoren um die Bindung von Chemokinen konkurrieren und dadurch die Signaltransduktion der Zellchemotaxis regulieren; 2. Durch die Internalisierung von Chemokinen in Zellen wird die Konzentration von Chemokinen in der Umgebung verringert, um die Zellrekrutierung zu beeinflussen und als Chemokinfänger zu fungieren. 3. Sie unterstützen Chemokine dabei, den zellübergreifenden Transport durch die Stromazellbarriere abzuschließen.29 Die ACKR-Familie umfasst hauptsächlich DARC,30 D6 31,32, CXCR7,33 und CCRL1,34 CCRL1 ist auch als atypischer Chemokinrezeptor bekannt 4 (ACKR4). Derzeit haben einige Studien gezeigt, dass ACKR4 die Signaltransduktion über den G-Protein-unabhängigen Weg zu realisieren scheint35–37 und dass es eine nicht-redundante Rolle bei der Kontrolle von Entzündungen und Immunantworten spielt.38 Seine Rolle bei der adaptiven Immunität ist gut bekannt, aber seine Die Funktion der angeborenen Immunität wird selten untersucht.

Bei der angeborenen Immunität ist die Signalübertragung des TLR-Signalwegs von Wirbellosen bis hin zu Säugetieren stark konserviert. Als Kernprotein der TLR-Signalübertragung wurde MyD88 umfassend bei Wirbeltieren untersucht. Darüber hinaus könnten seine Homologen in Fischen aufgrund der hochkonservierten Struktur von MyD88 ähnliche Funktionen wie in Säugetieren haben.39,40 Im Zebrafisch ist MyD88 an der Beseitigung bakterieller Infektionen beteiligt.41 Frühere Studien haben auch bestätigt, dass V. harveyi entgeht der Immunität, indem es die Signalübertragung von MyD88 zerstört.42 Allerdings sind die Mechanismen, wie V. harveyi der Immunität bei Knochenfischen entgeht, noch wenig verstanden. In dieser Studie wurde ACKR4a in V. harveyi-stimuliertem Miichthys muy schnell hochreguliert. Das hochregulierte ACKR4a unterdrückte sowohl die angeborene Immunität, indem es Autophagie induzierte, um den MyD88-vermittelten NF-kB-Signalweg zu blockieren, als auch Autophagie induzierte, um die Apoptose zu blockieren und so die Infektion mit V. harveyi zu verstärken. Nach unserem besten Wissen ist dieser Bericht der erste, der klarstellt, dass V. harveyi sowohl Autophagie als auch Apoptose nutzt, um der angeborenen Immunität zu entgehen.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

ERGEBNISSE

Eine V. harveyi-Infektion induziert die ACKR4a-Expression, um die Selbstproliferation zu fördern

Um Gene zu identifizieren, die möglicherweise an der Regulation der V. harveyi-Infektion beteiligt sind, behandelten wir miiuy croaker 48 Stunden lang mit V. harveyi und verwendeten dann eine RNA-Seq-Analyse, um die verschiedenen Expressionsgene (DEGs) zwischen behandeltem und unbehandeltem V. harveyi zu screenen Milzproben. Aus den Deep-Sequencing-Daten identifizierten wir 145 hochregulierte Gene und 28 0 herunterregulierte Gene (Abbildung 1A). Auf dieser Grundlage wählten wir die 10 größten und 10 kleinsten DEGs (log2 der Faltungsänderung betrug 1,0) für die Clustering-Heatmap aus und das Ergebnis zeigte, dass die jeweiligen Proben sowohl in den mit V. harveyi behandelten als auch in den unbehandelten Proben gut repliziert wurden (Abbildung 1B). . Die ACKR4a-mRNAs wurden untersucht und es wurde festgestellt, dass sie nach einer V. harveyi-Infektion im M-Music-Gehirn stark exprimiert werden (Abbildung S1A). Daher wurde die M. muiiy-Gehirnzelllinie (MBrC) für nachfolgende Experimente verwendet. Die Knockdown-Effizienz von ACKR4a-si1 beträgt 46,1 % und ACKR4a-si2 63,7 % in MBrC (Abbildung S1B), daher wurde ACKR4a-si2 (genannt ACKR4a-si) für nachfolgende Experimente verwendet. Anschließend konzentrierten wir uns auf das Gen ACKR4a, das möglicherweise eine Immunfunktion hat, und die Testergebnisse der koloniebildenden Einheiten (CFU) zeigten, dass ACKR4a die Proliferation von V. harveyi förderte (Abbildungen 1C, 1D und S1C). Um den Mechanismus, durch den ACKR4a die Proliferation von V. harveyi fördert, weiter zu untersuchen, wurde das Expressionsmuster von ACKR4a analysiert. ACKR4a in MBrC-Zellen wurde durch V. harveyi reguliert. Die Ergebnisse zeigten einen zeitabhängigen Verlauf der V. harveyi-Infektion sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene (Abbildungen 1E und 1F). Darüber hinaus unterdrückte die ACKR4a-Stummschaltung wirksam die Expression von ACKR4a sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene (Abbildungen 1E und 1G). Die obigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hochregulierung von ACKR4a eine Infektion mit V. harveyi erleichtern kann.

Abbildung 1. V. harveyi-induziertes ACKR4a erleichtert seine Selbstproliferation

ACKR4a hemmt die durch V. harveyi ausgelöste NF-kB-Signalübertragung 

Wir fanden heraus, dass die Zellproliferationsrate beeinflusst wurde, wenn MBrC mit V. harveyi infiziert war, und um diesen Befund zu überprüfen, führten wir Zellproliferationstests durch. Die Ergebnisse zeigten, dass eine V. harveyi-Infektion die Proliferation von MBrC verringerte (Abbildung S1D). Nachfolgende Experimente haben bestätigt, dass die Überexpression von ACKR4a die Zellproliferation reduziert, während die Stummschaltung von ACKR4a die Zellproliferation verstärkt (Abbildung 2A und S1E). Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Aktivierung von NF-kB die Zellproliferation fördert. Es wurde festgestellt, dass BAY 11–7082, der Inhibitor von NF-kB, auch die Proliferation von MBrC reduzieren kann (Abbildung 2A und S1E). Ähnlich wie in früheren Berichten43 war der Anstieg von NF-kB-luc zeitabhängig mit der V. harveyi-Infektion verbunden (Abbildung S1F).

