Entzündungshemmende Prinzipien aus den Nadeln von Pinus Taiwanensis Hayata und In-Silico-Studien zu ihrer möglichen Anti-Aging-Wirkung

Abstrakt:PinusNadeltee ist in östlichen Ländern wie Japan, Russland, Korea und China sehr beliebt. Kiefernnadeltee soll eine bedeutungsvolle Wirkung habenAnti-Aging-Wirkung,aber es gibt bisher keine eindeutigen Beweise dafür. In der vorliegenden Studie wurden fünfzehn unbeschriebene Verbindungen (1–5) sowie 72 bekannte Verbindungen wurden aus der bioaktiven Fraktion von Methanolextrakten gereinigt und charakterisiertP. taiwanensisNadeln.

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Die meisten Isolate wurden auf ihre untersuchtentzündungshemmende Bioaktivitätdurch zelluläres Neutrophilenmodell und sechs Verbindungen (45, 47, 48, 49, 50, Und51) ausgestellt asignifikante Hemmung der Superoxid-Anionenbildungund Elastase-Freisetzung mit IC50-Werten im Bereich von 3,3± 0.9 bis 8.3± 0.8 µM. Dieseentzündungshemmende Inhaltsstoffewurden einem Docking-Computing unterzogen, um ihre Bindungsaffinität an den Ghrelin-Rezeptor, der eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Stoffwechsels spielt, zu bewertenAnti-Aging-Effekte. Verbindungen49, 50, Und51 bildete über Wasserstoffbrückenbindungen und verschiedene Arten von Wechselwirkungen einen stabilen Komplex mit dem Ghrelinrezeptor.

1. Einleitung

PinusGattung (Pinaceae), die mehr als 100 Arten umfasst und hauptsächlich auf der Nordhalbkugel verbreitet ist, sind im Allgemeinen immergrüne Bäume, während einige Sträucher sind [1]. Kiefernholz ist leicht und wird häufig für Möbel verwendet. In den alten Büchern der traditionellen chinesischen Medizin wurden jedoch verschiedene pharmakologische Wirkungen von Nadeln auf Kiefernsprossen aufgezeichnet. Im „The Divine Husbandman's Herbal Foundation Canon“ fördern Kiefernnadeln das Haarwachstum, verlängern das Leben und stillen den Durst. In „Taiping Shenghui Fang“ wurde berichtet, dass Kiefernnadeln mit Alkohol gekocht werden konnten und eine Anti-Aging-Wirkung zeigten. Heutzutage werden Kiefernnadeln zu Tee verarbeitet und sind in Asien beliebt. In Korea sind die Wähler derP. densifloraNadeltee sowie dessenAntioxidative und antibakterielle Bioaktivitäten wurden ausführlich untersucht [2,3]. Seit dem frühen letzten Jahrhundert wurden mehr als siebenhundert Verbindungen identifiziertPinusnadeln. Der Großteil der berichteten Literatur bezieht sich auf das ätherische Öl vonP. densiflflora[4,5], P. halepensis[6,7], P. nigra[4,8], UndP. sylvestris[4,9]. Die charakterisierten Komponenten vonPinusNadeln bestehen hauptsächlich aus Benzenoiden, Diterpenoiden, Flavonoiden, Lignanen, Monoterpenoiden und Sesquiterpenoiden [10]. Die Nadeln vonP. densifloraUndP. morrisonicolawurden für ihre antioxidative Bioaktivität berichtet [11–14]. Darüber hinaus enthält der Ethylacetat-Extrakt NadelnP. morrisonicolahemmte die Protein- und mRNA-Expression von NO undiNOS im LPS-induzierten RAW 264.7-Makrophagen, das eine signifikante entzündungshemmende Bioaktivität zeigt [13]. Der überkritische Flüssigextrakt vonP. densifloraNadeln zeigten eine hemmende Wirkung auf die LPS-induzierte NO-Produktion, indem sie die Expression von herunterregulierteniNOS und Reduzierung des Ausdrucks von IL-6 und IL-1 und durch LPS induzierte Aktivierung von STAT1- und STAT3-Proteinen in Makrophagen [15]. Der Ethanolextrakt vonP. thunbergiiNadeln zeigten eine signifikante entzündungshemmende Wirkung in Makrophagen und unterdrückten durch Arachidonsäure verursachte Ohrödeme und hemmten die enzymatische Aktivität der Myeloperoxidase [16]. Darüber hinaus ist die fermentierteP. morrisonicolaNadeln zeigten ihre hervorragende antioxidative und entzündungshemmende Bioaktivität durch Modulation des NF-κB-Signalweg [17]. 

