Aus Cistanche gewonnenes Acteosid verbessert Glucocorticoid-induzierte Osteoporose durch Aktivierung des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs

Abstrakt

Zielsetzung

Glucocorticoide sind in der klinischen Praxis weit verbreitet; sie können jedoch Nebenwirkungen verursachen, wie zOsteoporose. Acteosid(ACT) aus Cistanche wurde zur Bekämpfung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Die Studie wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit von ACT bei Glucocorticoid-induzierten Patienten zu bewertenOsteoporose(GIOP) und seinen potenziellen Mechanismus.

Methoden
Dexamethason (Dex) wurde zur Induktion intramuskulär injiziertOsteoporosein einem Rattenmodell und ACT wurde oral verabreicht. ACT wurde in vivo in Dex-stimuliert ergänztosteoblastischMC3T3-E1-Zellen. RT-qPCR wurde durchgeführt, um die mRNA-Spiegel zu bestimmenKnochenbildung(Runx2, CoL1A1) und Knochenresorption (OPG und RANKL). Ein kommerzieller ELISA-Kit wurde verwendet, um die Serum-OC- und -CTX-Spiegel zu bestimmen. Western Blot wurde durchgeführt, um die Proteinspiegel im PI3K/AKT/mTOR-Signalweg zu bestimmen. CCK-8-Assay und Durchflusszytometrie wurden durchgeführt, um die Lebensfähigkeit und Apoptose von Osteoblasten zu beurteilen.

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Ergebnisse
ACT reduzierte die Dex-induzierte Verschlechterung der Knochenmikrostruktur, erhöhte die Serumspiegel von OC und senkte die Spiegel von CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and Apoptose gefördert; dieser Effekt wurde jedoch durch ACT stark abgeschwächt (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Fazit
ACT abCistanchekann osteoprotektive Wirkungen ausüben, indem es den PI3K/AKT/mTOR-Signalweg aktiviert, um die Dex-induzierte Osteoporose zu lindern.

Schlüsselwörter:Acteosid CistancheGlucocorticoid-induziertOsteoporose

Einführung
Osteoporose (OP) ist eine generalisierte Skeletterkrankung, die durch geringe Knochenmasse, Zerstörung der Mikrostruktur des Knochengewebes und Ungleichgewicht in der Knochenhomöostase gekennzeichnet ist [1]. OP verursacht mehr als 8,9 Millionen Frakturen pro Jahr und osteoporotische Frakturen treten fast alle 3 Sekunden auf und führen zu lebenslanger Behinderung oder zum Tod [2]. Glucocorticoide (GCs) werden üblicherweise zur Behandlung von nichtinfektiösen entzündlichen Erkrankungen (wie Asthma und entzündlichen Darmerkrankungen) sowie Autoimmunerkrankungen verabreicht [3]. Die Langzeitanwendung von GC prädisponiert jedoch für mehr als 30 Prozent der OP-Fälle und mehr als 10 Prozent der Osteonekrose-Fälle [4]. GCs hemmen direkt die Proliferation und Differenzierung von Osteoblasten [5], verringern die Reifung und Aktivität und induzieren die Apoptose von Osteoblasten, was wiederum zur Entwicklung einer Glucocorticoid-induzierten Osteoporose (GIOP) führt [6]. Darüber hinaus deuten immer mehr Beweise darauf hin, dass die Dysfunktion der Osteoblasten die Hauptursache für Knochenschwund ist. Daher scheint eine Erhöhung der Anzahl und Funktion von Osteoblasten die Hauptstrategie zur Verhinderung von OP, insbesondere GIOP, zu sein.

Pflanzliche Arzneimittel, insbesondere solche auf Basis natürlicher Verbindungen, werden seit Tausenden von Jahren zur Behandlung verschiedener Krankheiten praktiziert [7]. Cistanche ist ein wertvolles Kraut, das im chinesischen Arzneibuch aufgeführt ist und im südlichen Gebiet der autonomen Region Xinjiang Uygur wächst und als Wüstenginseng bekannt ist [8]. Cistanche hat nachweislich verschiedene Wirkungen, wie z. B. Immunverstärkung, Nierenschutz, Anti-Aging, antioxidative, entzündungshemmende und neuroprotektive Wirkungen [9].Acteosid(ACT) ist ein Phenylethanol-Glucosid in Cistanche, das biologische Aktivitäten hat, wie Hemmung der neuronalen Apoptose [10], Linderung von Leberschäden [11], Entzündungshemmer [12], Antioxidation [13] , Prävention von Diabetes [14] und Adipositas [15] sowie der Degeneration des Gelenkknorpels [16]. Darüber hinaus haben mehrere Studien über die Pharmakokinetik von ACT berichtet und bestätigt, dass die therapeutische Wirkung auch dann besteht, wenn die orale Verwertung nur 0,12 Prozent beträgt. ACT gilt als Prodrug mit aktiven Metaboliten in vivo [17].