Abbildung 2. ACKR4a hemmt die durch V. harveyi ausgelöste NF-kB-Signalisierung

Um die Wirkung von ACKR4a auf die durch V. harveyi ausgelöste NF-kB-Signalübertragung weiter zu bestimmen, wurde ein Luciferase-Reporter-Assay durchgeführt. ACKR4a hemmte die durch V. harveyi und LPS ausgelöste NF-kB-Luciferase-Aktivität signifikant; Die durch V. harveyi ausgelöste IL-1b- und TNFa-Luciferase-Aktivität wurde auch durch ACKR4a gehemmt (Abbildungen 2B–2D). Endogenes ACKR4a wurde zum Schweigen gebracht, um seine Rolle bei der angeborenen Immunität zu bestätigen. Anschließend wurden die Expressionsmuster von p65 und proinflammatorischen Zytokinen (IL-1b und TNFa) weiter erfasst, wobei ACKR4a drastisch erhöhte p65-mRNAs, IL-1b-mRNAs und TNFa-mRNAs zum Schweigen brachte (Abbildungen 2E–2G). ). Die Ergebnisse in MLC und MKC zeigten auch, dass ACKR4a die NF-kB-Signalübertragung hemmen könnte (Abbildungen S1G–S1J). Auch die ELISA-Ergebnisse waren ähnlich; Die Stummschaltung von ACKR4a erhöhte TNFa signifikant und die Überexpression von ACKR4a hemmte TNFa (Abbildung 2H). Um die Aktivierung von NF-kB zu bewerten, ist es notwendiger, die transliterierte Form, also phosphoryliertes NF-kB, zu analysieren, und sie ist ein Maß für die NF-kB-Aktivität auf Zielgenen. Bei Stimulation von NF-kB wird p65 phosphoryliert und gelangt in den Zellkern, um die Transkription entzündungsfördernder Zytokine zu regulieren. Um die Regulation der p65-Phosphorylierung durch ACKR4a zu untersuchen, haben wir den Phosphorylierungsgrad von p65 nach ACKR4a-Stummschaltung und ACKR4a-Überexpression mittels Immunoblot gemessen. Eine V. harveyi-Infektion verstärkte die p65-Phosphorylierung, was bewies, dass V. harveyi NF-kB effektiv aktivierte. Auf dieser Grundlage verstärkte die Stummschaltung von ACKR4a die p65-Phosphorylierung, wohingegen die Überexpression von ACKR4a die p65-Phosphorylierung verringerte, was darauf hinweist, dass ACKR4a ein Inhibitor der NF-kB-Signalübertragung ist (Abbildungen 2I und 2J). Bei Zebrafischen erhöhte der Abbau von ACKR4a die Phosphorylierung von p65. Darüber hinaus zeigte der CFU-Assay, dass BAY 11–7082 die Proliferation von MBrC signifikant steigerte (Abbildung 2K). Insgesamt legen diese Daten nahe, dass ACKR4a als negativer Regulator der NF-kB-Signalübertragung fungiert, um die angeborene Immunität während einer V. harveyi-Infektion zu hemmen.

Abbildung 3. ACKR4a interagiert mit MyD88 und fördert den Abbau von MyD88 in der Autophagie

ACKR4a interagiert mit MyD88 und fördert MyD88 für den autophagischen Abbau

Als nächstes versuchten wir herauszufinden, welches Ziel in der NF-kB-Signalübertragung die unterdrückende Funktion von ACKR4a0 vermittelt. Der NF-kB-Luciferase-Reporter-Assay ergab, dass eine Überexpression von ACKR4a zu einer Verringerung der Luciferase-Aktivität führte, die dosisabhängig durch MyD88 induziert wurde (Abbildung 3A). Eine Überexpression von ACKR4a zeigte jedoch keinen Einfluss auf die durch TRAF6 oder TAK1 gesteuerte Luciferase-Aktivität (Abbildungen 3B und 3C). Ein Immunoblot-Ergebnis ähnelte dem Luciferase-Reporter-Assay; Die Überexpression von ACKR4a hemmte MyD88 dosisabhängig, es gab jedoch keine Auswirkung auf TRAF6 und TAK1 (Abbildung 3D). Diese Ergebnisse legen nahe, dass ACKR4a auf der MyD88-Ebene funktioniert.

Alle TLRs von Säugetieren, mit Ausnahme von TLR3, sind zumindest teilweise auf den MyD88-Adapter angewiesen, um Signale zu übertragen, was die direkte Regulierung von MyD88 effektiver macht.44 Anschließend untersuchten wir die Expression von MyD88 zu verschiedenen Zeitpunkten der V. harveyi-Infektion und fanden eine Stummschaltung von ACKR4a verstärkte die Expression von MyD88 (Abbildung 3E) und die Überexpression von ACKR4a hemmte die MyD88-Expression zeitabhängig (Abbildung 3F). Ein interessantes Ergebnis war, dass zwar die Stummschaltung von ACKR4a die durch V. harveyi ausgelöste MyD88-Expression verstärkte, diese Verstärkung jedoch nicht vorhanden war, wenn die Zellen ruhten (Abbildungen 3G und 3H). Um den molekularen Mechanismus, der der Wirkung von ACKR4a bei der MyD88--vermittelten NF-kB-Signalisierung zugrunde liegt, besser zu verstehen, haben wir Co-Immunpräzipitationstests (Co-IP) durchgeführt, um zu bestimmen, ob ACKR4a mit MyD88 interagiert. Das Flag-ACKR4a könnte mit Myc-MyD88 immunpräzipitieren (Abbildungen 3I und S1K). In Übereinstimmung damit stellten wir fest, dass Flag-MyD88 mit endogenem ACKR4a interagieren könnte (Abbildung 3J). Nachfolgende subzelluläre Lokalisierungsexperimente zeigten, dass ACKR4a keine signifikante Co-Lokalisierung mit MyD88 aufwies (Abbildung S1L). Somit stützen diese Ergebnisse das Konzept, dass ACKR4a physikalisch mit MyD88 interagiert und dass ihre Interaktion wahrscheinlich im Zytoplasma stattfindet. Als nächstes untersuchten wir den Mechanismus, durch den ACKR4a die MyD88-Expression unterdrückte. Entweder NH4Cl oder 3-Methyladenin (3-MA), Inhibitoren des Autophagie-Lysosomen-abhängigen Abbauwegs, führten in Gegenwart von ACKR4a zu einer signifikanten Akkumulation von MyD88, und MG132 hatte keinen Einfluss auf den Abbau von MyD88 MyD88 (Abbildung 3K). Darüber hinaus zeigten ähnliche Ergebnisse, dass 3-MA und NH4Cl den Abbau von MyD88 dosisabhängig signifikant blockierten (Abbildungen 3L und 3M). Diese Ergebnisse scheinen darauf hinzudeuten, dass die Blockierung der Autophagie den durch ACKR4a gezielten Abbau von MyD88 wirksam verhindert. Der autophagische Fluss bezeichnet den dynamischen Prozess der Autophagie, der ein zuverlässiger Indikator für die autophagische Aktivität ist. Da die GFP-Fluoreszenz im Lysosom gelöscht wird, kann das Stadium der Autophagie anhand der Fluoreszenz von GFP und RFP bestimmt werden.42 Die Beobachtung der gelben Fluoreszenz im Merge-Panel zeigte mehr rote Fluoreszenz in Gegenwart von ACKR4a, was darauf hindeutet, dass ACKR4a die Fusion von förderte Autophagosomen und Lysosomen; wohingegen der Autophagiehemmer Chloroquin (CQ) die Fusion von Autophagosomen und Lysosomen verhinderte und eine stärkere gelbe Fluoreszenz zeigte (Abbildung 3N). Um weiter zu bestätigen, dass ACKR4a auf MyD88 für den autophagischen Abbau abzielt, wurde ein lysosomaler Lokalisierungstest durchgeführt. MyD88 (grün) und Lysosomen (rot) wurden in MBrC-Zellen gemeinsam lokalisiert (Abbildung 3O), was darauf hindeutet, dass MyD88 zu Lysosomen transportiert wurde. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass ACKR4a mit MyD88 interagiert und MyD88 für den autophagischen Abbau angreift.