Ghrelin ist ein Peptidhormon, das aus 28 Aminosäuren besteht und ursprünglich im Magen entdeckt wurde [18,19]. Es ist ein endogener Ligand für das Wachstumshormon-Sekretagogum (GHSR), das ein Mitglied der ist -Zweig in GPCRs der Klasse A (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren) [18,19]. Ghrelin ist das einzige Peptidhormon, das Hunger auslöst und so den Appetit fördert [20]. Viele Studien deuten darauf hin, dass Ghrelin eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Stoffwechsels, des Energiehaushalts, des Gedächtnisses sowie der Herz-Kreislauf- und Magen-Darm-Funktionen im menschlichen Körper spielt [21–23]. Ghrelin ist auch an verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Mechanismen im menschlichen Körper beteiligt, beispielsweise am Alter [24,25], und es könnte mit einer entzündungshemmenden Wirkung zusammenhängen [26,27]. Im Jahr 2014 wurden die einzigartigen acylierten Flavonoid-Tetraglycoside namens Teaghreline erstmals von unserer Gruppe in Chin-shin-Oolong-Tee identifiziert und zeigten ihre fördernde Aktivität bei der Freisetzung von Wachstumshormonen (GH) [28]. Zwei weitere ähnliche Verbindungen wurden in Shy-jih-chuen-Oolong-Tee gereinigt und ihre Bioaktivität am Ghrelin-Rezeptor wurde ebenfalls bestätigt [29]. Die vier Teaghreline lösten über denselben regulatorischen Weg wie Ghrelin Hunger aus. Neben Tee wurden auch Verbindungen mit ähnlichen Strukturen oder Bioaktivitäten wie Teaghreline untersuchtPolygonum multiflorum(Hes houwu) [30], Ginkgo biloba[31], Morus alba[32], UndCistanche tubulosa [33]. Diese Ergebnisse unterstützen uns bei der Suche nach natürlichen Anti-Aging-Wirkstoffen, indem wir die Ghrelin-ähnlichen Verbindungen im Tee untersuchen, die entzündungshemmende Wirkungen besitzen. Zusätzlich zur direkten Durchführung der fördernden Aktivität bei der Freisetzung von Wachstumshormonen in Zellmodellen wäre die molekulare Modellierung einiger potenzieller Verbindungen effizienter bei der Erforschung möglicher Kandidaten [34]. Zur Entwicklung und Bewertung pharmakologischer Hypothesen wurden rechnerische Methoden eingesetzt. Molekulares Docking ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken und vorhersagt die Konformation und Affinität der Ligandenbindung an die aktive Tasche mit hoher Genauigkeit [35,36]. Docking-Methoden durchsuchen hochdimensionale Räume effektiv nach möglichen Interaktionen und verwenden eine Bewertungsfunktion, die die Kandidaten richtig einordnet [37]. 

Im Jahr 2018 wurden drei Verbindungen aus den Nadeln von gereinigtP. morrisonicolaund zeigte eine signifikante gefäßrelaxierende Wirkung, und unter diesen Bestandteilen wurde über einen mit einer Tee-Ghrelin-ähnlichen Struktur berichtet [38]. In Taiwan,P. taiwanensisNadeln werden aufgrund ihrer berühmten Bioaktivität normalerweise getrocknet und gebacken und dann als Tee verarbeitet.P. taiwanensisHayata ist eine der einheimischen und endemischen Arten in Taiwan. Sie wird auch Taiwan-Rotkiefer oder Huangshan-Kiefer genannt. Es gibt zwei Nadeln in einer 8–11 cm langen, leicht steifen und geraden Büschel, die über die gesamte Insel von niedrigen bis großen Höhen wächst und oft reine Wälder bildet [39]. In einer vorläufigen Untersuchung wurde die Ethylacetatschicht von Methanolextrakten untersuchtP. taiwanensisNadeln zeigten eine signifikante Hemmung der Erzeugung von Superoxidanionen und der Elastasefreisetzung mit IC50 Werte von 0.8± {{0}}.2 und 1.0± 0.1 µg/ml (Tabelle S1). Daher wurden in der vorliegenden Studie die bioaktiven Bestandteile vonP. taiwanensisNadeln wurden untersucht und die gereinigten Verbindungen wurden auf ihre entzündungshemmende Wirkung hin bewertet Bioaktivität an einem zellulären Neutrophilenmodell. Darüber hinaus sind die Isolate ausP. taiwanensisNadeln mit entzündungshemmender Bioaktivität wurden einem Docking-Computing unterzogen undauf ihre Wechselwirkung mit dem Ghrelin-Rezeptor untersucht.

