Antimelanogene Wirkung von ethanolischem Extrakt aus Sorghum Bicolor auf die IBMX-induzierte Melanogenese in B16/F10-Melanomzellen

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hye Ju Han, Seon Kyeong Park, Jin Yong Kang, Jong-Min Kim, Seul Ki Yoo und Ho Jin Heo

Abstrakt:Möglichkeit als Hautaufheller zu bewertenSorghum zweifarbig(S. bicolor), seineAntioxidansAktivität und antimelanogene Wirkung auf 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)-induzierteMelanogenesein B16/F10-Melanomzellen untersucht. Das Ergebnis des Gesamtphenolgehalts (TPC) zeigte, dass 60 Prozent Ethanolextrakt vonS. zweifarbig(ESB) hat die höchsten Gehalte als andere Ethanolextrakte.AntioxidansDie Aktivität wurde unter Verwendung von 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-diammoniumsalz (ABTS)/1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl bewertet (DPPH) Radikalfängeraktivitäten und Malondialdehyd (MDA) hemmende Wirkung. Diese Ergebnisse zeigten, dass ESB signifikant istAntioxidansAktivitäten. Die Hemmwirkung gegen Tyrosinase wurde auch unter Verwendung von L-Tyrosin (IC50-Wert=89,25 µg/ml) und 3,4--Dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA) als Substrate bewertet. Darüber hinaus hemmte die ESB-Behandlung die Melaninproduktion in IBMX-induzierten B16/F10-Melanomzellen wirksam. Um den Mechanismus der antimelanogenen Wirkung von ESB zu bestätigen, untersuchten wir Melanogenese-verwandte Proteine. ESB herunterreguliertMelanogenesedurch Verringerung der Expression von Mikrophthalmie-assoziiertem Transkriptionsfaktor (MITF), Tyrosinase und Tyrosinase-verwandtem Protein (TRP)-1. Schließlich wurden 9-Hydroxyoctadecadiensäure (9-HODE), 1,3-O-Dicaffeoylglycerol und Tricin als Hauptverbindungen von ESB mit dem Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Ionenmobilitätstrennungs-Quadrupol analysiert Flugzeit/Tandemmassenspektrometrie (UPLC-IMS-QTOF/MS2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ESB das physiologische Potenzial haben könnte, als Material zur Hautaufhellung verwendet zu werden.

Schlüsselwörter:Anti-Melanogenese; B16/F10-Melanomzelle; Hydroxyoctadecadiensäure;Sorghumbicolor; 3-Isobutyl-1-methylxanthin

Cistanche hemmt die Melaninbildung.

1. Einleitung

Melanin wird durch einen Prozess namens erzeugtMelanogeneseinnerhalb der intrazellulären Melanosomen von Melanozyten und die Produktion und Verteilung von Melanin bestimmen die Haut-, Augen- und Haarfarbe. Darüber hinaus spielt Melanin eine wichtige Rolle beim Schutz der Haut vor verschiedenen Molekülen und Reizen wie ultravioletter (UV) Strahlung, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), -Melanozyten-stimulierendem Hormon ( -MSH) und zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) erhebenden Wirkstoffen, einschließlich Forskolinand IBM X [1]. Insbesondere UV-Strahlung schädigt Hautzellen direkt und indirekt über die ROS-Erzeugung wie Hydroxylradikale, Superoxidanionen und Wasserstoffperoxid [2]. Das erzeugte ROS verursacht Einzel- und Doppelstrang-DNA-Brüche und greift wichtige zelluläre Strukturmoleküle wie Proteine ​​und Lipide an [2]. So Melanin uAntioxidansEnzyme wie Glutathionperoxidase, Superoxiddismutase und Katalase halten ein konstantes Niveau aufrecht, indem sie das produzierte ROS entfernen. Eine übermäßige ROS-Produktion als Ergebnis verschiedener Faktoren aktiviert jedoch die Melanogenese in der Haut, und die abnormale Melaninansammlung induziert negative Hyperpigmentierungseffekte, die Alters- oder Leberflecken, Flecken und Sommersprossen verursachen [3,4]. Gegenwärtig werden natürliche Verbindungen wie Kojisäure, Hydrochinon, Arbutin und Ascorbinsäure, die als Melaninsynthese-Inhibitoren bekannt sind, als Zusatzstoffe für Hautaufheller verwendet. Diese Inhaltsstoffe penetrieren jedoch nicht nur schlecht in die Haut, sondern verursachen bei Langzeitanwendung auch Zytotoxizität und Entzündungen [5]. In dieser Hinsicht ist es notwendig, ein nicht reizendes und wirksames Bleichmittel zu entwickeln, um die Hyperpigmentierung der menschlichen Haut zu behandeln, sowie dafür natürliche Ressourcenmaterialien zu untersuchen.

Menschliche Hautzellen erzeugen üblicherweise Melanin als Lichtschutzreaktion. Die Melanogenese ist ein komplexer Prozess, der über eine Vielzahl von Signalwegen reguliert wird, und alle Signale regulieren letztendlich MITF hoch. Da aktiviertes MITF die Expression der Tyrosinase-Genfamilie (Tyrosinase und TRPs) fördert,Melanogenesebeginnt ernsthaft [6]. Im Allgemeinen besteht der erste Schritt bei der Melanogenese darin, dass Tyrosinase die Oxidation von L-Tyrosin zu 3,4--Dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA) katalysiert und anschließend L-DOPA zu DOPA-Chinon oxidiert. Und dann wandelt TRP-2 DOPA-Chrom in 5,6-Dihydroxyindol-2-Carbonsäure (DHICA) oder 5,6-Dihydroxyindol (DHI) um. Schließlich werden DHICA und DHI durch TRP-1 oxidiert, was schließlich zur Melaninproduktion führt [6].