Abbildung 4. ACKR4a ist über Beclin an der Regulierung der Autophagie beteiligt-1

ACKR4a ist über Beclin an der Regulierung der Autophagie beteiligt-1

Einige Bakterien nutzen Autophagie, um ihr Wachstum und ihre Infektion zu fördern. Ihre Replikation wird reduziert, wenn Autophagie fehlt.13 Um zu testen, ob V. harveyi an der Regulierung der Autophagie in MBrC-Zellen beteiligt ist, wurden Zellen mit V. harveyi infiziert und anschließend das Expressionsmuster ermittelt von LC3 wurde untersucht. In MBrC-Zellen erhöhte die V. harveyi-Exposition die Autophagie, was durch die Akkumulation von GFP-LC3-Punkten angezeigt wurde, was mit einem zeitabhängigen Anstieg der V. harveyi-Infektion einherging (Abbildung 4A). Die Überexpression von ACKR4a verstärkte die durch V. harveyi induzierte Autophagie, was durch einen bemerkenswerten Anstieg der puncta-Ansammlungen von RFP-LC3 gezeigt wurde, im Gegensatz zur Stummschaltung von ACKR4a, die die durch V. harveyi induzierte Autophagie deutlich reduzierte (Abbildungen 4B und 4C). Darüber hinaus führte die Stummschaltung von ACKR4a zu einer Verringerung der durch V. harveyi induzierten LC3-II-Expression (Abbildung 4D).

ULK1, Beclin-1 und ATG5 waren die wichtigsten regulatorischen Proteine ​​der Autophagie. qPCR-Ergebnisse zeigten, dass ACKR4a die Expression von Beclin-1 signifikant steigerte, nicht jedoch ULK1 und ATG5 (Abbildung 4E). Der Luciferase-Reporter-Assay von ULK1, ATG5 und Beclin-1 ergab, dass eine Überexpression von ACKR4a nur zu einem Anstieg der Beclin-1-Luciferase-Aktivität führte (Abbildung 4F). Als nächstes stellten wir fest, dass die Überexpression von ACKR4a die Expression von Beclin-1 steigerte, nicht jedoch die Expression von ULK1 und ATG5 (Abbildung 4G). Außerdem wurde die ACKR4a-induzierte Autophagie durch Beclin-1-si gehemmt, während ATG5-si nur eine teilweise Hemmung aufwies (Abbildung 4H). Die obigen Ergebnisse zeigten, dass ACKR4a auf Beclin-1 ausgerichtet war. Daher wurden die Funktion und der Mechanismus von Beclin-1 beim ACKR4a-vermittelten autophagischen Abbau von MyD88 untersucht. Bei mit V. harveyi infizierten Zebrafischen führte der Abbau von ACKR4a nicht zu signifikanten Veränderungen in ULK1, während Beclin-1 und ATG5 deutlich reduziert wurden (Abbildungen S2B–S2D). Beclin-1 verstärkte den ACKR4a-induzierten autophagischen Fluss durch die Behandlung mit Baf1A und CQ weiter (Abbildung 4I), und Beclin-1 verstärkte den Abbau von MyD88 durch ACKR4a (Abbildung 4J). Anschließend führten wir die Co-IP-Assays durch, um zu bestimmen, ob ACKR4a mit Beclin-1 interagiert, und stellten fest, dass ACKR4a mit Beclin-1 interagiert und eine V. harveyi-Infektion die Interaktion zwischen ACKR4a und Beclin{{51) verstärkte }} (Abbildung 4K). Ein lysosomaler Lokalisierungstest zeigte, dass ACKR4a die Fusion des Autophagosoms mit dem Lysosom verstärkte (Abbildung 4L). Anschließend erhöht ACKR4a die endogene Beclin-1-Expression (Abbildung 4M) und ACKR4a-Stummschaltung schwächt die durch V. harveyi induzierte Beclin-1-Expression (Abbildung 4N). Darüber hinaus verstärkte die Beclin-1-Stummschaltung die durch V. harveyi ausgelöste Phosphorylierung von p65, was weiter darauf hindeutet, dass V. harveyi die Autophagie induziert, um die NF-kB-Signalübertragung negativ zu regulieren (Abbildung 4O). Als nächstes versuchten wir, die biologische Bedeutung von Beclin-1 bei der V. harveyi-Infektion zu bestimmen, insbesondere bei der Kontrolle der V. harveyi-Proliferation. Der CFU-Assay wurde durchgeführt und ergab, dass sowohl Beclin-1-Silencing als auch CQ-blockierte Autophagie die Proliferation von V. harveyi reduzierten, was beweist, dass V. harveyi Autophagie nutzt, um seine Proliferation zu fördern (Abbildung 4P). Die obigen Ergebnisse zeigen zusammen, dass ACKR4a Komplexe mit Beclin-1 induziert und bildet, um die Autophagie zu fördern und dann eine V. harveyi-Infektion zu erleichtern.

Vorteile von Cistanche für Männer: Stärkung des Immunsystems

Klicken Sie hier, um die Produkte von Cistanche Enhance Immunity anzusehen

【Fragen Sie nach mehr】 E-Mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ACKR4a induzierte Autophagie und blockierte die Apoptose