Zhanget al. zeigten eine potenzielle protektive Wirkung von ACT auf Ovariektomie-induzierten Knochenverlust bei Ratten [18]. ACT moduliert den IGF-1/PI3K/mTOR-Signalweg, um Knochenschwund bei diabetischen Ratten zu verhindern [19]. Es wurde berichtet, dass der PI3K/AKT/mTOR-Signalweg eine entscheidende regulatorische Rolle bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich GIOP, spielt [20]. Naringin lindert GIOP, indem es den PI3K/AKT/mTOR-Signalweg reguliert [21]. Darüber hinaus reguliert dieser Signalweg die Osteoblastendifferenzierung [22], die Knochenbildung [23] und die Frakturheilung [24]. Die potenzielle Rolle von ACT bei GIOP und ob es durch die Modulation des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs reguliert wird, ist jedoch unbekannt.

Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die schützenden Wirkungen von ACT in einem GIOP-Rattenmodell und Osteoblasten in vitro zu verstehen und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen aufzuklären.

Materialen und Methoden
Versuchstiere
Vierzig 8- Wochen alte männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten mit einem Gewicht von 280–340 g wurden vom Shanghai Laboratory Animal Center (CAS, Shanghai, China) bezogen. Die Pflegeverfahren der Versuchstiere wurden gemäß dem Protokoll durchgeführt, das vom Tierethikkomitee des Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University genehmigt wurde. Und die Studie wurde in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Leitlinien durchgeführt. Die Tiere wurden in Tierzentren gehalten, die frei von Krankheitserregern waren, 24 ± 2 Grad, 12 h Licht- und Dunkelzyklen, 50 ± 5 Prozent Luftfeuchtigkeit und mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.

Konstruktion des GIOP-Modells
Nach 7 Tagen adaptiver Fütterung wurden die Ratten nach dem Zufallsprinzip in Kontroll- und Modellgruppen eingeteilt, wobei Dexamethason (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) 5 mg/kg zweimal pro Woche für 6 Wochen injiziert wurde intramuskulär, um OP bei Ratten in der Modellgruppe zu induzieren [25]. Ratten in der Kontrollgruppe (n = 10) wurde eine gleiche Menge Kochsalzlösung injiziert. Nach 6 Wochen wurden bei den Ratten in beiden Gruppen keine signifikanten Veränderungen des Körpergewichts beobachtet. Anschließend wurden die Ratten in der Modellgruppe in die Modellgruppe, ACT-Gruppe mit niedriger Dosis (Modell plus ACT-L) und Gruppe mit ACT-Hochdosisgruppe (Modell plus ACT-H) unterteilt. ACT (HPLC 98 Prozent) wurde von Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, China) erhalten und mit einer wässrigen Lösungsmittelsuspension behandelt. Eine Dosis von 5 0 mg/kg/Tag und 1 0 0 mg/kg/Tag ACT wurde oral an Ratten in den Gruppen mit niedriger und hoher Dosis (8 Ratten pro Gruppe) verabreicht 8 Wochen fortgesetzt wurde. Unter ihnen wurde die Stichprobengröße basierend auf einer früheren Studie berechnet [26]. Unter Berücksichtigung eines zweiseitigen Signifikanzniveaus von 0,05 [95-Prozent-Konfidenzintervall (= 0,05)], einer Power von 80 Prozent und einer Effektgröße von 0,5 schätzte die Power-Analyse eine erforderliche Stichprobengröße von 6 Tieren pro Gruppe unter der Annahme von a relevanten Wirkungsniveau von 30 Prozent Osteoporose. Außerdem wurden mit einer Dropout-Rate von 20 Prozent 8 Tiere pro Gruppe (insgesamt 32 Ratten) als ideal angesehen.

Rattenserumproben
Nach 8 Wochen wurden die Ratten mit 10 Prozent Chloralhydrat (400 mg/kg, intraperitoneal, Solarbio, Beijing China) anästhesiert, Blut wurde aus der abdominalen Aorta gesammelt, bei Raumtemperatur geronnen und bei 3500 U/min für 10 min zentrifugiert. Das Serum wurde bis zur weiteren Verwendung in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen aufbewahrt.