IBMX und andere Methylxanthine stimulieren die Melanogenese, indem sie die Phosphodiesterase hemmen und dadurch die cAMP-Spiegel erhöhen [7]. Durch IBMX aktiviertes cAMP phosphoryliert extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK) und Phosphoinositid-3--Kinasen/Proteinkinase B (PI3K/Akt)-Signalwege und führt letztendlich zur Aktivierung von MITF in Melanogeneseprozessen [7]. Daher kann die Herunterregulierung dieser Proteine ​​als wichtiger Faktor für die Anti-Whitening-Wirkung angesehen werden.

Sorghum zweifarbig(S. bicolor), die zur Familie der Poaceae gehört, gilt als wichtige Nutzpflanze in tropischen Regionen, darunter Afrika, Mittelamerika und ariden Regionen, und ist nach Weizen, Reis und Mais die viertwichtigste Getreidepflanze der Welt [8 ]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass S. bicolor für den Menschen vorteilhaft ist, da es sekundäre Pflanzenstoffe wie Phenolverbindungen, Tannine und Anthocyane enthält [9]. Diese sekundären Pflanzenstoffe haben aufgrund ihrer erhöhten Aufmerksamkeit erlangtAntioxidans, Anti-Fettleibigkeit, Anti-Diabetes und entzündungshemmende Wirkungen [10–14]. Während es verschiedene Forschungsergebnisse gibt, wurden noch keine Studien zur hautaufhellenden Wirkung von S. bicolor durchgeführt. Daher zielte die vorliegende Studie darauf ab, die antioxidative Aktivität und die anti-melanogene Wirkung von zu untersuchenS. zweifarbigund um ihre Auswirkungen auf IBMX-induzierte zu untersuchenMelanogenesein B16/F10-Melanomzellen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Chemikalien

Folin-Ciocalteu-Reagenz, L-DOPA, L-Tyrosin, L-Ascorbinsäure, Arbutin, Acarbose, Dimethylsulfoxid (DMSO), Rinderserumalbumin, -Glucosidase, Pilztyrosinase, Rinderserumalbumin,3-(4,{ {6}}Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) und IBMX wurden von Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) erworben. MITF (bsm-51339M) und Tyrosinase (bs-0819R) wurden von Bioss (Peking, China) gekauft. TRP-1 (sc-166857) und -Actin (sc-69879) wurden von Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA) bezogen. Sekundärantikörper (Anti-Kaninchen und Anti-Maus) wurden von Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) erhalten.

2.2. Probenvorbereitung

S. zweifarbig(2 0 g) wurde mit verschiedenen Ethanolkonzentrationen (0, 20, 40, 60, 80 und 95 Prozent; 1 l) bei 40 Grad für 2 h unter Verwendung eines Rückflusskühlers extrahiert. Die Extrakte wurden unter Verwendung von Filterpapier (Whatman International Limited, Kent, UK) filtriert und unter Verwendung eines Vakuumverdampfers (N-1000; EYELA Co., Tokio, Japan) konzentriert. Nachdem die Extrakte unter Verwendung eines Vakuum-Gefriertrockners (Il Shin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea) lyophilisiert worden waren, wurden die getrockneten Extrakte bis zur Verwendung bei -20 Grad gelagert.

2.3. Antioxidative Aktivität in vitro

2.3.1. Gesamtphenolgehalt (TPC)

Der Gesamtphenolgehalt wurde basierend auf dem Prinzip untersucht, dass das Folin-Ciocalteu-Reagenz unter alkalischen Bedingungen zu einem blauen Reaktionsprodukt reduziert wird. Eine Probe (1 ml), gemischt mit Folin-Ciocalteu-Reagenz und 7 % Natriumcarbonat. Die Mischung wurde für 2 h aktiviert und dann wurde die Extinktion bei 760 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan) gemessen. TPC wurde aus der Standardkurve von Gallussäure berechnet und die Ergebnisse wurden als mg GAE g–1 ausgedrückt.

2.3.2. Radikalfänger-Aktivität

ABTS-Radikalkationenlösung wurde durch Mischen von 2,45 mM Kaliumpersulfat und 7 mMABTS mit 10{{10}} mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4), der 150 mM enthielt, hergestellt und zugelassen sie für 24 h bei Raumtemperatur reagieren lassen. Die ABTS-Lösung wurde dann mit destilliertem Wasser verdünnt, um eine Extinktion von 0,700 ± 0,020 bei 734 nm zu erhalten. Die Probe wurde mit 980 &mgr;l der ABTS-Lösung für 10 min bei 37 Grad reagieren gelassen und dann wurde die Extinktion bei 734 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan) gemessen. Die DPPH-Radikallösung wurde hergestellt durch Auflösen von 0,1 mM DPPH in 80 Prozent Methanol. Die DPPH-Lösung wurde auf eine Extinktion von 1,000 ± 0,020 bei 517 nm verdünnt. 50 &mgr;l der Probe wurden mit 1,45 ml der DPPH-Lösung gemischt und für 30 min im Dunkeln umgesetzt. Nach der Reaktion wurde die Mischung bei 517 nm bestimmt.

2.3.3. Hemmende Wirkung auf die Lipidperoxidation

Um die Hemmwirkung auf die Lipidperoxidation im Gehirngewebe zu messen, wurde die Thiobarbitursäure (TBA)-Reaktivsubstanz-Methode verwendet. Hirngewebe wurde in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) homogenisiert und 20 min bei 6000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde zu 0,1 mM L-Ascorbinsäure und 10 &mgr;M Eisensulfat bei 37 Grad für eine 1-stündige Inkubation gegeben. Als nächstes wurden 30 Prozent Trichloressigsäure und 1 Prozent TBA zu der Mischung gegeben, die dann in einem Wasserbad bei 80 Grad für 20 Minuten inkubiert wurde. Dann wurde der TBA-MDA-Komplex unter Verwendung eines Spektrophotometers (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan) bei 532 nm gemessen.