Der autophagische Zelltod gilt als sinnvolle Alternative zur Apoptose, und Apoptose ist auch ein anerkannter antibakterieller Mechanismus; Erfolgreiche bakterielle Infektionen vervollständigen die Selbstreplikation durch Hemmung der Apoptose.22 Um den Zusammenhang zwischen V. harveyi-induzierter Autophagie und Apoptose zu bestimmen, wurde die Apoptose von MBrC-Zellen mit unterschiedlichen Behandlungen vor und nach der V. harveyi-Infektion bestimmt und die Stummschaltung von ACKR4a erhöhte die V. Harveyi-induzierte Apoptose (Abbildungen 5A und 5B, linkes Feld). Da Caspase3 und Caspase7 bei der Auslösung der Apoptose wichtig sind, gelten sie allgemein als zuverlässige Indikatoren für die Apoptose. Ein Caspase Glo 3/7-Assay zeigte, dass die Überexpression von ACKR4a die durch V. harveyi induzierte Caspase3/7-Aktivität hemmte, wohingegen die Stummschaltung von ACKR4a die durch V. harveyi induzierte Caspase3/7-Aktivität verstärkte (Abbildung 5B, rechtes Feld). V. harveyi und exogen hinzugefügte rekombinante aktive Caspase8-induzierte Caspase3/7-Aktivität wurde durch ACKR4a gehemmt (Abbildung 5C), was darauf hindeutet, dass ACKR4a in der Lage ist, die Apoptose-Signalisierung effizient zu blockieren. Obwohl ACKR4a-induzierte Autophagie nachgewiesen wurde, sind weitere Studien erforderlich, um die Rolle der Autophagie bei der Blockierung der Apoptose zu untersuchen. Wie in Abbildung 5D gezeigt, erhöhte die ACKR4a-Stummschaltung die Effektor-Caspasen (Caspase7) und die Initiator-Caspasen (Caspase8) signifikant. Darüber hinaus inhibierte die Überexpression von ACKR4a Caspase7- und Caspase8-mRNAs (Abbildung 5E), und der Abbau von ACKR4a erhöhte Caspase7 und Caspase8 im Zebrafisch signifikant (Abbildungen S2E und S2F). Frühere Studien haben gezeigt, dass Beclin-1 ein molekularer Schalter ist, der Apoptose- und Autophagieprozesse vermittelt,45 daher wurde die Beteiligung von Beclin-1 an der Regulierung der Apoptose untersucht. In unserer Studie regulierte die Überexpression von Beclin-1 die V. harveyi-induzierte Caspase8 herunter, während Beclin-1 die V. harveyi-induzierte Caspase8 hochregulierte (Abbildung 5F). Ein interessantes Ergebnis war, dass Caspase8 3 Stunden nach der Infektion mit V. harveyi signifikant hochreguliert war; es wurde mit zunehmender Infektionsdauer erneut gehemmt und LC3-II korrelierte negativ mit Caspase8 (Abbildung 5G). Den obigen Ergebnissen zufolge induzierte ACKR4a eine Autophagie, um die apoptotische Signalübertragung zu blockieren und eine Infektion mit V. harveyi zu erleichtern, und Beclin-1 könnte ein potenzielles Ziel in der Kaskade von Autophagie und Apoptose sein.

Abbildung 5. ACKR4a induziert Autophagie, um die Apoptose zu blockieren

Ap-1 verstärkt die ACKR4a-induzierte Autophagie bei einer V. harveyi-Infektion

Anschließend wurde der Mechanismus der durch eine V. harveyi-Infektion induzierten ACKR4a-Expression untersucht. Vier verschiedene ACKR4a-Promotorplasmide wurden zunächst gemäß den Promotorvorhersagesequenzen konstruiert (Abbildung 6A). Der Luciferase-Assay zeigte, dass die ACKR4a-p-3-Aktivität am höchsten war (Abbildung 6B). Um den Upstream-Aktivator der ACKR4a-Expression während einer V. harveyi-Infektion zu identifizieren, wurde die Promotorregion von ACKR4a analysiert und festgestellt, dass ACKR4a potenzielle Bindungsstellen von Sp-1 und Ap-1 aufweist (Abbildung 6C). Der ACKR4a-luc-Assay zeigte, dass Sp-1 die Luciferase-Aktivität nicht steigern konnte und Ap-1 die Luciferase-Aktivität steigerte (Abbildungen 6D und 6E), was die Möglichkeit erhöhte, dass ACKR4a ein direktes Ziel von Ap sein könnte -1. Um dies zu untersuchen, wurden zwei Luciferase-Vektoren konstruiert, die aus mutiertem ACKR4a bestehen (Abbildung 6F). Der Luciferase-Assay zeigte, dass Mutanten ohne Ap-1-Bindungsstellen die Luciferase-Aktivität im Gegensatz zum Wildtyp hemmten (Abbildung 6G). Um zu bestätigen, dass Ap-1 die ACKR4a-Expression fördert, haben wir die Expression von Ap-1 durch Überexpression oder Knockdown zum Schweigen gebracht oder verstärkt, und die ACKR4a-Expression wurde in transfizierten MBrC-Zellen bewertet. Ap-1-Stummschaltung reduzierte die V. harveyi-induzierte ACKR4a-Expression signifikant (Abbildung 6H), wohingegen Ap-1-Überexpression die ACKR4a-Expression signifikant steigerte (Abbildung 6I). Die Immunoblot-Ergebnisse stimmten mit den qPCR-Ergebnissen überein: Die Überexpression von Ap-1 erhöhte die Expression von ACKR4a, während die Stummschaltung von Ap-1 die Expression von ACKR4a verringerte (Abbildung 6J). Die ChIP-Analyse zeigte, dass Ap-1 unter normalen physiologischen Bedingungen an den ACKR4a-Promotor in MBrC-Zellen bindet und die Stimulation durch V. harveyi die Bindung von Ap-1 an den ACKR4a-Promotor verstärkte (Abbildung 6K). Die obigen Ergebnisse bestätigten, dass ACKR4a ein potenzielles Transkriptionsziel von Ap-1 ist. Anschließend wurde die Funktion von Ap-1 bei der Autophagie untersucht; Die Ap-1-Stummschaltung reduzierte effektiv die durch eine V. harveyi-Infektion verursachte Akkumulation von GFP-LC3 (Abbildung 6L) und schwächte auch die durch eine V. harveyi-Infektion verursachte Hochregulierung von LC3-II ab (Abbildung 6M). ). Der CFU-Assay wurde durchgeführt, um die Rolle von Ap-1 bei der V. harveyi-Infektion zu untersuchen und ergab, dass AP-1 die Proliferation von V. harveyi erleichtert (Abbildung 6N). Zusammengenommen deuten die obigen Ergebnisse darauf hin, dass Ap-1 die ACKR4a-Transkription und -Expression aktiviert und zur V. harveyi-Infektion beiträgt.