Beurteilung der Knochenmineraldichte
Die Knochenmineraldichte (BMD) wurde mit einem DAX-Knochendensitometer für kleine Tiere (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, China) verwendet. Kurz wurden die Ratten in Rückenlage gebracht und die Hinterbeine wurden nach außen positioniert. Der rechte Femur der Ratten wurde nach Herstellerangaben gescannt und die BMD-Werte aufgezeichnet [27].

Analyse der Knochenmorphologie
Am Ende des Experiments wurden die Ratten durch intraperitoneale Injektion von überschüssigem Chloralhydrat eingeschläfert, und die Femuren wurden in 70-prozentigem Ethanol fixiert. Anschließend wurden Scans auf einem VivaCT 40μCT-System durchgeführt, wie in der vorherigen Studie beschrieben, und das Knochenvolumen/Gesamtvolumen (BV/TV), die Knochentrabekelzahl (Tb.N), die Knochentrabekeldicke (Tb.Tn) und die Knochentrabekeltrennung (Tb.Sp) wurden bewertet [28]. Zur Euthanasie wurden SD-Ratten nach der Analyse der Knochenmorphologie durch eine intraperitoneale Injektion von 10 Prozent Chloralhydrat (350 mg/kg) anästhesiert.

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Kommerzielle ELISA-Kits wurden zum Nachweis von Osteocalcin- (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) und C-terminalen Telopeptid- (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience)-Spiegeln im Serum von Ratten verwendet. Kurz gesagt, die Reagenzien wurden bei 18-25 Grad entfernt, um die Lösung zu äquilibrieren und für das Waschen und Standardarbeiten vorzubereiten. Enzymplatten Platten wurden mit Standard-, Blind- und Probenvertiefungen eingerichtet. Etwa 100 μl Probenverdünnungslösung wurden in die Vertiefungen gegeben, 90 min bei 37 Grad inkubiert und 60 min bei 37 Grad durch einen biotinylierten Antikörper ersetzt. Nach dem Waschen wurde die enzymbindende Arbeitslösung zugegeben und 30 min inkubiert. Die Substratlösung (90 μL) wurde zugegeben und für 15 min unter Lichtschutz inkubiert. Als der blaue Gradient in den Standardvertiefungen erschien, wurden 50 &mgr;l der Terminationslösung zugegeben und die Änderung der OD450 analysiert.

Reverse Transkription-quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR)
TRlzol LS-Reagenz wurde dem Serum von Ratten und ACT-behandelten MC3T3-E1-Zellen zugesetzt, und Gesamt-RNA wurde durch Inkubation bei Raumtemperatur extrahiert, gefolgt von der Zugabe von Chloroform. RNA-Konzentration und -Reinheit wurden durch Messen der A260/280-Absorption in einem Nanodrop ND-1000-Spektrophotometer bestätigt. Das SuperScript II Reverse Transcriptase Kit wurde für die reverse Transkription von RNA zu cDNA verwendet. Anschließend wurde cDNA als Matrize aufgetragen, ein Primer hinzugefügt und das SYBR-Green-PCR-Master-Mix-Kit gemischt und mit ddH2O auf 20 μl ergänzt, und die PCR-Amplifikationsreaktion wurde unter Verwendung des Applied Biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR durchgeführt System (ABI, CA, USA). GAPDH wurde als interne Referenz für die Normalisierung verwendet, und die relativen Expressionsniveaus wurden unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode berechnet und dreifach durchgeführt. Die Primersequenz für Runt-related Transkriptionsfaktor 2 (Runx2), Kollagen Typ I 1 (CoL1A1), Rezeptoraktivator des Nuklearfaktor-κB-Liganden (RANKL), Osterix und Osteoprotegerin (OPG) sind in Tabelle 1 dargestellt.