2.4. Tyrosinase-hemmende Wirkung

Die Tyrosinase-Hemmwirkung wurde unter Verwendung von L-Tyrosin als Substrat bestimmt. Eine Probe wurde auf eine 96-Well-Platte gegeben und mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, Tyrosinase und 0,1 mML-Tyrosinsubstrat gemischt, um bei 37 Grad zu reagieren. Nach der Inkubation wurde die Enzymaktivität unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA) bei 490 nm gemessen. Außerdem wurde L-DOPA als Substrat verwendet, um die Tyrosinase-Hemmaktivität zu messen. 67 mM Natriumphosphatpuffer, Tyrosinase und 10 mML-DOPA-Substrat wurden zu der Probe gegeben, um 10 Minuten lang bei 37 Grad zu reagieren. Die Tyrosinase-Aktivität wurde bei 415 nm gemessen.

Cistanche hemmt die Melaninbildung

2.5. -Glucosidase-hemmende Wirkung

Die -Glucosidase-Hemmwirkung wurde durch Mischen von 0,1 M Natriumphosphatpuffer und -Glucosidase bei 37 Grad für 10 Minuten gemessen. Nach der Aktivierung wurde die Mischung zu 5 mM 4-Nitrophenyl- -D-glucopyranosid in Puffer bei 37 Grad für 5 min gegeben, und dann wurde die Extinktion bei 405 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA).

2.6. Zelllebensfähigkeitsassay

Die Zytotoxizität der Probe wurde unter Verwendung eines MTT-Assays abgeschätzt. B16/F10-Melanomzellen wurden mit 1 × 104 Zellen/Vertiefung in einer 96--Vertiefungsplatte für 24 h kultiviert. Danach wurden die Proben mit Konzentrationen von 1, 2, 5 und 10 ug/ml behandelt. Die Proben wurden 48 h lang behandelt, danach wurden die Zellen 3 h lang mit 10 &mgr;g/ml MTT-Stammlösung behandelt. Schließlich wurde das Medium entfernt und DMSO wurde zugegeben, um das Formazan zu solubilisieren. Die Formazanmenge wurde unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA) bei 570 nm (Anregungswellenlänge) und 655 nm (Emissionswellenlänge) quantifiziert.

2.7. Messung des zellulären Melaningehalts

Um die Melaninmenge zu messen, wurden B16/F10-Melanomzellen in einer 24--Well-Platte bei einer Dichte von 4 × 104 Zellen/Well über 24 h kultiviert. Dann wurden die Zellen mit 100 mM IBMX und ESB oder positiver Kontrolle (Arbutin) für weitere 48 h behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen gewaschen und unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) geerntet. Die geernteten Zellen wurden dann bei 16,000 × g für 10 min zentrifugiert, und das erhaltene Pellet wurde mit 1 N Natriumhydroxid, enthaltend 10 % DMSO, bei 90 Grad für 20 min gelöst. Der Melaningehalt wurde bei 490 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA) gemessen.

2.8. Western-Blot-Analyse

Vorbehandelte B16/F10-Melanomzellen wurden mit PBS gewaschen und unter Verwendung von RIPA-Puffer, der 1 % Protease-Inhibitoren enthielt, auf Eis lysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden durch den Bradford-Proteinassay bestimmt, und die gleichen Proteine ​​wurden mit einem Laemmli-Puffer für 10 Minuten bei 95 Grad denaturiert. Die denaturierten Proteine ​​wurden durch 10-prozentige Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und dann auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen (Millipore, Billerica, MA, USA) übertragen. Als nächstes wurden die Membranen mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween20 (TBST) für 1 h blockiert und dann über Nacht bei 4 Grad mit primären Antikörpern umgesetzt. Die Membranen wurden mit den sekundären Antikörpern für 1 h umgesetzt und die Immunkomplexe wurden unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenz-Reagens (Bionote, Hwaseong, Korea) sichtbar gemacht. Die Bandenbilder wurden von Chemi-doc (iBright Imager, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) detektiert und analysiert.

2.9. UPLC-IMS-QTOF/MS2-Analyse

Die Hauptbestandteile in den 60-prozentigen ethanolischen Extrakten vonS. zweifarbigwurden durch UPLC-IMS QTOF/MS2 (Vion, Waters Corp., Milford, MA, USA) analysiert. Die chromatographische Trennung wurde unter Verwendung einer Acquity UPLC BEH C18-Säule (2,1 × 10{{10}} mm, 1,7 µm Partikelgröße; Waters Corp.) bei einer Flussrate von 0,35 ml/min durchgeführt. Die mobilen Phasen bestanden aus Lösungsmittel A (0,1 % Ameisensäure in destilliertem Wasser) und B (Acetonitril), und die Analysebedingungen umfassten den folgenden Zeitgradienten: 1 % B bei 0–1 min, 1–100 % B bei 1–7 min, 100 % B bei 7–8 min, 100–1 % B bei 8–8,2 min, 1 % B bei 8,2–10 min. Die Massenspektrometrie wurde im Elektrospray-Ionisations(ESI)-Negativmodus unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Quellentemperatur 100°C; Temperatur der Desolvatisierungsleitung 400 °C; Rampenkollisionsenergie, 10–30 V; Kapillarspannung 2,5 kV. Phenolische Verbindungen wurden durch einen vollständigen Scan im Bereich von m/z 50 bis 1500 nachgewiesen.