Abbildung 6. Ap-1 verstärkte ACKR4a-induzierte Autophagie bei V. harveyi-Infektion

Abbildung 7. Ein funktionierendes Modell, wie ACKR4a die Infektion mit V. harveyi erleichtert

DISKUSSION

Es wurde gezeigt, dass ACKRs an mehreren biologischen Prozessen wie der Regulierung des Chemokinsystems, der Internalisierung von Chemokinliganden, dem intrazellulären Abbau und der Entzündungsreaktion beteiligt sind,4,26 was nicht nur für die adaptive Immunität, sondern auch als wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems wichtig ist .33,34 Die Rolle von ACKRs bei der Entzündungsreaktion auf bakterielle Infektionen bei Fischen wurde jedoch nicht untersucht. Diese Studie zeigt zum ersten Mal, dass ACKR4a, ein Mitglied der ACKR-Familie, die Infektion von Knochenfischen mit V. harveyi durch Autophagie und Apoptose fördert. Mechanistisch gesehen wurde die Transkription von ACKR4a durch den Transkriptionsfaktor AP-1 hochreguliert. Dann wurde das hochregulierte ACKR4a mit Beclin-1 synergisiert, um Autophagie auszulösen, und MyD88 zum Abbau zu Lysosomen transportiert. In der Zwischenzeit induziert ACKR4a die Autophagie, um die Apoptose zu blockieren, und erleichtert dann die Infektion mit V. harveyi (Abbildung 7). Die angeborene Immunität spielt eine entscheidende Rolle beim Schutz von Eukaryoten vor endogener und exogener pathogener Invasion.46 Durch die langfristige Exposition gegenüber Mikroorganismen haben Fische eine optimierte angeborene Immunität entwickelt, um sie vor Infektionen zu schützen.47 TLRs erkannten PAMP, wenn eine bakterielle Infektion auftritt. und löste über MyD88-abhängige und unabhängige Wege eine angeborene Immunantwort aus, die die Produktion entzündungsfördernder Zytokine zur Eliminierung bakterieller Infektionen induzierte. MyD88 ist ein wesentlicher Adapter bei der TLR-Signalübertragung. Mit Ausnahme von TLR3 nutzen alle TLRs von Säugetieren MyD88, um die NF-kB-Signalübertragung zu aktivieren.48 Daher ist es möglicherweise am effektivsten, MyD88 direkt zu regulieren. Beispielsweise hemmt S-1-Acetylcystein die IL-6-Produktion, indem es den Abbau von MyD88 induziert. In ähnlicher Weise wurde berichtet, dass IRF3 und eIF3k bei Fischen die NF-kB-Signalübertragung hemmen, indem sie auf MyD88 abzielen.42,49 Es gibt auch Hinweise darauf, dass MyD88 für die Eliminierung bakterieller Infektionen wichtig ist. Beispielsweise konnten Mäuse mit MyD88--Mangel die bakteriellen Bestandteile nicht erkennen und waren sehr anfällig für S. aureus. 50 Darüber hinaus wurde gezeigt, dass MyD88 auch an der Eliminierung bakterieller Infektionen bei Zebrafischen beteiligt ist.41 Die Aktivierung des angeborenen Immunsystems fördert die bakterielle Clearance, die einen großen Selektionsdruck darstellt und sie dazu fördert, die Fähigkeit zur Unterdrückung der angeborenen Immunität zu entwickeln .51,52 Es wurde gezeigt, dass Salmonellen Immunreaktionen regulieren und Entzündungsreaktionen manipulieren können, nachdem sie Wirtszellen infiziert haben. Die Salmonellen-Virulenz SpvC dephosphoryliert irreversibel ERK, p38 und MAPK und hemmt dadurch die Transkription entzündungsfördernder Zytokine.53 In dieser Studie wurde das hochregulierte ACKR4a in mit V. harveyi infizierten M. miiuy mit MyD88 kombiniert, um die p65-Phosphorylierung zu hemmen und die NF-kB-Signalisierung blockieren. Dies deutet darauf hin, dass Bakterien auch die angeborene Immunität von Fischen unterdrücken können, indem sie die Stabilität von Adaptern in der TLR-Signalübertragung zum Zwecke der Immunumgehung beeinträchtigen.

Autophagie und Apoptose sind zwei anerkannte Mechanismen der Resistenz gegen die Invasion von Bakterien, wobei die antimikrobielle Autophagie eine Barriere gegen eindringende Mikroorganismen darstellt. PRRs können in verschiedenen Stadien des Wirt-Bakterien-Kontakts Autophagie auslösen und das intrazelluläre Wachstum von Bakterien hemmen.54 Umgekehrt haben Bakterien auch effiziente Mechanismen entwickelt, um Autophagie zu verhindern, zu bekämpfen oder zu steuern. Bei diesen Mechanismen geht es oft darum, auf Beclin-1 zu zielen, um die Autophagie zu blockieren,55 die Reifung von Autophagosomen zu verhindern56 und in manchen Fällen sogar die Autophagie zu aktivieren, um Nahrung für das Bakterienwachstum bereitzustellen.57 Im Gegensatz dazu stellten wir fest, dass V. harveyi Beclin{{6} induzierte. }aktivierte Autophagie über ACKR4a, das auf MyD88 für den autophagischen Abbau abzielt, wodurch die NF-kB-Signalübertragung blockiert und die Selbstreplikation gefördert wird. Eine weitere Abwehrstrategie ist der programmierte Zelltod (Apoptose), der aktiviert wird, wenn Krankheitserreger Wirtszellen zum Überleben und zur Vermehrung nutzen. Beispielsweise verursacht eine Mykobakterieninfektion von Makrophagen Apoptose, die zur Eliminierung von Bakterien aus Zellen beiträgt.58 Darüber hinaus zerstört die TNF-a-vermittelte Makrophagen-Apoptose die intrazelluläre Umgebung für die Replikation von Mykobakterien und verringert die Wachstumsrate infizierter Mykobakterien.59 Zur Bekämpfung Aufgrund des Überlebensdrucks der Apoptose kodieren viele erfolgreiche Krankheitserreger Gene, deren Produkte die Apoptose in Wirtszellen hemmen und so die Lebensfähigkeit für die Replikation des Krankheitserregers aufrechterhalten.60 Obwohl diese Mechanismen bei Säugetieren gut untersucht wurden, ist wenig über die bakterielle Hemmung der Apoptose bei Fischen bekannt. In unserer Studie spielt die durch V. harveyi induzierte Autophagie eine Rolle in apoptotischen Stadien und blockiert die apoptotische Signalübertragung. Apoptose und Autophagie fördern und bekämpfen sich gegenseitig. In präapoptotischen Stadien blockieren Zellen den apoptotischen Weg und reduzieren das Ausmaß der Apoptose durch Autophagie, wodurch der Vorteil erhalten bleibt. Autophagie löst in den frühen Stadien der Apoptose keinen Zelltod aus, sondern fördert auch das Überleben der Zellen.61 Autophagie im späten Stadium der Apoptose kann die Apoptose fördern, und dann hemmt die erhöhte Apoptose das Auftreten von Autophagie durch die Migration der p53- und BH3-Signalwege.62 Der biologische Prozess ist streng reguliert, einschließlich der Interaktion von Autophagie und Apoptose. Zahlreiche regulatorische Gene sind am interaktiven Reaktionsmechanismus von Apoptose und Autophagie beteiligt, darunter Beclin-1.63 Zusätzlich zur Regulierung der Autophagie-Initiierung ist Beclin-1 auch an der Regulierung der Apoptose beteiligt.45 ,64 Studien haben gezeigt, dass Beclin-1 seine Fähigkeit verliert, der Apoptose zu widerstehen, nachdem es durch aktivierte Caspasen gespalten wurde.65 Dies legt nahe, dass Beclin-1 eine wichtige Rolle als „molekularer Schalter“ bei der Regulierung spielt von Autophagie und Apoptose.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