2. Materialien und Methoden

2.1. Allgemeine experimentelle Verfahren

Ultraviolett (UV)-Spektren wurden mit einem Hitachi U-2001 UV/V-Spektrometer erhalten. DerInfrarotspektren (IR) wurden mit einem Jasco FT/IR-4100-Spektrophotometer untersucht.1H-, 13C-, und 2D-Kernspinresonanzspektren (NMR) wurden auf einem Bruker AV-400 aufgezeichnet.NMR-Spektrometer. Chemische Verschiebungen sind in dargestelltδ Werte (ppm) mit Tetramethylsilanals interner Standard. DerδH UndδC Werte galten für die chemischen Verschiebungen der Signale,bzw. Hochauflösende Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (HR-ESI-MS) wardurchgeführt mit einem JEOL JMS-700-Spektrometer (im Negativionenmodus betrieben).

2.2. Pflanzenmaterial

Die Nadeln vonP. taiwanensiswurden in Puli, Nantou, Taiwan gesammelt und identifiziertvon Prof. Sheng-Yang Wang (Abteilung für Forstwirtschaft, Nationale Chung-Hsing-Universität,Taichung, Taiwan). Das Belegexemplar (PCKuo_2016003) wurde in der Kräuterbar hinterlegtium der School of Pharmacy, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan.

2.3. Extraktion und Isolierung

2.4. Spektrale und physikalische Daten von 1–5

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -Dihydroxy-70 -(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-80 -yloxy]-2-Hydroxybenzoesäure (2)Farbloser Sirup; [ ]25 D plus 5,3 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmax(Protokollε) 284 (3.59), 253 (3,80) nm; ECD (c 3.51 × 10−4 M, MeOH)λmax(∆ε) 248 ( plus 1,33), 224 ( plus 1,03),214( plus 1,10) nm; IR (sauber)νmax3425, 2927, 1541, 1384, 1271 cm−1;1Hand13C-NMR; HRESIMSm/z 349.0936 ([M − H]− berechnet für C17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R)-12-Hydroxyagathinsäure (3)

Farbloses Pulver; MP: 263◦C (dez.); [ ]25 D plus 30,8 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmax(Protokollε) 225 (sh) (3,83) nm; IR (sauber)νmax3450, 2937, 1648, 1252 cm−1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) δ 0.63 (3H, s, CH3-20), 1,09 (1H, ddd,J = 13.6, 13.6, 3.6 Hz, H-3a), 1.21 (3H, s, CH3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,H-6b), 2,08 (3H, s, CH3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H, dd,J = 9.2, 2,8 Hz, H-12), 4,53 (1H, s, H-17a), 4,91 (1H, s, H-17b), 5,88 (1H, br s, H-14);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 13,5 (CH3-20), 14,9 (CH3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (CH3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (C-19); HRESIMSm/z 349.2024 ([M − H]− berechnet für C20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5-Isopropyl-3-oxocyclohex-1-en-1-carbonsäure (4)