2.10. Statistische Analyse

Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Der statistische Unterschied zwischen den Gruppen wurde durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung von Duncans neuem Mehrfachbereichstest (p < 0,05)="" mit="" sas-softwareversion="" 9.4="" (sas="" institute,="" cary,="" nc,="" usa)="" bestimmt.="" .und="" die="" wechselbeziehung="" zwischen="">AntioxidansWirkungen (ABTS/DPPH-Radikalfängeraktivität und MDA-Hemmwirkung) und die Hemmwirkung vonMelanogenese-vermittelte Enzyme (Tyrosinase und -Glucosidase) wurde mittels Pearson-Korrelationsanalyse ausgewertet.

3. Ergebnisse

3.1. Gesamtphenolgehalt

Zum Vergleich dieAntioxidansAktivität jedes ethanolischen Extrakts ausS. zweifarbigwurde TPC untersucht. Wie in Fig. 1 gezeigt, waren TPC unter den ethanolischen Extrakten unterschiedlich; der 60-prozentige ethanolische Extrakt (150,08 ± 1,13 mg GAE/g) war signifikant höher als die anderen Extraktionen (0 Prozent; 70,83 ± 1,18, 20 Prozent; 100,42 ± 0,72, 40 Prozent). , 114,67 ± 1,46, 80 Prozent, 118,33 ± 3,17 und 95 Prozent, 73,67 ± 1,46 mg GAE/g). Daher wurde der 60-prozentige ethanolische Extrakt für weitere experimentelle Analysen verwendet.

3.2. Radikalfänger-Aktivität

DasAntioxidansAktivität des 60-prozentigen ethanolischen Extrakts ausS. zweifarbig(ESB) wurde mit dem ABTS/DPPH-Assay und dem MDA-Assay gemessen, und die Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. Die ABTS-Radikalfängeraktivität von ESB betrug 97,98 Prozent bei einer Konzentration von 1000 ug/ml und Vitamin C (99,82 Prozent) , das als positive Kontrolle verwendet wird und auch eine ähnliche Radikalfängeraktivität bei der gleichen Konzentration aufwies (Abbildung 2A). Und ESB zeigte eine 50-prozentige Hemmwirkung (IC50-Wert) des ABTS-Radikals bei einer Konzentration von 409,71 ug/ml. Wie in Abbildung 2B gezeigt, betrug die DPPH-Radikalfängeraktivität von ESB 79,44 Prozent bei einer Konzentration von 1000 ug/ml, und der IC50-Wert wurde mit 612,53 ug/ml angegeben. Die hemmende Wirkung der MDA-Produktion von ESB zeigte eine hemmende Wirkung von 89,54 Prozent bei einer Konzentration von 50 ug/ml und zeigte eine höhere hemmende Wirkung als das Catechin (71,03 Prozent), das die Positivkontrolle darstellt, bei der gleichen Konzentration (Abbildung 2C). Außerdem wurde der IC50-Wert von MDA bei Konzentrationen von ESB von 16,56 ug/ml beobachtet.

3.3. Hemmwirkung von Melanogenese-vermittelten Enzymen

Die hemmende Wirkung vonMelanogenese-vermittelte Enzyme wurde unter Verwendung von Tyrosinase und -Glucosidase bewertet (Fig. 3). Um die inhibitorische Aktivität von Tyrosinase gegen die Melaninsynthese zu messen, wurden Experimente mit L-Tyrosin und L-DOPA als Substrat unter zellfreien Bedingungen durchgeführt. Als Ergebnis betrug der IC50-Wert 89,25 µg/ml, wenn L -Tyrosin wurde als Substrat verwendet (Fig. 3A), aber L-DOPA konnte nicht, dass mehr als 5 0 Prozent der inhibitorischen Wirkung beobachtet wurden (Fig. 3B). Zu diesem Zeitpunkt betrug der IC50-Wert der Positivkontrolle (Arbutin) für L-Tyrosin 74,35 µg/ml, was höher war als bei ESB. Es wurde gefunden, dass ESB eine bessere Hemmwirkung auf Tyrosinase unter Verwendung von L-Tyrosin hat als unter Verwendung von L-DOPA als Substrat. Daher wird basierend auf den Ergebnissen des Assays unter Verwendung von zwei Substraten angenommen, dass die Tyrosinase-hemmende Wirkung von ESB eher mit der Oxidation von L-Tyrosin zu L-DOPA als mit der Oxidation von L-DOPA zu DOPA-Chinon bei der Melanogenese zusammenhängt. Tyrosinase-Hemmwirkung unter Verwendung von L-DOPA als Substrat und Radikalfängeraktivität (ABTS; 0.943, p < 0,05,="" dpph;="" 0,952,="" p="">< 0,05)="" zeigten="" die="" positiven="" starken="" korrelationen="" in="" tabelle="">

Zur Messung der Hemmwirkung derMelanogenese-vermittelten Enzyms wurde die inhibitorische Aktivität gegen -Glucosidase von ESB gemessen. Wie in Abbildung 3C gezeigt, hemmte ESB -Glucosidase um 33,72 Prozent bei einer Konzentration von 200 µg/ml. Und der IC50 von ESB betrug 46,29 µg/ml, was etwa fünfmal höher ist als der von Acarbose (216,05 µg/ml). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass ESB eine bessere Hemmwirkung auf β-Glucosidase aufweist als Acarbose als Positivkontrolle. Die And-Glucosidase-Hemmwirkung zeigte starke positive Korrelationen mit der MDA-Hemmwirkung (0,966, p < 0,05)="" in="" tabelle="">