V. harveyi ist ein gramnegatives Meeresbakterium, das eine ernsthafte Bedrohung für die Gesundheit der Meeresaquakulturfischerei darstellt. Eine V. harveyi-Infektion führt bei Fischen zu Meningitis und Enzephalitis,66 und eine V. harveyi-Infektion führt bei Zackenbarschen zu einer Gehirnstauung.67 Als Reaktion auf eine bakterielle Infektion sind das angeborene Immunsystem und Entzündungsreaktionen die Hauptverteidigungssysteme von Fischen. Bakterien haben jedoch auch die Fähigkeit entwickelt, sich in Symbiose mit ihren Wirten der Immunität zu entziehen. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse einen Mechanismus der Immunumgehung durch V. harveyi bei Fischen. ACKR4a induziert Autophagie, um die NF-kB-Signalübertragung zu hemmen und die Apoptose zu blockieren, was wiederum die Infektion mit V. harveyi bei Knochenfischen erleichtert. Dies ist auch das erste Mal, dass gramnegative Bakterien der Immunität entgehen, indem sie gleichzeitig die angeborene Immunität und Apoptose über Autophagie regulieren. Diese Studie liefert Einblicke in das Verständnis der Auswirkungen der Autophagie auf die Wirt-Bakterien-Interaktion bei Knochenfischen und bietet eine Perspektive auf die Resistenz von Säugetieren gegen bakterielle Infektionen.

VERWEISE

1. Dinarello, Kalifornien (2018). Überblick über die IL-1-Familie bei angeborener Entzündung und erworbener Immunität. Immunol. Rev. 281, 8–27.

2. Gaidt, MM, Ebert, TS, Chauhan, D., Ramshorn, K., Pinci, F., Zuber, S., O'Duill, F., Schmid-Burgk, JL, Hoss, F., Buhmann, R., et al. (2017). Das DNA-Inflammasom in menschlichen myeloischen Zellen wird durch ein STING-Zelltodprogramm vor NLRP3 initiiert. Zelle 171, 1110–1124.e18.

3. Xiao, TS (2017). Angeborene Immunität und Entzündung. Zelle. Mol. Immunol. 14, 1–3.

4. Koropatnick, TA, Engle, JT, Apicella, MA, Stabb, EV, Goldman, WE und McFallNgai, MJ (2004). Durch mikrobielle Faktoren vermittelte Entwicklung in einem Wirt-Bakterien-Mutualismus. Wissenschaft 306, 1186–1188.

5. Janeway, CA (1989). Annäherung an die Asymptote? Evolution und Revolution in der Immunologie. Kalter Frühling Harb. Symp. Quant. Biol. 54, 1–13.

6. Vallabhapurapu, S. und Karin, M. (2009). Regulation und Funktion von NF-kB-Transkriptionsfaktoren im Immunsystem. Annu. Rev. Immunol. 27, 693–733.

7. Krakauer, T. (2019). Inflammasome, Autophagie und Zelltod: die Dreifaltigkeit der angeborenen Wirtsabwehr gegen intrazelluläre Bakterien. Mediatoren Entzündung. 2019, 2471215.

8. Hurley, JH und Young, LN (2017). Mechanismen der Autophagie-Initiierung. Annu. Rev. Biochem. 86, 225–244.

9. He, X., Zhu, Y., Zhang, Y., Geng, Y., Gong, J., Geng, J., Zhang, P., Zhang, X., Liu, N., Peng, Y ., et al. (2019). RNF34 wirkt bei der Immunität und der selektiven Mitophagie, indem es MAVS für den autophagischen Abbau angreift. EMBO J. 38, 1009788–e101018.

10. Yin, L., Lv, M., Qiu, X., Wang, X., Zhang, A., Yang, K. und Zhou, H. (2021). IFN-G manipuliert die NOD1-vermittelte Interaktion von Autophagie und Edwardsiella piscicida, um die intrazelluläre Clearance bei Fischen zu steigern. J. Immunol. 207, 1087–1098.

11. Mansilla-Pareja, ME, Bongiovanni, A., Lafont, F. und Colombo, MI (2017). Veränderungen der Integrität der replikativen Vakuolenmembran von Coxiella burnetii und deren Wechselwirkung mit dem Autophagieweg. Vorderseite. Zelle. Infizieren. Mikrobiol. 7, 112.

12. Bravo-Santano, N., Ellis, JK, Mateos, LM, Calle, Y., Keun, HC, Behrends, V. und Letek, M. (2018). Intrazellulärer Staphylococcus aureus moduliert den zentralen Kohlenstoffstoffwechsel des Wirts, um die Autophagie zu aktivieren. mSphere 3, 003744–003818.

13. Winchell, CG, Dragan, AL, Brann, KR, Onyilagha, FI, Kurten, RC und Voth, DE (2018). Coxiella burnetii untergräbt p62/Sequestosom 1 und aktiviert die Nrf2-Signalübertragung in menschlichen Makrophagen. Infizieren. Immun. 86, e00608–e00617.

14. Lee, HK, Lund, JM, Ramanathan, B., Mizushima, N. und Iwasaki, A. (2007). Autophagie-abhängige Viruserkennung durch plasmazytoide dendritische Zellen. Wissenschaft 315, 1398–1401.

15. Jounai, N., Takeshita, F., Kobiyama, K., Sawano, A., Miyawaki, A., Xin, KQ, Ishii, KJ, Kawai, T., Akira, S., Suzuki, K., und Okuda, K. (2007). Das Atg5-Atg12-Konjugat ist mit angeborenen antiviralen Immunantworten verbunden. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA. 104, 14050–14055.

16. Schaaf, MBE, Keulers, TG, Vooijs, MA und Rouschop, KMA (2016). Proteine ​​der LC3/GABARAP-Familie: mit der Autophagie (nicht) zusammenhängende Funktionen. FASEB J 30, 3961–3978.

17. Chen, Z., Wang, T., Liu, Z., Zhang, G., Wang, J., Feng, S. und Liang, J. (2015). Hemmung der Autophagie durch MiR-30A, induziert durch Mycobacteria tuberculosis, als möglicher Mechanismus der Immunflucht in menschlichen Makrophagen. Jpn. J. Infizieren. Dis. 68, 420–424.

18. Kubori, T., Bui, XT, Hubber, A. und Nagai, H. (2017). Legionella RavZ spielt eine Rolle bei der Verhinderung der Ubiquitin-Rekrutierung in bakterienhaltigen Vakuolen. Vorderseite. Zelle. Infizieren. Mikrobiol. 7, 384.