Western-Blot-Analyse
RIPA-Lysat, das 1 Prozent Proteaseinhibitor enthielt, wurde zu den Zellen gegeben, und das Gesamtprotein aus jeder Gruppe wurde nach Lyse der Zellen durch 5-minütiges Schütteln bei 4 Grad gesammelt. Der BCA-Assay-Kit wurde verwendet, um die Konzentration von Proteinen in jeder Gruppe zu quantifizieren. Anschließend wurden die Proteinproben mit 10-prozentigem Natriumdodecylsulfat (SDS)-Puffer im gleichen Volumen gemischt und zur Proteindenaturierung für 5 min in einem Wasserbad bei 95 Grad gekocht. Ein vertikales 12-prozentiges SDS-Polyacrylamidgel wurde hergestellt, und nachdem sich das Gel verfestigt hatte, wurden 30 ug Protein für die 90-minütige Gelelektrophorese-Trennung bei 120 mA entnommen. Das Protein wurde dann bei 90 V für 120 min auf die PVDF-Membran transferiert. Nach dem Versiegeln mit 5 Prozent Rinderserumalbumin wurde die PVDF-Membran basierend auf dem Molekulargewicht der Marker- und Zielproteinbande geschnitten und mit dem entsprechenden primären Antikörper über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen p-AKT, p-mTOR und p-PI3K wurden auf ein Verhältnis von 1:1000 verdünnt (Proteintech, Wuhan, China). TBST wurde 30 min lang gewaschen und mit dem entsprechenden Meerrettichperoxidase-markierten sekundären Antikörper 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der Blot wurde unter Verwendung von verstärkten Chemilumineszenzreagenzien sichtbar gemacht. Die Dichte der Proteinbanden wurde mit Image J quantifiziert. GAPDH wurde als Kontrolle verwendet, um die relativen Proteinspiegel zu berechnen.

Zellkultur und Gruppierung
Maus-Präosteoblasten MC3T3-E1 wurden von den Chinese Tissue Culture Collections (CTCC, China) erworben und in -MEM kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum und 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin in a enthielt befeuchteter Inkubator bei 37 Grad und 5 Prozent CO2. Für die Knochendifferenzierungskultur wurde osteogenes Induktionsmedium durch Mischen von 10 mM - -Glycerophosphat und 50 mg/ml Ascorbinsäure (Sigma-Aldrich) mit -MEM hergestellt und zu den MC3T3-E1-Zellen zur Induktion gegeben ihre Differenzierung. Das Medium wurde nach 3 Tagen gewechselt. Kulturen für 14 Tage wurden für die Lebensfähigkeit der alkalischen Phosphatase (ALP) verwendet. Darüber hinaus wurden die Zellen mit dem PI3K-Inhibitor LY294002 (10 μM) für 30 min vorbehandelt, gefolgt von einer Behandlung mit Dex und ACT.

Zelllebensfähigkeitstest
Der Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Assay wurde durchgeführt, um die Lebensfähigkeit von mit ACT behandelten Osteoblasten zu beurteilen. Die MC3T3-E1-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit 5 × 10 3 Zellen/Vertiefung inokuliert. Basierend auf früheren Studien [29] wurde eine Menge von 1 μM Dex in Betracht gezogen und mit Gradientenkonzentrationen von ACT (10 –8, 10 –7, 10 –6 und 10 –5 M) co-inkubiert. Das Kulturmedium in den 96-Well-Platten wurde ersetzt, nachdem Mischmedium und CCK-8-Reagenz in einem Verhältnis von 10:1 hinzugefügt wurden. Nach fortgesetzter Inkubation für 1 Stunde bei 37 Grad wurde die Veränderung der OD450 bestimmt.

Nachweis der Apoptosezahl von Osteoblasten
Die MC3T3-E1-Zellen, die verschiedenen Behandlungen unterzogen wurden, wurden unter Verwendung von EDTA-freiem Trypsin verdaut und durch Zentrifugation gesammelt. Nach dem Waschen mit 1 × Bindungspuffer wurden 5 μl Annexin V-FITC zugegeben und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, mit 5 μl PI ergänzt und durch ein 200--Mesh-Nylonnetz geleitet. Die Proben wurden unter Verwendung des FACScan-Durchflusszytometriesystems analysiert.

ALP-Aktivitätsassay
Die MC3T3-E1-Zellen wurden in 24-Well-Platten inokuliert, und ACT und Dex wurden nach dem Verputzen hinzugefügt. Das Zellkulturmedium wurde durch ein osteogenes Differenzierungsmedium für die Kultur ersetzt. Nach der Lyse von Zellen durch Zelllyselösung (P0012J, Beyotime Biotechnology) wurde der Überstand durch Zentrifugation gesammelt und die Standardkurve aufgetragen. Ein ALP-Kit (P0132S, Beyotime Biotechnology) wurde verwendet, um die ALP-Aktivität zu bewerten, und die OD450 wurde berechnet.

statistische Analyse
Nach der Durchführung von drei unabhängigen Experimenten in dreifacher Ausführung wurden die Daten mit der Software GraphPad Prism 6.0 analysiert und als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. ANOVA wurde verwendet, um statistische Unterschiede zwischen mehreren Gruppen zu vergleichen. P-Wert < 0,05 wurde als statistisch unterschiedlich betrachtet.