3.4. Zelllebensfähigkeit und zelluläre Melaninsynthese

Um die Zytotoxizität von ESB zu bestätigen, wurden B16/F10-Melanomzellen 24 Stunden lang mit ESB in Konzentrationen von 1, 2, 5, 10 und 20 µg/ml behandelt. Die Ergebnisse zeigten, dass ESB die Zelllebensfähigkeit bei den angegebenen Konzentrationen im Vergleich zur Kontrolle nicht beeinflusste (Abbildung 4A). Daher wurden Experimente durchgeführt, indem Konzentrationen von 2, 5 und 10 &mgr;g/ml ausgewählt wurden. Anschließend wurden B16/F10-Melanomzellen mit IBMX behandelt, um die Wirkung von ESB auf die Melaninproduktion zu analysieren. Wie in Abbildung 4B gezeigt, stieg der Melaningehalt bei Behandlung mit IBMX auf 316,85 Prozent. Andererseits zeigte die mit ESB behandelte Gruppe (108,60 Prozent) bei einer Konzentration von 10 µg/ml einen signifikant verringerten Melaningehalt im Vergleich zur mit IBMX behandelten Gruppe und einen ähnlichen Melaningehalt im Vergleich zur Arbutingruppe (101,79 Prozent) als Positivkontrolle.

3.5. Melanogeneseweg in B16/F10-Melanomzellen

Melanogeneseist ein wesentlicher Prozess zum Schutz der menschlichen Haut vor äußeren Reizen und wird durch verschiedene Mechanismen reguliert. In dieser Studie haben wir das Expressionsniveau von Molekülen gemessen, die die Melanogenese regulieren, um den potenziellen Hemmmechanismus von ESB auf die durch IBMX induzierte Melaninproduktion in B16/F10-Melanomzellen zu bestätigen (Abbildung 5). Die Ergebnisse zeigten, dass ESB die IBMX-induzierte MITF-Expression effektiv verringerte (Abbildung 5A, B). Somit wurde die Expression von Tyrosinase (Abbildung 5A, C) und TRP-1 (Abbildung 5A, D) durch reduziertes MITF mit ESB-Behandlung herunterreguliert. Als Ergebnis regulierte die ESB-Behandlung die Expression verwandter Proteine ​​in IBMX-induzierter Melanogenese in B16/F10-Melanomzellen herunter.

3.6. UPLC-IMS-QTOF/MS2-Analyse

Ein Profil der Hauptverbindungen von ESB wurde durch LC/MS in einem Bereich von m/z 50–1500 gescannt, und die Basispeak-Chromatogramme sind in Abbildung 6 gezeigt. Eine weitere Identifizierung und Charakterisierung der Verbindungen wurde im Vergleich mit Literaturdaten durchgeführt MS2-Fragmentierungsdaten (Tabelle 2). Basierend auf den Fragmenten in der früheren Literatur war Peak 2 1-O-Caffeoylglycerin (m/z 253,07, 179,03, 161,02 und 135,04) [15]; Peak 3, Dicaffeoylglyceride (m/z 415,10, 253,07, 179,03 und 135,04) [16]; Peak 4, 1,3-O-Dicaffeoylglycerin (m/z 415,10, 253,07, 179,03, 161,02 und 135,04) [16];Peak 5, p-Cumaroyl-caffeoylglycerin (m/z 399,10, 253,07, 179,03, 161,02 und 135.04) [17]; Peak 6, Feruloyl-Caffeoylglycerol (m/z 429,12, 253,07, 193,05, 161,02 und 134,03) [18]; Peak 7, Tricin (m/z 329,23, 314,04, 299,01 und 271,02) [19]; und Peak 9, 9-Hydroxyoctadecadiensäure (9-HODE) (m/z 295,22, 277,21 bzw. 171,10) [20]. Darunter wurden 1,3-O-Dicaffeoylglycerol (Abbildung 6B), Tricin (Abbildung 6C) und 9-HODE (Abbildung 6D) als Hauptverbindungen identifiziert.

Wirkungen von Cistanche:Antioxidation

4. Diskussion

MelanogeneseEs wird berichtet, dass es durch erhöhten oxidativen Stress durch äußere Reize verursacht wird. Oxidativer Stress verursacht die Oxidation von DNA und Proteinen, Lipidperoxidation und erhöhte ungesättigte Fettsäuren. Dieser Stress führt auch zu einer unnötigen Steigerung der Melaninsynthese in Melanozyten auf der Haut. Daher kann übermäßig erzeugtes Melanin eine Pigmentierung verursachen und zu Hautkrebs führen. IBMX stimuliert die Melanogenese, indem es die Phosphodiesterase hemmt und dadurch den cAMP-Spiegel erhöht [7]. Wenn der cAMP-Spiegel in den Zellen steigt, bewirkt es eine Aktivierung der ERK- und PI3K/Akt-Signalwege, die die Bildung von Proteinen fördern, die mit der Melanogenese assoziiert sind. Daher untersuchten wir die aufhellende Wirkung von ESB auf die IBMX-induzierte Melanogenese in B16/F10-Melanomzellen.

Phenolische Verbindungen als sekundäre Pflanzenstoffe haben die Eigenschaft, bei der Reaktion mit Radikalen durch eine Resonanzstruktur stabilisiert zu werden [21]. Auch phenolische Verbindungen wirken als wichtige Faktoren für die antioxidative Aktivität, wie ABTS/DPPH-Radikalfängeraktivität, und wirken als Inhibitoren der Pigmentbildung, da sie eine chemische Struktur wie die von L-Tyrosin haben [22,23]. Ein ABTS/DPPH-Assay ist die gebräuchlichste und einfachste Methode zur Schätzung in vitroAntioxidansAktivität. In dieser Studie hat ESB eine hohe TPC- (Abbildung 1) und ABTS/DPPH-Radikalfängeraktivität gezeigt (Abbildung 2A, B). Insbesondere war ESB in der ABTS-Radikalfängeraktivität höher als die DPPH-Radikalfängeraktivität. Der DPPH-Assay wird verwendet, um die Radikalfänger-Aktivität hydrophober Verbindungen zu messen, während der ABTS-Assay die Messung der Radikalfänger-Aktivität sowohl gegen hydrophobe als auch gegen hydrophile Verbindungen ermöglicht [24]. Daher wurde bestätigt, dass die Radikalfängeraktivität von ESB durch die hydrophile Verbindung stärker beeinflusst wurde.