19. Danial, NN und Korsmeyer, SJ (2004). Zelltod: kritische Kontrollpunkte. Zelle 116, 205–219.

20. Salvesen, GS und Ashkenazi, A. (2011). Schnappschuss: Caspases. Zelle 147, 476–476.e1.

21. Zhou, ZJ und Sun, L. (2016). Edwardsiella tarda-induzierte Hemmung der Apoptose: eine Strategie für das intrazelluläre Überleben. Vorderseite. Zelle. Infizieren. Mikrobiol. 6, 76.

22. Günther, SD, Fritsch, M., Seeger, JM, Schiffmann, LM, Snipas, SJ, Coutelle, M., Kufer, TA, Higgins, PG, Hornung, V., Bernardini, ML, et al. (2020). Zytosolische gramnegative Bakterien verhindern die Apoptose durch Hemmung von Effektor-Caspasen durch Lipopolysaccharide. Nat. Mikrobiol. 5, 354–367.

23. Wierzbicki, IH, Campeau, A., Dehaini, D., Holay, M., Wei, X., Greene, T., Ying, M., Sands, JS, Lamsa, A., Zuniga, E., et al. (2019). Streptokokken-S-Protein der Gruppe A nutzt rote Blutkörperchen als Immuntarnung und ist ein entscheidender Faktor für die Immunumgehung. Cell Rep. 29, 2979–2989.e15.

24. Chen, J., Lu, Y., Ye, X., Emam, M., Zhang, H. und Wang, H. (2000). Aktuelle Fortschritte bei Vibrio Harveyi Quorum Sensing als Ziele für die Arzneimittelentdeckung. EUR. J. Med. Chem. 207, 112741.

25. Kimura, T., Jain, A., Choi, SW, Mandell, MA, Schroder, K., Johansen, T. und Deretic, V. (2015). TRIM-vermittelte Präzisionsautophagie zielt auf zytoplasmatische Regulatoren der angeborenen Immunität ab. J. Cell Biol. 210, 973–989.

26. Zlotnik, A. und Yoshie, O. (2012). Die Chemokin-Superfamilie ist wieder da. Immunität 36, 705–716.

27. Ulvmar, MH, Hub, E. und Rot, A. (2011). Atypische Chemokinrezeptoren. Exp. Zellauflösung 317, 556–568.

28. Bonecchi, R., Savino, B., Borroni, EM, Mantovani, A. und Locati, M. (2010). Chemokin-Decoy-Rezeptoren: Strukturfunktion und biologische Eigenschaften. Curr. Spitze. Mikrobiol. Immunol. 341, 15–36.

29. Comerford, I., Litchfield, W., Harata-Lee, Y., Nibbs, RJB und McColl, SR (2007). Regulierung chemotaktischer Netzwerke durch „atypische“ Rezeptoren. Bioessays 29, 237–247.

30. Horuk, R., Chitnis, CE, Darbonne, WC, Colby, TJ, Rybicki, A., Hadley, TJ und Miller, LH (1993). Ein Rezeptor für den Malariaparasiten Plasmodium vivax: der Erythrozyten-Chemokinrezeptor. Wissenschaft 261, 1182–1184.

31. Bonini, JA, Martin, SK, Dralyuk, F., Roe, MW, Philipson, LH und Steiner, DF (1997). Klonierung, Expression und chromosomale Kartierung eines neuartigen menschlichen CC-Chemokinrezeptors (CCR10), der eine hochaffine Bindung für MCP-1 und MCP-3 zeigt. DNA-Zellbiol. 16, 1249–1256.

32. Nibbs, RJ, Wylie, SM, Yang, J., Landau, NR und Graham, GJ (1997). Klonierung und Charakterisierung eines neuen promiskuitiven menschlichen Beta-Chemokin-Rezeptors D6. J. Biol. Chem. 272, 32078–32083.

33. Burns, JM, Summers, BC, Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, MET, Sunshine, MJ, Littman, DR, Kuo, CJ, et al. (2006). Ein neuartiger Chemokinrezeptor für SDF-1 und I-TAC ist am Zellüberleben, der Zelladhäsion und der Tumorentwicklung beteiligt. J. Exp. Med. 203, 2201–2213.

34. Gosling, J., Dairaghi, DJ, Wang, Y., Hanley, M., Talbot, D., Miao, Z. und Schall, TJ (2000). Neueste Entwicklung: Identifizierung eines neuartigen Chemokinrezeptors, der dendritische Zellen und T-Zell-aktive Chemokine einschließlich ELC, SLC und TECK bindet. J. Immunol. 164, 2851–2856.

35. Hall, RA, Premont, RT und Lefkowitz, RJ (1999). Heptahelical-Rezeptor-Signalisierung: jenseits des G-Protein-Paradigmas. J. Cell Biol. 145, 927–932.

36. Brzostowski, JA und Kimmel, AR (2001). Signalisierung bei Null G: G-Protein-unabhängige Funktionen für 7-TM-Rezeptoren. Trends Biochem. Wissenschaft. 26, 291–297.

37. Sun, Y., Huang, J., Xiang, Y., Bastepe, M., Jüppner, H., Kobilka, BK, Zhang, JJ und Huang, XY (2007). Dosierungsabhängiger Wechsel von G-Protein-gekoppelter zu G-Protein-unabhängiger Signalübertragung durch einen GPCR. EMBO J. 26, 53–64.

38. Nibbs, RJB und Graham, GJ (2013). Immunregulation durch atypische Chemokinrezeptoren. Nat. Rev. Immunol. 13, 815–829.

39. Lewis, BP, Burge, CB und Bartel, DP (2005). Konservierte Samenpaarungen, oft flankiert von Adenosinen, weisen darauf hin, dass Tausende menschlicher Gene microRNA-Ziele sind. Zelle 120, 15–20.

40. Friedman, RC, Farh, KKH, Burge, CB und Bartel, DP (2009). Die meisten mRNAs von Säugetieren sind konservierte Ziele von microRNAs. Genomres. 19, 92–105.

41. Denli, AM, Tops, BBJ, Plasterk, RHA, Ketting, RF und Hannon, GJ (2004). Verarbeitung primärer microRNAs durch den Mikroprozessorkomplex. Natur 432, 231–235.

42. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. und Xu, T. (2022). eIF3k hemmt die NF-kB-Signalübertragung, indem es auf MyD88 für den ATG5-vermittelten autophagischen Abbau in Knochenfischen abzielt. J. Biol. Chem. 298, 101730.

43. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J. und Xu, T. (2017). Induzierbare microRNA-214 trägt zur Unterdrückung der NF-kB-vermittelten Entzündungsreaktion bei, indem sie auf das myd88-Gen in Fischen abzielt. J. Biol. Chem. 292, 5282–5290.