Farbloser tafelförmiger Kristall; MP: 235◦C (dez.); [ ]25 D plus 28,6 (c 0.3, MeOH); UV (MeOH)λmax(Protokollε) 237 (sh) (3,40) nm; IR (sauber)νmax3456, 2925, 1635, 1395 cm-1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) 0,88 (3H, d,J = 6.8 Hz, CH3-9), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH3-10), 1.84 (1H, m, H-4a), 2,02 (1H, m, H-4b), 2,09 (1H, m, H-5), 2,31 (1H, hept,J = 6,8 Hz, H-8), 2,50 (1H, dddd,J = 19.2, 9.2, 4.8, 2.4 Hz, H-6a), 2.70 (1H, dddd,J = 19.2, 5.2, 5.2, 1.2 Hz, H-6b), 6.32 (1H, dd,J = 2.4, 1,2 Hz, H-2);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (C-6), 27,1 (C-8), 53,7 (C-5), 128,7 (C-2), 160,6 (C-1), 174,8 (C-7), 205,7 (C-3); HRESIMSm/z 181.0855 ([M − H]− berechnet für C10H13O3, 181.0865).

2.4.5. Styraxinolsäure (5)

Farbloser Sirup; UV (MeOH)λmax(Protokollε) 308 (2,89), 237 (sh) (3,37), 222 (sh) (3,70) nm;IR (sauber)νmax3421, 2926, 1572, 1395, 1268 cm-1;1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) 1,82 (2H, tt,J {{0}}.0, 6,8 Hz, H-8), 2,61 (2H, t,J {{0}}.0 Hz, H-7), 3.56 (2H, t,J = 6,8 Hz, H-9), 3,83 (3H, s, OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 7.31 (1H, d,J = 2.4 Hz, H-6);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ 32,7 (C-7), 35,6 (C-8), 56,6 (OCH3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (C-6), 131,9 (C-5), 149,2 (C-3), 150,7 (C-2), 176,2 (C-10); HRESIMSm/z 225.0767 ([M − H]−berechnet für C11H13O5, 225.0763).

2.5. Untersuchung der entzündungshemmenden Bioaktivität

2.5.1. Vorbereitung menschlicher Neutrophilen

Die Studie wurde mit Genehmigung des Institutional Review Board des Chang Gung Memorial Hospital (IRB-Nr. 201800369A3) durchgeführt. Blutproben wurden von gesunden menschlichen Spendern (20 bis 30 Jahre alt) entnommen und Neutrophile wurden gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen isoliert und gereinigt [40]. 

2.5.2. Erzeugung von Superoxid-Anionen

Messung Der Test zur Messung der Erzeugung von Superoxidanionen basierte auf der SOD-hemmbaren Reduktion von Ferricytochromc wie zuvor beschrieben [40].

2.5.3. Elastase-Freisetzungstest

Die Degranulation azurophiler Granula wurde durch Messung der Elastasefreisetzung wie zuvor beschrieben bestimmt [40]. 

2.5.4. Statistische Analyse Die Ergebnisse werden als Mittelwert ausgedrückt± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Berechnung von 50 Prozent Hemmkonzentrationen (IC50) wurde mit der Software PHARM/PCS v.4.2 durchgeführt. Statistische Vergleiche wurden zwischen Gruppen anhand der Schülerdaten durchgeführtt-prüfen. Werte vonp < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. Molekulare Docking-Studie

Derin silicoDie Evaluierung wurde mit der AutoDock Vina-Software durchgeführt [41]. Die Kristallstruktur des Ghrelin-Rezeptors wurde charakterisiert [42], und ein . Die PDB-Datei wurde von der Proteindatenbank heruntergeladen (PDB-ID: 6KO5). Die 3D-Strukturen der Liganden wurden im Programm Chem3D konstruiert. Es wurden die Wasserstoffergänzung, die Gasteiger-Ladungsmessung für Proteinatome und die Auswahl flexibler Torsionen für Liganden durchgeführt von AutodockTools (ADT Version 1.5.6). Die Größe des Gitters wurde auf 18,5 Å ausgelegt× 18.5 Å × 18,5 Å und ein Gitterzentrum in den Dimensionen (x, y bzw. z): 9,7, –19,2, 14,6 wurden bestimmt. Die Bindungsaffinitätsenergie wurde als Docking-Scores bereitgestellt und in kcal/mol angezeigt. Als beste Interaktion wurde nur die Pose mit der höchsten Punktzahl gewertet. Die Visualisierung der besten Docking-Interaktionen wurde im Biovia Discovery Studio-Client 2020 analysiert [43].