Die Exposition gegenüber UV-Strahlung verursacht die Produktion von ROS und hat direkte und indirekte Auswirkungen auf die Haut. Insbesondere induziert ROS die Lipidperoxidation, indem es ungesättigte Fettsäuren angreift, die Bestandteile von Zellmembranen sind [2]. Die Akkumulation von Lipidperoxiden führt zur Zerstörung des Antioxidanssystems der Haut, was zu Pigmentierung, Entzündung und Alterung führt [25]. In dieser Studie zeigte ESB eine hervorragende Hemmung der Lipidperoxidation (Abbildung 2C). Es wurde berichtet, dass die in natürlichen Pflanzen enthaltenen phenolischen Verbindungen mit Radikalfänger-Aktivität in Verbindung gebracht werden [26]. Auch Maresca et al. [27] berichteten, dass die Entfernung von ROS mit Antioxidantien bei der Hemmung der Melaninbiosynthese wirksam ist. Eine kürzlich durchgeführte Studie berichtete, dass die Ethylacetat- und Aglykonfraktionen von Dendropanax morbifera-Blättern als Hautzellschutzmittel und natürliche Antioxidantien wirken können, indem sie HaCaT-Zellen vor oxidativem Stress schützen [28]. Darüber hinaus zeigte die Behandlung mit den gleichen Fraktionen eine bessere anti-melanogene Wirkung als Arbutin, das als positive Kontrolle verwendet wurde, gegen -MSH-induzierte übermäßige Melaninbildung in B16/F10-Melanomzellen [28].

Mehrere Mechanismen sind damit verbundenMelanogenese, und das gemeinsame Ziel von Hautaufhellungsmitteln ist die Regulierung von Tyrosinase, einem wichtigen Enzym bei der Melanogenese. Tyrosinase, ein kupferhaltiges Enzym, katalysiert zwei Reaktionen auf diesem Weg: die Hydroxylierung von L-Tyrosin zu L-DOPA und die Oxidation von L-DOPA zu DOPA-Chinon [6]. Wenn sie großen Mengen an UV oder ROS ausgesetzt werden, wird die Aktivität der Tyrosinase erhöht und die Melaninsynthese wird ebenfalls erhöht. Daher zeigten die Ergebnisse der Messung der Hemmwirkung von Tyrosinase in Bezug auf die Melaninsynthese, dass ESB unter Verwendung von L-Tyrosin eine bessere Hemmwirkung auf Tyrosinase hatte als unter Verwendung von L-DOPA als Substrat (Abbildung 3A, B). Eine kürzlich durchgeführte Studie berichtete über die Korrelation zwischen TPC und Tyrosinase-Hemmung, da phenolische Verbindungen eine ähnliche chemische Struktur wie L-Tyrosin, ein Substrat von Tyrosinase, haben. Laut Choi et al. [29] wurde beobachtet, dass die Effizienz der Aktivität zum Abfangen freier Radikale und die tyrosinasehemmende Wirkung proportional zur Fermentationszeit von Cheonggukjang zunahmen, was darauf zurückzuführen war, dass die Menge an TPC mit der Fermentationszeit zunahm. Im & Lee [30] beobachteten, dass die Ethylacetatfraktion von 75 Prozent ethanolischem Extrakt aus Taraxacum core num eine reichliche TPC- und antioxidative Aktivität aufwies und die Tyrosinase-Hemmwirkung anderen Fraktionen (Hexan, Chloroform, Butanol und wässrig) überlegen war.

Tyrosinase, eines der Glykoproteine, wird glykosyliert, wenn Polypeptidketten in das endoplasmatische Retikulum translozieren. Verschiedene Enzyme sind an diesem Prozess beteiligt, und unter ihnen könnte die Hemmung von -Glucosidase die Faltung von Tyrosinase hemmen, um eine inaktive Struktur ohne Kupfer zu bilden. Als Ergebnis kann Tyrosinase nicht zum Melanosom transportiert werden und hemmt die Melaninproduktion. Das vorhandene Polyphenol in Pflanzen ist nicht nur in der Lage, oxidativen Stress zu reduzieren, sondern hemmt auch Kohlenhydrat-hydrolysierende Enzyme wie -Glucosidase durch Bindung an Proteine ​​[31]. Eine frühere Studie zeigte, dass B16/F10-Melanomzellen in Anwesenheit von Glykosylierungsinhibitoren zu einer Reduktion der Melanogenese führen, indem sie den Gesamtgehalt an Tyrosinase verringern [32]. Und Choi et al. [33] berichteten, dass Desoxynojirimycin, einer der -Glucosidase-Inhibitoren, die Glykosylierung von Tyrosinase blockierte und die Tyrosinase-Migration zu Melanosomen hemmte. Andoet al. [34] haben gezeigt, dass es möglich ist, die Melaninsynthese in Melanomzellen zu hemmen, indem die Glykosylierung von Tyrosinase durch -Glucosidase-Inhibitoren wie Glutathion, Ferritin und Geldanamycin kontrolliert wird. Kimet al. [35] berichteten über die guten Korrelationen für Bienenpollen als NaturproduktAntioxidanszwischen TPC und tyrosinasehemmender Wirkung ({{0}}.973,p < 0.05),="" und="" auch="" tpc="" ergab="" eine="" positive="" korrelation="" mit="" der="" radikalfängeraktivität="" von="" dpph="" (0,897,="" p="">< 0,05).="" und="" die="" ergebnisse="" deuten="" darauf="" hin,="" dass="" polyphenole="" als="" natürliche="" antioxidantien="" aufgrund="" ihrer="" hervorragenden="" antioxidativen="" aktivität="" möglicherweise="" für="" die="" hautaufhellung="" wirksam="" sein="" könnten.="" in="" unserer="" studie="" wurde="" gezeigt,="" dass="" die="" antioxidative="" wirkung="" von="" esb="" im="" prozess="" der="" hemmung="" der="" wirkung="" von="" tyrosinase="" stark="" mit="" der="" hemmung="" der="" oxidation="" von="" l-dopa="" zu="" dopa-chinon="" und="" der="" glykosylierung="" von="" tyrosinase="" korreliert="" (tabelle="" 1).="" aus="" diesem="" grund="" ist="" das="" antioxidans="" die="" wirkung="" von="" esb="" wirkt="" sich="" auf="" die="" hautaufhellung="" aus,="" indem="" es="" die="" hemmung="">Melanogenese-vermittelte Enzyme.