44. Gay, NJ, Symmons, MF, Gangloff, M. und Bryant, CE (2014). Aufbau und Lokalisierung von Toll-like-Rezeptor-Signalkomplexen. Nat. Rev. Immunol. 14, 546–558.

45. McKnight, NC, und Zhenyu, Y. (2013). Beclin 1 ist ein wesentlicher Bestandteil und Hauptregulator von PI3K-III für Gesundheit und Krankheit. Curr. Pathobiol. Rep. 1, 231–238.

46. ​​Mutwiri, G., Gerdts, V., Lopez, M. und Babiuk, LA (2007). Angeborene Immunität und neue Adjuvantien. Rev. Sci. Technik. 26, 147–156.

47. Buchmann, K. (2014). Entwicklung der angeborenen Immunität: Hinweise von Wirbellosen über Fische bis hin zu Säugetieren. Vorderseite. Immunol. 5, 459.

48. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J. und Xu, T. (2017b). MicroRNA-3570 moduliert den NF-kB-Signalweg in Knochenfischen, indem es auf MyD88 abzielt. J. Immunol. 198, 3274–3282.

49. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. und Xu, T. (2020). IRF3 und IRF8 regulieren die NF-kB-Signalübertragung, indem sie auf MyD88 in Knochenfischen abzielen. Vorderseite. Immunol. 11, 606.

50. Takeuchi, O., Hoshino, K. und Akira, S. (2000). Auf dem neuesten Stand: TLR2-defiziente und MyD88-defiziente Mäuse sind sehr anfällig für eine Infektion mit Staphylococcus aureus. J. Immunol. 165, 5392–5396.

51. Keszei, AFA, Tang, X., McCormick, C., Zeqiraj, E., Rohde, JR, Tyers, M. und Sicheri, F. (2014). Die Struktur eines SspH1-PKN1-Komplexes enthüllt die Grundlage für die Erkennung des Wirtssubstrats und den Aktivierungsmechanismus für eine bakterielle E3-Ubiquitin-Ligase. Mol. Zellbiol. 34, 362–373.

52. Günster, RA, Matthews, SA, Holden, DW und Thurston, TLM (2017). Die Effektoren des Sekretionssystems SseK1 und SseK3 vom Typ III hemmen die NFkB-Signalübertragung und den nekrotischen Zelltod in Salmonellen-infizierten Makrophagen. Infizieren. Immun. 85, e00010–e00017.

53. Mazurkiewicz, P., Thomas, J., Thompson, JA, Liu, M., Arbibe, L., Sansonetti, P. und Holden, DW (2008). SpvC ist ein Salmonella-Effektor mit Phosphothreonin-Lyase-Aktivität auf mitogenaktivierten Proteinkinasen des Wirts. Mol. Mikrobiol. 67, 1371–1383.

54. Saitoh, T. und Akira, S. (2010). Regulierung angeborener Immunantworten durch Autophagie-bezogene Proteine. J. Cell Biol. 189, 925–935.

55. Orvedahl, A., Alexander, D., Tallo´ czy, Z., Sun, Q., Wei, Y., Zhang, W., Burns, D., Leib, DA und Levine, B. (2007). ). HSV-1 ICP34.5 verleiht Neurovirulenz, indem es auf das Autophagieprotein Beclin 1 abzielt. Zellwirtsmikrobe 1, 23–35.

56. Kyei, GB, Dinkins, C., Davis, AS, Roberts, E., Singh, SB, Dong, C., Wu, L., Kominami, E., Ueno, T., Yamamoto, A., et al. (2009). Der Autophagieweg überschneidet sich mit der HIV-1-Biosynthese und reguliert die Virusausbeute in Makrophagen. J. Cell Biol. 186, 255–268.

57. Niu, H., Xiong, Q., Yamamoto, A., Hayashi Nishino, M. und Rikihisa, Y. (2012). Durch ein bakterielles Beclin-1-Bindungsprotein induzierte Autophagosomen erleichtern die obligatorische intrazelluläre Infektion. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA. 109, 20800–20807.

58. Hussain, MA, Datta, D., Singh, R., Kumar, M., Kumar, J. und Mazumder, S. (2019). Der durch TLR-2 vermittelte zytosolische Ca2+-Anstieg aktiviert das ER-Stress-Superoxid-NO-Signalosom und steigert die TNF-a-Produktion, was zur Apoptose von mit Mycobacterium smegmatis infizierten Fischmakrophagen führt. Wissenschaft. Rep. 9, 12330.

59. Lee, J., Hartman, M. und Kornfeld, H. (2009). Makrophagen-Apoptose bei Tuberkulose. Yonsei Med. J. 50, 1–11.

60. McCormick, AL (2008). Kontrolle der Apoptose durch das humane Cytomegalovirus. Curr. Spitze. Mikrobiol. Immunol. 325, 281–295.

61. Kuma, A., Hatano, M., Matsui, M., Yamamoto, A., Nakaya, H., Yoshimori, T., Ohsumi, Y., Tokuhisa, T. und Mizushima, N. (2004) . Die Rolle der Autophagie während der frühen Neugeborenen-Hungerperiode. Natur 432, 1032–1036.

62. Marin˜o, G., Niso-Santano, M., Baehrecke, EH und Kroemer, G. (2014). Eigenverbrauch: das Zusammenspiel von Autophagie und Apoptose. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 15, 81–94.

63. Furuya, D., Tsuji, N., Yagihashi, A. und Watanabe, N. (2005). Beclin-1 verstärkte die durch cis-Diammindichlorplatin induzierte Apoptose durch eine Steigerung der Caspase-9-Aktivität. Exp. Zellauflösung 307, 26–40.

64. Pattingre, S., Tassa, A., Qu, X., Garuti, R., Liang, XH, Mizushima, N., Packer, M., Schneider, MD und Levine, B. (2005). Bcl-2-antiapoptotische Proteine ​​hemmen die Beclin 1-abhängige Autophagie. Zelle 122, 927–939.

65. Djavaheri-Mergny, M., Maiuri, MC und Kroemer, G. (2010). Wechselwirkung zwischen Apoptose und Autophagie durch Caspase-vermittelte Spaltung von Beclin 1. Oncogene 29, 1717–1719.

66. Grimes, DJ, Gruber, SH und May, EB (1985). Experimentelle Infektion von Zitronenhaien, Negaprion brevirostris (Poey), mit Vibrio-Arten. J. Fisch. Dis. 8, 173–180.

67. Mohamad, N., Mohd Roseli, FA, Azmai, MNA, Saad, MZ, Md Yasin, IS, Zulkiply, NA und Nasruddin, NS (2019). Natürliche gleichzeitige Infektion von Vibrio harveyi und V. alginolyticus bei kultivierten Hybrid-Zackenbarschen in Malaysia. J. Aquat. Anim. Gesundheit 31, 88–96.