natürliches Antioxidans: Cistanche tubulosa

Der PKA-Signalweg ist der Hauptprozess, der an der Melanogenese beteiligt ist, und dieser wird durch IBMX aktiviert, das ein cAMP-erhöhendes Mittel ist. Der PKA-Signalweg kann Transkriptionsfaktoren wie MITF und cAMP-responsive element-binding protein regulieren, die an der Expression von beteiligt sindMelanogeneseRegulatoren wie Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2. Folglich erhöht die IBMX-Behandlung die Expression von MITF und der Tyrosinase-Genfamilie (Tyrosinase und TRP-1) durch cAMP-Aktivierung [7]. Parket al. [36] zeigten, dass die Menge an Melaninsynthese aus ethanolischem PapenfusiellaCuomo-Extrakt (65,17 ± 13,40 Prozent) bei einer Konzentration von 40 µg/ml ähnlich war wie bei Kojisäure (72,30 ± 3,92 Prozent) als Positivkontrolle, und berichteten, dass sie Potenzial zeigte als natürliches Bleichmittel. In dieser Studie zeigte ESB eine wirksame Hemmwirkung auf die Melaninsynthese ähnlich der der positiven Kontrolle bei niedrigen Konzentrationen (Fig. 4). Danach wurde zur Beurteilung der detaillierten antimelanogenen Wirkung von ESB eine Western-Blot-Analyse an Melanogenese-vermitteltem Protein unter Verwendung von B16/F10-Melanomzellen durchgeführt.

Akt, das an verschiedenen Mechanismen beteiligt ist, spielt eine Schlüsselrolle bei mehreren zellulären Prozessen wie Apoptose, Glukose und Hautstoffwechsel. Insbesondere die Erhöhung von cAMP durch IBMX-Behandlung verringert die Akt-Phosphorylierung und ihre Aktivierung. Außerdem induziert inaktiviertes Akt die Aktivierung von GSK-3, was bedeutet, dass keine Phosphorylierung erreicht wird, d. h. das Niveau von p-GSK-3 wird verringert [7]. Laut früherer Literatur senkt der oberirdische Teil von Pueraria thunbergia MITF durch Aktivierung des Akt/GSK-3-Signalwegs in B16/F10-Melanomzellen [37]. Auch Huang et al. [38] zeigten, dass [6]-Schule die p-Akt-Expression förderte und die Melanogenese-Signalübertragung in B16/F10-Melanomzellen hemmte. Aktiviertes GSK-3 reguliert die Tyrosinase-Genfamilie hoch, indem es Ser289 von MITF phosphoryliert und folglich die Melanogenese fördert. MITF ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der an einen Tyrosinase-Gen-Promotor bindet und anschließend die Expression von Enzymen erhöht, die mit der Proliferation von Melanozyten in Zusammenhang stehenMelanogenese[7]. Wenn die Expression von Tyrosinase durch MITF gefördert wird, führt dies anschließend zu einem Anstieg der TRP-1- und TRP-2-Spiegel, und als Ergebnis produzieren diese melanogenen Enzyme Melanin [6]. Oxidativer Stress durch UV-Licht stimuliert die Melaninpigmentierung in der Haut. Daher ist die Radikalfängeraktivität von Radikalen oder ROS wirksam, um die Melaninproduktion zu unterdrücken, und Polyphenole mit antioxidativer Aktivität können hervorragende aufhellende Wirkungen haben [38]. Choiet al. [39] zeigten, dass koreanische Bambusstämme (Phyllostachys nigra Varietät Henosis) PKA/CREB-vermitteltes MITF durch Abfangen von ABTS/DPPH-Radikalen herunterregulieren. Und ein 70-prozentiger ethanolischer Extrakt von Nelumbo nucifera G. Leaf hemmte die Expression von MITF, Tyrosinase und TRPs mit antioxidativen Aktivitäten wie der Fähigkeit zur Elektronenspende und der Hemmung der Xanthinoxidase [40]. In diesem Experiment wurde gezeigt, dass die ESB-Behandlung die Expression der MITF- und Tyrosinase-Genfamilie (Tyrosinase und TRP-1) verringerte, die die Oxidation von DHICA zu DHI im Melanogeneseweg fördern (Abbildung 5). Basierend auf diesen Ergebnissen wurde gezeigt, dass ESB die IBMX-vermittelte Melanogenese basierend auf seiner Überlegenheit herunterreguliertAntioxidansAuswirkungen.

Basierend auf der früheren Literatur wurden die wichtigsten phenolischen Verbindungen in ESB identifiziert, nämlich 1,3-O-di-caffeoylglycerol (Abbildung 6B), Tricin (Abbildung 6C) und 9-HODE (Abbildung 6D) [16 ,19,20]. Unter ihnen ist 9-HODE, die häufigste Verbindung in ESB, einer der Metaboliten von Linolsäure und zeigt eine aufhellende Wirkung auf gereizte Haut durch Hemmung der Tyrosinase [41]. Außerdem soll 9-HODE im Gegensatz zu anderen aliphatischen Verbindungen in allen Oxidationsexperimenten stabil sein und eine aufhellende Wirkung auf ROS-Schäden haben [41]. Tricin (5,7-dihydroxy- 2-(4-hydroxy-3,5-di-methoxyphenyl)-4H-chromen{{24 }}one) ist seit langem für seine gesundheitsfördernden Wirkungen wie antioxidative, antivirale und Antitumor-/Antikrebsaktivitäten bekannt [42–44]. Mu et al. [45] berichteten, dass Tricin im Vergleich zu Arbutin als Positivkontrolle eine bessere Hemmwirkung auf die Tyrosinaseaktivität aufwies. Darüber hinaus haben Meng et al. [46] berichteten, dass aus dem Methanolextrakt von junger grüner Gerste (Hordeum vulgare L.) isoliertes Tricin die Melaninbiosynthese und Tyrosinaseaktivität in B16/F10-Melanomzellen durch die Hydroxylgruppe an der C-4'-Position und Methoxygruppen an der hemmte C-3',5'-Positionen des Tricin-Skeletts. Phenylpropanoide wie 1-O-Caffeoylglycerol, Dicaffeoylglyceride und 1,3-O-Dicaffeoylglycerol sind organische Verbindungen, die von Pflanzen aus Phenylalanin und Tyrosin synthetisiert werden. Es wurde berichtet, dass Phenylpropanoid und ihre glykosylierten Formen starke Antioxidantien sind, entweder durch direktes Abfangen von ROS oder durch Wirkung als kettenbrechende Peroxyl-Radikalfänger [47].

p-Cumarinsäure, die eine ähnliche chemische Struktur wie L-Tyrosin hat, konkurriert mit L-Tyrosin um aktive Stellen auf Tyrosinase [48]. Es ist als starker Tyrosinase-Hemmer bekannt, und es wurde berichtet, dass seine Anti-Melanogenese-Wirkung stärker ist als bei strukturell ähnlichen Verbindungen wie Zimtsäure [48]. Außerdem haben An et al. [48] ​​berichteten, dass p-Cumarinsäure, ein Bestandteil von Sasa quelpaertensis Nakai, die Tyrosinaseaktivität unter Verwendung von L-DOPA als Substrat hemmte und die Melaninproduktion in B16/F10-Melanomzellen reduzierte. Daher kann davon ausgegangen werden, dass ESB durch p-Cumarsäure eine hervorragende aufhellende Wirkung hat. Darüber hinaus zeigten die MS-Spektren von 1-O-Caffeoylglycerol und 1-3-O-Dicaffeoylglycerol ähnliche Fragmentierungsmuster bei m/z 179, 161 und 135, und diese Fragmente wurden als Kaffeesäurerest angegeben. Sie haben ein ähnliches UV-Spektrum wie ein Kaffeesäurederivat mit einem λmax bei etwa 326 nm und werden daher als Kaffeesäurederivat angesehen [48]. Es wurde berichtet, dass Kaffeesäure, ein Derivat verschiedener Verbindungen, in vitro/in vivo ein starkes Antioxidans ist und die Tyrosinase-Aktivität reduziert undMelanogenesein B16/F10-Melanomzellen. Folglich könnte die antimelanogene Wirkung von ESB darauf zurückgeführt werdenAntioxidantienund hautaufhellende Substanzen wie aliphatische und phenolische Verbindungen.

Wirkungen von Cistanche: Antioxidation

5. Schlussfolgerungen

Die Möglichkeit als Hautaufheller zu bewertenSorghum zweifarbigDie antioxidativen und anti-melanogenen Wirkungen von ESB auf die IBMX-induzierte Melanogenese wurden in B16/F10-Melanomazellen untersucht. ESB ausgestellt signifikantAntioxidansAktivitäten in ABTS/DPPH-Radikalfängeraktivität und MDA-Hemmwirkung. Der ESB verhinderte den ersten SchrittMelanogenesedurch Hemmung von -Glucosidase und Tyrosinase unter Verwendung von L-Tyrosin und L-DOPA als Substrate. Die antimelanogene Wirkung von ESB auf IBMX-induziertMelanogenesewurden in B16/F10-Melanomzellen untersucht, und die Ergebnisse zeigten, dass ESB die IBMX-induzierte Melanogenese in B16/F10-Melanomzellen hemmte. Die Melaninakkumulation wurde durch Herunterregulierung der Expression von MITF und der Tyrosinase-Genfamilie (Tyrosinase und TRP-1) bei IBMX-induzierter Melanogenese gehemmt. Die Hauptverbindungen von ESB wurden als 1,3-O-di-caffeoylglycerol, Tricin und 9-HODE analysiert. Folglich zeigte sich ESB in vitroAntioxidansAktivität und eine antimelanogene Wirkung in B16/F10-Melanomzellen und könnte daher als Hautaufhellungsmittel auf dem Kosmetikmarkt verwendet werden.

AntioxidationCistanche-Tabletten